Получение трансгенных Xenopus laevis По рестрикции Интеграция опосредованного и ядерной трансплантации

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Это видео демонстрирует протокол метод для создания трансгенных

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Amaya, E., Kroll, K. Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation. J. Vis. Exp. (42), e2010, doi:10.3791/2010 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Стабильная интеграция продуктов клонированных генов в геноме Xenopus необходимо контролировать время и место выражения, чтобы выразить гены на более поздних стадиях эмбрионального развития, и определить, как усилители и промоутеров регулируют экспрессию генов в эмбрион. Протокол продемонстрировали здесь может быть использован для эффективного получения трансгенных Xenopus laevis эмбрионов. Этот подход включает в себя трансгенез трех частей: 1. Сперма ядер изолированы от взрослых X. laevis яичка обработкой лизолецитин, который permeabilizes спермы плазматической мембране. 2. Яйцо экстракт готовится низкой скорости центрифугирования, добавление кальция вызывает экстракт для перехода к интерфазе клеточного цикла, а также высокоскоростным центрифугированием, чтобы изолировать межфазной цитозоле. 3. Ядерной трансплантации: ядер и экстракта в сочетании с линеаризованной плазмидой ДНК, чтобы вводить в качестве трансгенов и небольшое количество фермента рестрикции. Во время короткой реакции, яичный экстракт частично decondenses спермы хроматина и рестрикции генерирует хромосомных разрывов, которые способствуют рекомбинации трансгенов в геном. Лечение спермы ядер затем пересаживают в неоплодотворенные яйца. Интеграция трансгенов обычно происходит до первого эмбрионального расщепления, что в результате эмбрионы не являются химерные. Эти эмбрионы могут быть проанализированы без необходимости разводить для следующего поколения, что позволяет для эффективного и быстрого поколение трансгенных эмбрионов для анализа промоутер и функции гена. Взрослый X. laevis в результате этой процедуры также распространяются через трансгенов зародышевой линии и может быть использован для создания линии трансгенных животных для различных целей.

Protocol

Модифицированные версии этой трансгенез подход изначально были описаны в 1 и 2.

А. спермы ядер подготовки

Этот метод ядер препарата адаптирована из Мюррей 3, но ингибиторы протеазы, были исключены, поскольку они мешают последующее развитие яиц пересаженных со спермой ядер. Аликвоты заморожены при температуре -80 ° С и может быть использована для трансплантации в течение примерно 6 месяцев.

Все решения должны быть подготовлены и помещают на лед до начала подготовки.

  1. Анестезию 1-2 взрослых мужчин X. laevis погружением в Tricaine не менее 20 мин, а затем по pithing; удалить яички.
  2. Ролл яички на бумажное полотенце, чтобы удалить кровь, кровеносные сосуды и жира, вымыть их кратко в 60 мм чашки Петри содержащие 1XMMR, и удалить все дополнительные куски жира в организме. Будьте осторожны, не прокол яичек, так как это освобождает спермы.
  3. Передача яичек сухие 60-мм чашку Петри и вымачивать яички щипцами, пока Есть никаких видимых куски. Мацерация должно быть сделано так тщательно, как можно получать высокие урожаи ядер.
  4. Добавить 2mLs холодного ядерного буфера подготовки (НПБ; 1X со склада), чтобы вымачивать и осторожно пипеткой вверх и вниз.
  5. Squirt вымачивать через около 4 толщины марлю на воронку, сбор в 15 мл трубки (например, Сокол 2059); промыть посуду с 8mLs НПБ и положить это полоскание через марлю, собирая ее в трубу. С сжать руки в перчатках марлю для сбора оставшейся жидкости в трубе.
  6. Гранул спермы при 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин. при 4 ° С в роторе размахивая ведром (например, 1480g в Sorvall HB-4 ротора или эквивалент) с соответствующими адаптерами трубки. Декантировать супернатант, добавить 8 мл НПБ этой трубки и пипетки вверх и вниз с 10 мл пипетки для ресуспендирования гранул; спином вниз снова, как и выше, и перелить супернатант. Уравновешиваются 1 мл НПБ до комнатной температуры во время вращения.
  7. Ресуспендируют осадок в 1 мл комнатной температуре НПБ использованием 1 мл pipetteman отзыв, добавить 50 мкл 10mg/mL свежеприготовленные лизолецитин, аккуратно перемешать и инкубировать 5 мин. при комнатной температуре.
  8. Добавьте 10 мл холодного 1XNPB +3% BSA в трубке, чтобы остановить лизолецитина реакцию, аккуратно перемешать и со спином вниз в течение 10 мин при 3000 оборотов в минуту в Бакет ротор. Декантировать супернатант. Лизолецитина обработанных гранул должна выглядеть немного более прозрачным (менее непрозрачная белая), чем это было до лизолецитина лечения.
  9. Декантировать супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл холодной НПБ 0,3% БСА, осторожно смешать с 10 мл пипетки и со спином вниз в течение 10 мин при 3000 оборотов в минуту и ​​выше.
  10. Декантировать супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл спермы буфера хранения и передачи по 1,5 мл трубки. Это теперь ваше ядер акций. Магазин на льду во время проверки выхода ядер.
  11. Чтобы проверить, выход ядра, место 98 мкл спермы буфером для разведения (SDB), 1 мкл ядерных запасов и 1 мкл 1:100, разведение акции Хехст в 1,5 мл трубки Эппендорф. Смешайте семенного материала очень хорошо использовании бритвы подстриженные (или большого открытия) пипетки непосредственно перед удалением 1 мкл. Смешайте разбавленный SDB / Hoechst / ядер очень хорошо, и позволяют небольшим количеством течь в палату улучшенной hemacytometer Нойбауэр под действием капиллярных сил. Граф ядер в квадрате hemacytometer под соединение микроскопа. С одним мужчиной, вы должны получить насчитывает, по крайней мере 100-200 (X10 4 клеток / мл) в течение этого 1:100 разбавление состава для неразбавленного концентрация запасов 1-2-10 5 кл / мкл. Если ваши акции менее концентрированный, не говоря ядер урегулировать в течение нескольких часов, удалить некоторые из надосадочной и пересчета голосов. Оставьте ядер при 4 ° С в течение ночи, чтобы проникнуть глицерина для улучшения криоконсервации, а затем смесь семенного материала и с большим отверстием кончика пипетки, готовить 20 мкл аликвоты, и заморозить в жидком азоте.

В. Подготовка Высокая скорость извлечения

Этот метод адаптирован из Мюррей 3 и производит межфазной цитозольного экстракта, что будет способствовать опухоль и частичная хроматина деконденсации добавил спермы ядер. Извлечение могут быть заморожены в небольших аликвот при -80 ° С и размораживать перед использованием.

  1. 3-5 дней до инъекции HCG, премьер 8-12 взрослой самки X. laevis путем введения 50 ЕД в PMSG в спинной мешок лимфы. Вечером перед экстракт подготовки, придать каждой лягушки с 500 единиц HCG и место 2 лягушек / контейнер на 2 1XMMR литров. Так как одна лягушка с лизирующего или активации яйца может скомпрометировать экстракт подготовки, целесообразно разделить лягушек на пары для овуляции.
  2. Следующим утром, готовить и холод все решения перед началом приготовления. Аккуратно, вручную исключить яйца из каждой лягушки в большом бeakers содержащие 1X MMR. Экран яиц из каждого контейнера и пропустить какой-либо партии яиц с признаками пятнистость, лизирующего или активации (визуализируется сокращение пигментации в животном полушарии) от процедуры. Сбор яиц с непрерывной даже пигментацией. Хорошие яйца также могут быть собраны из 1X MMR в лягушку ведра. Общий объем яйца должен быть> 100 мл из 8-12 самок.
  3. Де-желе яйца. Чтобы сделать это, удалить как можно больше MMR насколько это возможно, добавить небольшое количество цистеина решение, и водоворот яйца. Замените свежим раствором цистеина несколько раз в течение де-jellying. Де-желе каждой партии яиц отдельно и отказаться от партий с поломкой или яйцо активации. Комбинат остальные яйца.
  4. Мойте яйца четыре раза в ~ 35 мл экстракта буфер (ВБ), а затем два раза в 25 мл ликвора-XB с ингибиторами протеазы.
  5. Для упаковки яиц: передача яйца в Бекман труб ultraclear. Разрешить яйца, чтобы обосноваться. Удалить столько CSF-XB насколько это возможно. Центрифуга яйца использованием Beckman SW 40 Ti ротора (или аналогичный ротора) при 1000 оборотов в минуту (150 г) в течение ~ 60 сек при 4 ° C. Удалите излишки раствора из верхней части упакованных яиц.
  6. Чтобы раздавить яйца и генерировать цитоплазматических выписке: центрифуги яйца в 10000 оборотов в минуту (16,000 г) в течение 10 мин при 4 ° C. Яйца должны разделиться на три слоя: липидов (вверху), цитоплазма (в центре) и желток (внизу). Сбор цитоплазматических слой из каждой пробирки с 18-иглы, вставив иглу через трубки на базе цитоплазматического слоя. Передача цитоплазмы в новую пробирку ultraclear Бекман на льду.
  7. Добавить ингибиторов протеазы в изолированной цитоплазмы в конечной концентрации 1X. Recentrifuge цитоплазме при 16000 г в течение 10 мин при 4 ° C. Сбор уточнил цитоплазме как описано выше. Ожидайте получения 0.75-1 цитоплазме мл / лягушку.
  8. Добавить 1 / 20 от объема экстракта энергетическом балансе образца. Передача цитоплазмы в толстостенных труб поликарбоната для Beckman TL-100 ультрацентрифуге. Трубы держать около 3 мл каждая и должны быть по крайней мере наполовину.
  9. Добавить 1 М CaCl 2 в каждую пробирку, чтобы конечная концентрация 0,4 мм. Инкубировать пробирки в течение 15 мин при комнатной температуре. Это инактивирует CSF и толкает экстракта в интерфазе.
  10. Баланс труб и их в центрифуге Beckman TL-100 ультрацентрифуге использованием TLA-100,3 ротора при 70 000 оборотов в минуту (200 000 г) в течение 1,5 ч при 4 ° C. Цитоплазма будет фракционирования на четыре слоя, сверху вниз: липидов, цитозоль, мембрана / митохондрии, и гликоген / рибосом.
  11. Удалить цитозольного слой из каждой пробирки (~ 1 мл 2-3 мл, если была загружена в трубке), вставляя шприц в верхней части трубки, через липидный слой. Передача цитозольного долю на свежий труб и recentrifuge образцов при 70 000 оборотов в минуту (200 000 г) в течение 20 мин при 4 ° C.
  12. Алиготе супернатанта в 25-мкл аликвоты в 0,5-мл пробирки. Быстрый заморозить порциями в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° С до использования. Для определения того, экстракт является эффективным, сперма ядер может быть инкубировали в экстракте и окрашивали Hoechst для определения ядер заметно набухают (утолщаться и удлинить) в течение 10 мин сложения при комнатной температуре.

C. Реакция трансгенез и переноса ядра

Важно: Убедитесь, что решения, оборудование и лягушек все готовы до начала реакции. Как только вы начнете, вы должны приступить к реакции с помощью приблизительный график, описанных ниже, так как многие компоненты не остаются стабильными в течение> 30 минут. Хотя запас спермы ядер держится на льду, трансгенез реакций (как разбавленной и концентрированной) должны храниться при комнатной температуре.

  1. Премьер женский лягушек. Вечером перед трансгенез, ввести несколько (3-5) взрослых женщин лягушка с 800 единиц HCG в спинной лимфатический мешок для получения свежих яйца начиная со следующего дня.
  2. День трансгенез процедуры, подготовить или привлечь к температуре решения, необходимые для трансгенез:
    1. Только что сделал цистеина (2,5% в 1XMMR, pH8.0). Вам понадобится несколько сотен миллилитров, которые будут использоваться в тот день.
    2. 0.2XMMR +6% Ficoll для трансплантации блюд и восстановления трансгенных эмбрионов и 0.2XMMR +100 мкг / мл гентамицина (без Ficoll) для повышения эмбрионов. Решения не должны быть теплее 18-21 ° С и трансгенных эмбрионов должны быть подняты до начала раскола при температуре от 16 до 21 ° С, так как более высокие температуры отрицательно сказаться как на частоте трансгенеза и эмбрионального развития.
    3. Оттепель и равновесие до комнатной температуры замороженных аликвоты SDB (буфер спермы разведения) для трансплантации дня, оттепель высокой скорости извлечения и место на льду, и подготовить 100mM MgCl 2 решения.
    4. Убирайтесь-йэлектронной агарозном инъекции блюд и залейте MMR / Ficoll решения, а также создать и предварительно запустить инфузионный насос для стабилизации потока.
    5. Убедитесь, что самка лягушки укладки и яйца имеют высокое качество. Оптимально, яйца должны иметь твердую кору (удерживать форму после де-jellying).
  3. Настройка трансгенез реакции:
    1. Очень осторожно (с помощью пипетки обрезанный кончик) смесь ядер акций и объединить в тюбике 1,5 мл Eppendorf:
      4μl ядер (~ 4-8х10 5 ядер)
      2μl линеаризованной плазмиды (100ng/μl)
      Инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
    2. в то время как инкубационный идет, развести 0.5μl ограничения фермента в 4.5μl H 2 O и добавить 1 мкл из разбавленного фермента 18μl СКБ, 2μl из MgCl 2 и 2μl высокой скорости извлечения. Добавить эту смесь для ядер-плазмиды реакции. Инкубируйте 10 минут для набухания ядра.
    3. Во время этой инкубации, выжать яиц от 2-3 лягушек и де-желе в цистеин решение. Вымойте их хорошо (5X) с 1XMMR, а также использовать широкий отверстие пипетки перенести 400-500 dejellied яйца каждый агарозы и блюдо с 0,2 x MMR +4% Ficoll. Это обычно занимает около 10 минут, поэтому, как только яичные блюда готовятся реакции, как правило, готовы разбавлять.
    4. Примерно через 15-20 минут после начала шаг, осторожно перемешать реакции (ядра / выписка / ДНК) с подрезанными наконечник и добавить около 5 мкл до 150 мкл СКБ при комнатной температуре. Ядра в этой разбавленной смеси стабильны в течение приблизительно 1 час., Тогда как они не сохраняют трансплантации мощности до тех пор, когда оставил в концентрированной смеси.
  4. Нагрузки иглы: смешать разбавленный реакция полученного выше очень нежно с широким кончиком пипетки отверстие, а затем загрузить иглы быстро, как ядер будет быстро урегулировать в трубке. Для backload иглу, место кусок тонкой трубки Tygon на конец обрезанный кончик пипетки 200 мкл. Нарисуйте раствора в наконечник пипетки, затем прикрепите трубку к игле и позволяют решение ввести иглу под действием силы тяжести или слегка удручает пипетки поршень.
  5. Прикрепить иглы для перекачки труб и начать трансплантации ядер. Инъекции должны быть быстрыми, мелкими и приблизительно перпендикулярным плазматическую мембрану яйца делать, чтобы избежать повреждений. На скорость потока предложил (10nl/sec), держите иглу в яйце в течение ~ 0,5 секунды. Вы должны заполнить 1-2 блюд трансплантации в течение 20-30 минут.

После инъекции, оставьте блюда на 16-20 ° С до эмбрионов достигли стадии 4-8 клеток. Сортировать рассекая эмбрионы от их не рассекая соседей путем передачи (со стеклянной пипетки Пастера с наконечником примерно того же диаметра, яйцо) для свежего большое блюдо из 0.2XMMR +4% Ficoll. Разделите расщепления эмбрионов в небольших группах (10-15 эмбрионов / лунку 6-луночный планшет) и культуры в 0.2XMMR (без Ficoll) +100 мкг / мл гентамицина за счет раннего развития. Эмбрионы должны быть проверены во время гаструляции с любой умирающей эмбрионов удалены быстро и средств массовой информации меняется по мере необходимости.

Устранение неполадок:

  1. Игла заблокирована: раствор поток от иглы должно быть очевидно, во время пересадки. Если игла становится заблокирован видимых твердых частиц, изменение иглы или попытаться удалить мусор, закрепляя кончик щипцами и толкая раствор через иглу.
  2. Нет рассекая яйца получаются: проверьте, что разведениях ядер сперматозоидов и объемом впрыска являются подходящими и, что игла не была заблокирована во время пересадки. Если инъекция объем слишком велик, яйца также могут не сольются и вместо этого показать обесцвеченные пигментации или повреждения.
  3. Многие эмбрионов умирают во время гаструляции. Ряд факторов может увеличить эмбриона выживания:
    1. будьте осторожны с ядрами в период подготовки и ферментативной реакции. Деконденсированных ядер являются хрупкими и требуют пересадки использованием график выше. Не храните их на льду.
    2. Хромосомные ущерб, понесенный спермы ядер в ходе реакции ферментов и переноса ядра влияет как на частоте трансгенеза и нормальное развитие эмбрионов. Хромосомные повреждения ядра повышает эффективность трансгенеза но и отрицательно влияет на выживание / нормального развития. Уменьшение или пропуск рестрикции во время инкубации фермента может повысить скорость нормального развития, но может уменьшить частоту трансгенеза или плазмиды числа копий введена в эмбрион генома.
    3. Если поздней бластулы через эмбрионов гаструлы проявлять признаки обесцвечивания или гибель клеток это также возможно, что реагенты, используемые для трансплантации был токсичен для яиц. Кроме того, если яйцоы не имеют твердой коры, они могут пройти exogastrulation и не в состоянии генерировать нормальные пост-гаструлы эмбрионов.
  4. Количество эмбрионов выражения трансгенной является низким. Увеличение количества рестрикции.

Представитель трансгенных эмбрионов Результаты

Рисунок 1
Трансгенные эмбрионы в результате ядерных передач должны быть подняты до выражения из промоутер интерес видна. На рисунке 1 выше, промоутер мышце актин диски выражение зеленого флуоресцентного белка в сомитов этого трансгенных головастика.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для каждого трансгенного построить для тестирования, мы, как правило пересадки ядер в 500-1000 яиц, в этом масштабе, мы можем создать трансгенных эмбрионов выражении до 10 различных конструкций в сутки, в зависимости от того, сколько женщин индуцированные чтобы отложить яйца. Из этих трансплантаций, около одной трети яиц расщеплять и 60-80% из этих эмбрионов расщепления протекают через гаструляции нормально. В зависимости от условий реакции использовали, между 10-50% из этих эмбрионов выразить трансгенов интересов. Поэтому, как только эта процедура основана в лаборатории, можно на одного работающего населения для создания трансгенных эмбрионов выражении количество различных плазмид в один день. Трансгенов интегрироваться в геном как concatemer (5-35 экземпляров), так что этот метод может быть также использована для cointegrate более одного различные трансгенов в геном одного эмбриона на высокой частоте (80-90%) 4.

Трансгенез Описанный здесь подход был успешно использован для misexpress гены интерес для изучения регуляции генов, а также для получения эмбрионов, которые выражают маркер / флуоресцентные репортера в клетках или структуры, представляющие интерес (например, 4-7). Трансгенов были распространяться по зародышевой линии 8. Наконец, хотя процедура показана для использования с Xenopus laevis здесь, она также была адаптирована для использования в родственных видов диплоидный, Xenopus tropicalis 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными уходу за животными и использование комитета в Вашингтонском университете в Школе медицины.

Acknowledgments

Финансирование для нашей работы обеспечивается NIH, март Dimes, и американского Общества рака.

Materials

A.Sperm nuclei preparation

Reagents:

  1. 1X MMR (2mM CaCl2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 100mM NaCl).
  2. 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic acid ethyl ester, Sigma A-5040), 0.1% sodium bicarbonate. Dissolve in water.
  3. 2X Nuclear Preparation Butter (NPB). On the day of the sperm nuclei preparation, make up 30 ml of 2X NPB from aliquots of the stock solutions stored frozen: 500 mM sucrose (1.5 M stock), 30 mM HEPES (1M stock; titrate with KOH so that pH 7.7 is at 15 mM), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501; 10 mM stock), 0.4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141; 10 mM stock), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632; 100 mM stock), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0).
  4. Use the 2XNPB to make a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB+3%BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB+0.3%BSA.
  5. Lysolecithin: 100 μl of 10 mg/ml L-α-lyso-Lecithin, Egg Yolk (Calbiochem, 440154); dissolve at room temperature just before use. Store solid stock at 20 °C. Discard the stock powder if it becomes sticky.
  6. Bovine serum albumin (BSA): 10% (w/v) BSA (fraction V, Sigma A-7906) Make up 5 ml in water on the day of the sperm nuclei preparation.
  7. Sperm storage buffer (1ml) 1X NPB, 30% glycerol, 0.3% BSA.
  8. Sperm dilution buffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0.5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride. Titrate to pH 7.3-7.5 and store 0.5-1 ml aliquots at 20 °C.
  9. H–chst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 mg/ml stock in dH2O, store in a light tight vessel at 20 °C.

Equipment:

  • Swinging bucket rotor and centrifuge
  • cheesecloth
  • dissection tools (forceps and scissors)
  • fluorescence microscope
  • funnel
  • gloves
  • hemocytometer
  • needles (26 gauge)
  • paper towels
  • petri dishes (60 mm)
  • pipettes
  • plastic (5 and 10 ml)
  • Pipetman tips (1 ml and 200μl)
  • Syringes (1 ml)
  • tubes (14 ml; Falcon, 2059)
  • tubes
  • microcentrifuge (1.5 ml)

B. Preparation of High Speed Extract

Reagents:

  1. 1X Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare a 10X stock, and adjust pH with NaOH to 7.5.
  2. 20X Extract buffer (XB) salt stock: 2 M KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, filter-sterilize and store at 4 °C.
  3. Extract buffer (XB; freshly prepared and stored on ice): 1X XB salts, 50 mM sucrose,10mM HEPES (1 M stock, titrated with KOH so that pH is 7.7 when diluted to 15 mM; filter-sterilize, and store in aliquots at 20 °C). Prepare about 100 ml.
  4. 2% (w/v) L-Cysteine hydrochloride 1-hydrate: Made up in 1X XB salts before use and titrated to pH 7.8 with NaOH. Prepare about 300 ml.
  5. CSF-XB: 1X XB salts, 1 mM MgCl2 (in addition to MgCl2 present in XB salts; final concentration 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7.7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml.
  6. Protease inhibitors: Mixture of leupeptin, chymostatin, and pepstatin, each dissolved to a final concentration of 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO). Store in small aliquots at 20 °C.
  7. 1 M CaCl2.
  8. Energy mix: 150 mM creatine phosphate, 20 mM ATP, 20 mM MgCl2.
  9. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U/ml PMSG (P.G.600®, Intervet, Inc., 021825). Dissolve in water and stored at 20 °C.
  10. Human Chorionic Gonadotropin (HCG): 1000 U/ml HCG (CHORULON®, Intervet, Inc., 057176 ). Dissolve in water and stored at 4 °C.

Equipment:

  • Xenopus laevis females
  • Needles (18 and 26 gauge)
  • Pasteur pipette
  • wide bore
  • Syringes (1 mL)
  • Tubes, microcentrifuge (0.5 mL)
  • Tubes, thick-wall polycarbonate (Beckman, 349622)
  • Tubes, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344060)
  • Ultracentrifuge and rotors (e.g., Beckman TL-100 with rotors SW 40 Ti and TLA-100.3)
  • Beakers for egg collection
  • Buckets or containers for holding female frogs (e.g., 4-L plastic beakers with mesh lids).

C. Nuclear transplantation.

Reagents:

  1. 2.5% agarose in 0.1XMMR (for making injection dishes)
  2. 2.5% Cysteine in 1XMMR, pH8.0, prepared on the day of use
  3. Ficoll
  4. 10 mg/ml gentamycin (1000X stock)
  5. high speed egg extract (see above)
  6. 100 MgCl2
  7. 10X MMR (see above)
  8. Restriction enzyme (e.g. NotI from New England Biolabs)
  9. Sperm dilution buffer (SDB; see above) and sperm nuclei (see above)
  10. Human Chorionic Gonadotropin (HCG) as above
  11. mineral oil (Sigma, M8410)
  12. Linearized plasmid to be introduced as the transgene: Prepare linearized plasmid at a concentration of about 100 ng/μl in sterile, nuclease-free water (we avoid Tris and EDTA-containing buffers, which are somewhat toxic to embryos). The restriction enzyme used to linearize the plasmid d–s not have to be the same as the one used in the nuclear transfer reaction. We usually use NotI for all reactions, regardless of what plasmid is linearized with. Some calibration of the enzyme dilution used in the reaction may be necessary, as too much enzyme can cause adverse effects on post-gastrula development. Plasmid can be purified in several different ways: we usually use the Qiagen Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturers directions; purification of a single band from a gel is not necessary. If plasmid is purified using phenol/chloroform extractions and ethanol precipitation, be certain to remove all traces of organics and ethanol.

Equipment:

Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4 °C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.

Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.

Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.

Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kroll, K. L., Amaya, E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development. 122, 3173-3183 (1996).
  2. Amaya, E., Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).
  3. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
  4. Hartley, K. O., Hardcastle, Z., Friday, R. V., Amaya, E., Papalopulu, N. Transgenic Xenopus embryos reveal that anterior neural development requires continued suppression of BMP signaling after gastrulation. Developmental Biology. 238, 168-184 (2001).
  5. Karaulanov, E., Knöchel, W., Niehrs, C. Transcriptional regulation of BMP4 synexpression in transgenic Xenopus. EMBO J. 23, 844-856 (2004).
  6. Ogino, H., Fisher, M., Grainger, R. M. Convergence of a head-field selector Otx2 and Notch signaling: a mechanism for lens specification. Development. 135, 249-2458 (2008).
  7. Taylor, J. J., Wang, T., Kroll, K. L. Tcf- and Vent-binding sites regulate neural-specific geminin expression in the gastrula embryo. Developmental Biology. 289, 494-506 (2006).
  8. Marsh-Armstrong, N., Huang, H., Berry, D. L., Brown, D. D. Germ-line transmission of transgenes in Xenopus laevis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14389-14393 (1999).
  9. Offield, M. F., Hirsch, N., Grainger, R. M. The development of Xenopus tropicalis transgenic lines and their use in studying lens developmental timing in living embryos. Development. 127, 1789-1797 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics