Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

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Biology

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Summary

Este protocolo de vídeo demonstra um método para a geração de transgênicos

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Amaya, E., Kroll, K. Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation. J. Vis. Exp. (42), e2010, doi:10.3791/2010 (2010).

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Abstract

Integração estável dos produtos gene clonado no genoma Xenopus é necessário para controlar o tempo e lugar de expressão, para expressar genes em fases posteriores do desenvolvimento embrionário, e para definir como potenciadores e promotores de regular a expressão de genes no interior do embrião. O protocolo demonstrado aqui pode ser usado para produzir de forma eficiente embriões transgênicos Xenopus laevis. Esta abordagem transgenia envolve três partes: 1. Núcleos espermáticos são isolados do adulto X. testículo laevis pelo tratamento com lysolecithin, que permeabilizes da membrana plasmática de espermatozóides. 2. Extrato de ovo é preparado por centrifugação de baixa velocidade, além de cálcio para causar o extrato para avançar para a interfase do ciclo celular, e uma centrifugação de alta velocidade para isolar citosol interfase. 3. Nuclear transplante: os núcleos e extrato são combinados com o DNA do plasmídeo linearizado para ser apresentado como o transgene e uma pequena quantidade da enzima de restrição. Durante uma reação de curto, extrato de ovo parcialmente decondenses a cromatina de espermatozóides ea enzima de restrição gera quebras cromossômicas que promovem a recombinação do transgene no genoma. Os núcleos de espermatozóides tratados são então transplantados para ovos não fertilizados. Integração do transgene geralmente ocorre antes da primeira clivagem embrionária de tal forma que os embriões resultantes não são quiméricos. Esses embriões podem ser analisados ​​sem qualquer necessidade de raça para a próxima geração, permitindo a geração eficiente e rápida de embriões transgênicos para análises de promotor e função do gene. Adulto X. laevis resultante deste procedimento também propagar o transgene através da linha germinativa e pode ser usado para gerar linhas de animais transgénicos para fins múltiplos.

Protocol

Versões modificadas deste abordagem transgênese foram inicialmente descritas em 1 e 2.

A. preparação núcleos do esperma

Este método de preparação núcleos é adaptado de Murray 3, mas os inibidores da protease foram omitidos como elas interferem com o desenvolvimento subseqüente de ovos transplantado com núcleos de esperma. Alíquotas são congeladas a -80 ° C e podem ser usados ​​para transplantes por aproximadamente 6 meses.

Todas as soluções devem ser preparadas e colocadas no gelo antes de começar a preparação.

  1. Anestesiar 1-2 adultos do sexo masculino X. laevis por imersão em tricaina por pelo menos 20 min seguido por mielotomia; remover os testículos.
  2. Rolar os testículos em uma toalha de papel para remover o sangue, vasos sangüíneos e gordura corporal, lavá-los brevemente em uma placa de Petri contendo 60 milímetros 1XMMR, e remover quaisquer peças adicionais de gordura corporal. Tome cuidado para não furar os testículos, já que este libera o esperma.
  3. Transferência testículos a uma placa de Petri e seco de 60 mm e testículos macerar com uma pinça até que não haja pedaços visíveis. Maceração deve ser feito tanto quanto possível para obter altos rendimentos de núcleos.
  4. Adicionar tampão preparação 2mls frio nuclear (NPB; 1X de ações) para o macerado e gentilmente pipeta cima e para baixo.
  5. Squirt macerar por cerca de quatro espessuras de gaze em um funil, a coleta em um tubo de 15 mL (Falcon por exemplo, 2059); Lavar prato com 8mLs do NPB e colocar este lavar através da gaze, recolhendo-a do tubo. Com as mãos enluvadas espremer a gaze para coletar líquido restante no tubo.
  6. Pellet o esperma a 3.000 rpm por 10 min. a 4 ° C em um rotor de caçamba móvel (1480g por exemplo, em um rotor Sorvall HB-4 ou equivalente) com os adaptadores de tubo apropriada. NPB 8ml adicionar a este tubo e pipetar cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL para ressuspender pellet;; sobrenadante decantar girar novamente como sobrenadante acima e decantar. Equilibrar 1mL de NPB à temperatura ambiente durante o spin.
  7. Ressuspender pellet em 1mL NPB temperatura ambiente usando a 1 mL pipetteman ponta, adicionar 50μl de 10mg/mL lysolecithin preparados na hora, misture delicadamente e incubar por 5 min. à temperatura ambiente.
  8. Adicionar 10 mL BSA 1XNPB frio +3% ao tubo para parar a reação lysolecithin, misture delicadamente, e spin down por 10 min a 3000 rpm em um rotor de caçamba móvel. Sobrenadante decantar. O pellet lysolecithin tratados deve olhar um pouco mais translúcido (branco opaco menos) do que tinha antes do tratamento lysolecithin.
  9. Decantar o sobrenadante e ressuspender sedimento em 5 mL frio NPB BSA 0,3%, misture delicadamente com uma pipeta de 10 mL e spin down por 10 minutos a 3000rpm como acima.
  10. Decantar o sobrenadante e ressuspender pellet em 500μl de tampão de espermatozóides de armazenamento e transferência para um tubo de 1,5 mL. Este é agora o seu estoque núcleos. Loja no gelo enquanto você verificar o rendimento dos núcleos.
  11. Para verificar o rendimento dos núcleos, coloque 98 mL de tampão de diluição do esperma (SDB), 1 ml do estoque nuclear e 1μl de diluição 1:100 do estoque Hoechst em um tubo Eppendorf 1,5 ml. Misture o estoque nuclear muito bem usando um razor-cortada (ou grande abertura) ponteira pouco antes de retirar o mL 1. Misture a SDB diluído / Hoechst / núcleos muito bem e deixe uma pequena quantidade de fluxo para a câmara de um hemocitômetro de Neubauer melhorada por ação capilar. Contagem de núcleos em uma praça do hemocitômetro sob um microscópio composto. De um homem, você deve obter a contagem de pelo menos 100-200 (X10 4 células / mL) para esta diluição de 1:100 do estoque para uma concentração de ações sem diluição de 1-5 2X10 células / ml. Se o seu estoque é menos concentrada, vamos resolver os núcleos por várias horas, remover alguns dos sobrenadante, e recontagem. Deixe os núcleos a 4 ° C durante a noite para permitir que o glicerol para penetrar melhor para a criopreservação; em seguida, misture o estoque nuclear bem com um grande orifício da ponta da pipeta, prepare alíquotas 20μl, e congelar em nitrogênio líquido.

B. Elaboração de Extrato de Alta Velocidade

Este método é adaptado de Murray 3 e produz um extrato interfase citosólica que irá promover a descondensação da cromatina inchaço e parcial dos núcleos espermáticos acrescentou. Extrato pode ser congelada em pequenas alíquotas a -80 ° C e descongeladas antes de usar.

  1. 3-5 dias antes da injeção de HCG, primeiro 12/08 fêmea adulta X. laevis pela injeção de 50 U de PMSG no saco linfático dorsal. A noite antes da preparação extrair, injetar cada sapo com 500 unidades HCG e coloque 2 rãs / recipiente em 2 1XMMR litros. Uma vez que um sapo com lise ou ativar os ovos podem comprometer a preparação do extracto, é conveniente separar as rãs em pares para a ovulação.
  2. Na manhã seguinte, prepare e chill todas as soluções antes de iniciar a preparação. Suavemente, manualmente expulsar os ovos de cada sapo em grande beakers contendo 1X MMR. Tela os ovos em cada recipiente e omitir qualquer lotes de ovos com sinais de lise mottling, ou a activação (visualizada pela contração da pigmentação no hemisfério animal) do procedimento. Coleta de ovos ininterrupta, mesmo com a pigmentação. Ovos bons também podem ser coletados a partir do MMR 1X nos baldes sapo. O volume total de ovos deve ser> 100 mL da 8-12 fêmeas.
  3. De-jelly os ovos. Para fazer isso, remova MMR, tanto quanto possível, adicione uma pequena quantidade de solução de cisteína, e agite os ovos. Substituir com solução de cisteína fresco várias vezes durante de-gelatinizante. De-geléia cada lote de ovos separadamente e descartar lotes com quebra ou a ativação do ovo. Combine o restante dos ovos.
  4. Lave os ovos quatro vezes em 35 ~ mL de tampão extract (XB), e depois duas vezes em 25 mL de CSF-XB com os inibidores da protease.
  5. Para embalar os ovos: transferência dos ovos em tubos de Beckman UltraClear. Permitir que os ovos para resolver. Remover o máximo CSF-XB possível. Centrifugar os ovos usando um Beckman SW 40 Ti rotor (rotor ou similar) a 1000 rpm (150g) de ~ 60 seg a 4 ° C. Retire o excesso de solução a partir do topo dos ovos embalados.
  6. Para esmagar os ovos e gerar citoplasmática extrair: centrifugar os ovos em 10.000 rpm (16.000 g) por 10 min a 4 ° C. Os ovos devem separar em três camadas: lipídica (top), citoplasma (centro), e gema (parte inferior). Coletar a camada citoplasmática de cada tubo com uma agulha de calibre 18, inserindo a agulha através do tubo na base da camada de citoplasma. Transferência de citoplasma de um novo tubo de Beckman UltraClear no gelo.
  7. Adicionar inibidores da protease para o citoplasma isolado para uma concentração final de 1X. Recentrifuge o citoplasma a 16.000 g por 10 min a 4 ° C. Recolher o citoplasma esclareceu como descrito acima. Esperam obter 0,75-1 citoplasma mL / sapo.
  8. Adicione 1 / 20 do volume de extrato de mix de energia para a amostra. Transferência de citoplasma em tubos de paredes espessas de policarbonato para o TL-100 ultracentrífuga Beckman. Tubos de armazenar cerca de 3 mL cada um e deve ser pelo menos metade.
  9. Adicionar 1 M CaCl 2 a cada tubo a uma concentração final de 0,4 mM. Incubar os tubos durante 15 min à temperatura ambiente. Este inativa CSF e empurra o extrato em interfase.
  10. Balanço dos tubos e centrifugar-los em um TL-100 ultracentrífuga Beckman usando um TLA-100,3 rotor em 70.000 rpm (200.000 g) por 1,5 horas a 4 ° C. O citoplasma se fracionar em quatro camadas, de cima para baixo: lipídico, citosol membrana, / mitocôndrias e glicogênio / ribossomos.
  11. Remover a camada citosólica de cada tubo (~ 1 se mL 2-3 mL foi carregado para dentro do tubo) através da inserção de uma seringa no topo do tubo através da camada lipídica. Alienar a fração citosólica de tubos fresco e recentrifuge as amostras a 70.000 rpm (200.000 g) por 20 min a 4 ° C.
  12. Alíquota do sobrenadante em 25 mL em alíquotas de 0,5 mL tubos. Quick-congelar as alíquotas em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C até o uso. Para determinar se o extrato é eficaz, os núcleos do esperma pode ser incubadas no extrato e corados com Hoechst para determinar se os núcleos visivelmente swell (engrossar e alongar) dentro de 10 min da adição à temperatura ambiente.

C. reação Transgénese e transferência nuclear

Importante: Verifique se soluções, equipamentos e rãs estão todos prontos antes de começar uma reação. Uma vez que você começar, você deve proceder com a reação utilizando o calendário aproximado descrito a seguir, já que muitos componentes não permanecer estável por> 30 minutos. Enquanto o estoque núcleos do esperma é mantido em gelo, reações transgênese (ambos diluído e concentrado) deve ser mantido em temperatura ambiente.

  1. Primeiro-rãs do sexo feminino. À noite antes de transgênese, vários injetar (3-5) sapo adulto do sexo feminino com 800 unidades de HCG no saco linfático dorsal para obter ovos frescos início no dia seguinte.
  2. O dia do procedimento transgênese, preparar ou trazer a temperatura das soluções necessárias para a transgênese:
    1. Cisteína feita recentemente (2,5% em 1XMMR, pH8.0). Você vai precisar de várias centenas de mililitros para ser usado naquele dia.
    2. 0.2XMMR Ficoll 6% para os pratos de transplante e recuperação de embriões transgênicos e 0.2XMMR 100 mcg / mL de gentamicina (sem Ficoll) para a criação de embriões. Soluções não devem ser mais quente do que 18-21 ° C e embriões transgênicos devem ser levantados através de clivagens início a temperaturas entre 16 e 21 ° C, já que temperaturas mais altas afetar tanto a freqüência de transgênese e desenvolvimento embrionário.
    3. Descongelar e atingir a temperatura ambiente alíquotas congeladas de DRS (tampão de diluição do esperma) para transplantes do dia, descongelar o extrato de alta velocidade e colocar no gelo, e preparar um 100mM MgCl 2 solução.
    4. Sair ªagarose e pratos de injeção e preencher com MMR / Ficoll solução, e configurar e executar o pré-bomba de infusão para estabilizar o fluxo.
    5. Verifique se as rãs do sexo feminino são poedeiras e ovos são de alta qualidade. Idealmente, os ovos devem ter um córtex empresa (manter a forma depois de-gelatinizante).
  3. Configurar uma reação transgenia:
    1. Muito delicadamente (usando uma ponteira cortada) misturar o estoque núcleos e combinam em um tubo Eppendorf 1,5 ml:
      Núcleos 4μl (~ 4 8X10-5 núcleos)
      2μl linearizada plasmídeo (100ng/μl)
      Incubar 5 minutos à temperatura ambiente.
    2. enquanto processo de incubação é, diluir 0.5μl da enzima de restrição em 4.5μl H 2 O e adicione 1μl da enzima diluída para 18μl da SDB, 2μl de MgCl 2 e 2μl de extrato de alta velocidade. Adicione esta mistura para a reação de núcleos de plasmídeo. Incubar mais 10 minutos para inchar os núcleos.
    3. Durante esta incubação, squeeze ovos 2-3 sapos e geléia de-cisteína em solução. Lave-os bem (5x) com 1XMMR, e usar uma pipeta de largura deu a transferência de 400-500 ovos dejellied para cada prato bem agarose contendo 0,2 X Ficoll MMR 4%. Isso normalmente leva cerca de 10 minutos, então quando pratos de ovos são preparados a reação é geralmente pronto para diluir.
    4. Cerca de 15-20 minutos após o início do passo, misture delicadamente a reação (núcleos extrair / / DNA) com uma ponta cortada e adicionar cerca de 5μl a 150 SDB mL à temperatura ambiente. Núcleos nesta mistura diluída é estável por cerca de 1h., Enquanto eles não retêm a capacidade de transplante, desde quando saiu da mistura concentrada.
  4. Carga a agulha: Misture a reação diluída, preparada acima muito delicadamente com uma ponta de largura orifício pipeta, em seguida, carregar a agulha rapidamente, como núcleos resolverão rapidamente no tubo. Para protelar o agulha, coloque um pedaço de tubo de Tygon bem no final de uma ponteira cortada 200μl. Desenhe a solução para a ponta da pipeta, em seguida, conectar o tubo à agulha e deixar a solução para inserir a agulha por gravidade ou levemente pressionando o êmbolo da pipeta.
  5. Anexar agulha para começar a tubulação e bomba de transplantes de núcleos. Injecções devem ser rápidas, rasas e aproximadamente perpendicular à membrana do óvulo plasma para evitar fazer danos. A uma taxa de fluxo sugerido (10nl/sec), manter a agulha dentro do ovo para ~ 0,5 segundos. Você deve concluir 1-2 pratos de transplantes dentro de 20-30 minutos.

Após as injeções, deixe os pratos em 16-20 ° C até embriões atingiram o estágio de célula 4-8. Classificar os embriões cleaving longe de seus vizinhos não-clivagem, transferindo (com um copo de pipeta Pasteur com ponta de aproximadamente o mesmo diâmetro de um ovo) para um prato grande de doce 0.2XMMR Ficoll 4%. Subdividir a clivagem de embriões em grupos menores (10-15 embriões / poço de uma placa de 6 poços) e cultura em 0.2XMMR (sem Ficoll) 100 mcg / mL de gentamicina através do desenvolvimento precoce. Embriões devem ser verificados durante a gastrulação com qualquer embriões morrendo removidas imediatamente e os meios de comunicação mudado quando necessário.

Solução de problemas:

  1. Agulha é bloqueado: fluxo de solução da agulha deve ser aparente durante os transplantes. Se a agulha for bloqueada por partículas visíveis, alterar agulhas ou tentar remover os destroços por corte a ponta com uma pinça e empurrando solução através da agulha.
  2. Sem ovos clivagem são obtidos: verifique se diluições de núcleos de esperma e de volume de injeção são adequadas e que a agulha não foi bloqueado durante o transplante. Se o volume de injeção é muito alto, os ovos também podem não decompor e, em vez mostrar pigmentação descoloridos ou danos.
  3. Embriões morrem durante a gastrulação. Vários fatores podem aumentar a sobrevivência embrionária:
    1. tomar cuidado com os núcleos durante a preparação ea reação enzimática. Núcleos descondensada são frágeis e precisam ser transplantados usando o calendário acima. Não colocá-los no gelo.
    2. O dano cromossômico sustentada pelos núcleos do esperma durante a reação enzimática e transferência nuclear afeta tanto a freqüência de transgênese e o desenvolvimento normal dos embriões. Danos cromossômicos para os núcleos aumenta a eficiência da transgenia, mas afeta negativamente a sobrevivência / desenvolvimento normal. Diminuindo ou omitindo enzima de restrição durante a incubação da enzima podem aumentar a taxa de desenvolvimento normal, mas pode diminuir a freqüência de transgênese ou número de cópias do plasmídeo introduzido no genoma do embrião.
    3. Se o atraso for blástula através de embriões gástrula mostrar sinais de descoloração ou morte celular, também é possível que um reagente utilizado para os transplantes era tóxico para os ovos. Além disso, se ovos não têm um córtex empresa, eles podem sofrer exogastrulation e não para gerar normais de pós-gástrula embriões.
  4. O número de embriões expressando o transgene é baixa. Aumentar a quantidade de enzima de restrição.

Representante Transgênicos Resultados Embrião

Figura 1
Embriões transgênicos resultantes de transferências nuclear deve ser levantada até a expressão do promotor de interesse é visível. Na Figura 1 acima, um promotor de actina de músculo drives expressão da proteína verde fluorescente no somitos deste girino transgênicos.

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Discussion

Para cada construção de transgênicos a serem testados, geralmente transplante de núcleos em 500-1000 ovos; nessa escala, podemos gerar embriões transgênicos expressando até 10 construções diferentes por dia, dependendo de quantas mulheres são induzidas a pôr ovos. Desses transplantes, cerca de um terço do cleave ovos e 60-80% destes embriões cleaving proceder através gastrulação normalmente. Dependendo das condições de reação utilizadas, entre 10-50% desses embriões expressar o transgene de interesse. Portanto, uma vez que este procedimento é estabelecido no laboratório, é possível que um trabalhador para criar populações de embriões transgênicos expressando uma série de plasmídeos diferentes em um único dia. Transgenes integrar o genoma como um concatemer (5-35 cópias), de modo que este método também pode ser usado para cointegram mais de um transgene diferentes no genoma de um único embrião em alta freqüência (80-90%) 4.

A abordagem descrita aqui transgênese tem sido usados ​​com sucesso para misexpress genes de interesse, para estudar a regulação do gene e gerar embriões que expressam um marcador / repórter fluorescente em células ou estruturas de interesse (por exemplo, 4-7). Transgenes têm sido propagadas através da linha germinativa 8. Finalmente, embora o procedimento é demonstrado para uso com Xenopus laevis aqui, ele também foi adaptado para uso nas espécies diplóides relacionados, Xenopus tropicalis 9.

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Disclosures

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Animal Care e Use Comité na Washington University School of Medicine.

Acknowledgments

Financiamento para o nosso trabalho é fornecido pelo NIH, a March of Dimes, ea Sociedade Americana do Câncer.

Materials

A.Sperm nuclei preparation

Reagents:

  1. 1X MMR (2mM CaCl2, 5mM HEPES, pH7.5, 2mM KCl, 1mM MgCl2, 100mM NaCl).
  2. 0.1% Tricaine Methanesulfonate (MS222, aminobenzoic acid ethyl ester, Sigma A-5040), 0.1% sodium bicarbonate. Dissolve in water.
  3. 2X Nuclear Preparation Butter (NPB). On the day of the sperm nuclei preparation, make up 30 ml of 2X NPB from aliquots of the stock solutions stored frozen: 500 mM sucrose (1.5 M stock), 30 mM HEPES (1M stock; titrate with KOH so that pH 7.7 is at 15 mM), 1 mM spermidine trihydrochloride (Sigma S-2501; 10 mM stock), 0.4 mM spermine tetrahydrochloride (Sigma S-1141; 10 mM stock), 2 mM dithiothreitol (Sigma D-0632; 100 mM stock), 2 mM EDTA (500 mM EDTA, pH 8.0).
  4. Use the 2XNPB to make a. 30ml 1X NPB, b. 10ml 1XNPB+3%BSA (fraction V, Sigma A-7906), c. 5ml 1XNPB+0.3%BSA.
  5. Lysolecithin: 100 μl of 10 mg/ml L-α-lyso-Lecithin, Egg Yolk (Calbiochem, 440154); dissolve at room temperature just before use. Store solid stock at 20 °C. Discard the stock powder if it becomes sticky.
  6. Bovine serum albumin (BSA): 10% (w/v) BSA (fraction V, Sigma A-7906) Make up 5 ml in water on the day of the sperm nuclei preparation.
  7. Sperm storage buffer (1ml) 1X NPB, 30% glycerol, 0.3% BSA.
  8. Sperm dilution buffer: 250 mM sucrose, 75 mM KCl, 0.5 mM spermidine trihydrochloride, 0.2 mM spermine tetrahydrochloride. Titrate to pH 7.3-7.5 and store 0.5-1 ml aliquots at 20 °C.
  9. H–chst No. 33342 (Sigma B-2261): 10 mg/ml stock in dH2O, store in a light tight vessel at 20 °C.

Equipment:

  • Swinging bucket rotor and centrifuge
  • cheesecloth
  • dissection tools (forceps and scissors)
  • fluorescence microscope
  • funnel
  • gloves
  • hemocytometer
  • needles (26 gauge)
  • paper towels
  • petri dishes (60 mm)
  • pipettes
  • plastic (5 and 10 ml)
  • Pipetman tips (1 ml and 200μl)
  • Syringes (1 ml)
  • tubes (14 ml; Falcon, 2059)
  • tubes
  • microcentrifuge (1.5 ml)

B. Preparation of High Speed Extract

Reagents:

  1. 1X Marc's Modified Ringer (MMR): 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5. Prepare a 10X stock, and adjust pH with NaOH to 7.5.
  2. 20X Extract buffer (XB) salt stock: 2 M KCl, 20 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, filter-sterilize and store at 4 °C.
  3. Extract buffer (XB; freshly prepared and stored on ice): 1X XB salts, 50 mM sucrose,10mM HEPES (1 M stock, titrated with KOH so that pH is 7.7 when diluted to 15 mM; filter-sterilize, and store in aliquots at 20 °C). Prepare about 100 ml.
  4. 2% (w/v) L-Cysteine hydrochloride 1-hydrate: Made up in 1X XB salts before use and titrated to pH 7.8 with NaOH. Prepare about 300 ml.
  5. CSF-XB: 1X XB salts, 1 mM MgCl2 (in addition to MgCl2 present in XB salts; final concentration 2 mM), 10 mM HEPES, pH 7.7, 50 mM sucrose, 5 mM EGTA, pH 7.7. Prepare 50 ml.
  6. Protease inhibitors: Mixture of leupeptin, chymostatin, and pepstatin, each dissolved to a final concentration of 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO). Store in small aliquots at 20 °C.
  7. 1 M CaCl2.
  8. Energy mix: 150 mM creatine phosphate, 20 mM ATP, 20 mM MgCl2.
  9. Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG): 100 U/ml PMSG (P.G.600®, Intervet, Inc., 021825). Dissolve in water and stored at 20 °C.
  10. Human Chorionic Gonadotropin (HCG): 1000 U/ml HCG (CHORULON®, Intervet, Inc., 057176 ). Dissolve in water and stored at 4 °C.

Equipment:

  • Xenopus laevis females
  • Needles (18 and 26 gauge)
  • Pasteur pipette
  • wide bore
  • Syringes (1 mL)
  • Tubes, microcentrifuge (0.5 mL)
  • Tubes, thick-wall polycarbonate (Beckman, 349622)
  • Tubes, ultraclear (14 x 95 mm; Beckman, 344060)
  • Ultracentrifuge and rotors (e.g., Beckman TL-100 with rotors SW 40 Ti and TLA-100.3)
  • Beakers for egg collection
  • Buckets or containers for holding female frogs (e.g., 4-L plastic beakers with mesh lids).

C. Nuclear transplantation.

Reagents:

  1. 2.5% agarose in 0.1XMMR (for making injection dishes)
  2. 2.5% Cysteine in 1XMMR, pH8.0, prepared on the day of use
  3. Ficoll
  4. 10 mg/ml gentamycin (1000X stock)
  5. high speed egg extract (see above)
  6. 100 MgCl2
  7. 10X MMR (see above)
  8. Restriction enzyme (e.g. NotI from New England Biolabs)
  9. Sperm dilution buffer (SDB; see above) and sperm nuclei (see above)
  10. Human Chorionic Gonadotropin (HCG) as above
  11. mineral oil (Sigma, M8410)
  12. Linearized plasmid to be introduced as the transgene: Prepare linearized plasmid at a concentration of about 100 ng/μl in sterile, nuclease-free water (we avoid Tris and EDTA-containing buffers, which are somewhat toxic to embryos). The restriction enzyme used to linearize the plasmid d–s not have to be the same as the one used in the nuclear transfer reaction. We usually use NotI for all reactions, regardless of what plasmid is linearized with. Some calibration of the enzyme dilution used in the reaction may be necessary, as too much enzyme can cause adverse effects on post-gastrula development. Plasmid can be purified in several different ways: we usually use the Qiagen Qiaquick PCR purification kit according to the manufacturers directions; purification of a single band from a gel is not necessary. If plasmid is purified using phenol/chloroform extractions and ethanol precipitation, be certain to remove all traces of organics and ethanol.

Equipment:

Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4 °C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.

Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.

Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.

Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kroll, K. L., Amaya, E. Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation. Development. 122, 3173-3183 (1996).
  2. Amaya, E., Kroll, K. L. A method for generating transgenic frog embryos. Methods Mol Biol. 97, 393-414 (1999).
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