El establecimiento de cultivos primarios de fibroblastos de adultos de los roedores

Biology

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Summary

En este artículo se describe un protocolo para el aislamiento y mantenimiento de cultivos primarios de fibroblastos de la piel y el tejido pulmonar de los roedores salvajes.

Cite this Article

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Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).

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Abstract

La importancia del uso de células primarias, en lugar de líneas celulares de cáncer, para estudios biológicos está siendo ampliamente reconocido. Las células primarias son las preferidas en los estudios de control del ciclo celular, la apoptosis y la reparación del ADN, las células cancerosas son portadores de mutaciones en los genes implicados en estos procesos. Las células primarias no pueden ser cultivadas indefinidamente debido a la aparición de la senescencia replicativa o aneuploidization. Por lo tanto, de nuevas culturas es necesario establecer con regularidad. El procedimiento para el aislamiento de los fibroblastos embrionarios de roedores está bien establecido, pero aislando las culturas de fibroblastos adultos a menudo se presenta un desafío. Fibroblastos de roedores adultos aislados de los modelos de ratón de la enfermedad humana puede ser un control preferido cuando se los compara con los fibroblastos procedentes de pacientes humanos. Además, los fibroblastos adultos son el único material disponible cuando se trabaja con roedores salvajes donde las mujeres embarazadas no pueden ser obtenidos fácilmente. Aquí les ofrecemos un protocolo para el aislamiento y cultivo de fibroblastos de la piel de roedores adultos y los pulmones. Hemos utilizado con éxito este procedimiento para aislar los fibroblastos de más de veinte especies de roedores de los ratones y ratas de laboratorio a los roedores salvajes como los castores, puerco espín, y la ardilla.

Protocol

1. Antes de empezar

  1. Esterilizar tijeras y pinzas con etanol al 70%.
  2. Lugar pequeño agitador magnético dentro de un vaso de precipitados de 30 ml, cubierta con dos capas de papel de aluminio, y autoclave.
  3. Prepare un 28 unidades Wunsch / ml de solución stock de Liberase Blendzyme 3 en agua estéril. Hacer alícuotas de 0,5 ml y congelar a -20 ° C. Descongelar una alícuota de nuevo antes de cada uso. La solución puede aparecer turbia después de la descongelación. Vortex la solución hasta que se aclare.
  4. Calentar el medio de cultivo celular.

2. Preparación de muestras de animales

Precaución: los animales salvajes pueden contener agentes patógenos tales como virus de la rabia. Que sea siempre consciente de abrir objetos punzantes.

  1. Sacrificar al animal y colocar el cadáver a 4 ° C. Lo mejor es utilizar el canal inmediatamente, sin embargo, si esto no es práctico, como si los animales son recogidos en el campo, los canales se pueden utilizar dentro de las 24 horas. Después de 24 horas, la reducciones de los rendimientos de la célula.
  2. Diseccionar al animal en la sala de operaciones o en la campana química (no en la campana de cultivo de tejidos).
  3. Área debajo del brazo es un sitio conveniente para recoger muestras de piel, como piel de las axilas es más fino, contiene menos grasa y la piel es menos densa. Limpie el sitio de la incisión con un 70% de etanol. Asegúrese de que la piel se empapa con etanol.
  4. Afeitarse la piel alrededor del sitio de la incisión con un bisturí. Afeitarse un área más grande que el sitio de la incisión deseada. Trate de minimizar los cortes en la piel. Rocíe el área con el 70% de etanol y dejar secar.
  5. Para cobrar una especial muestra de piel de un fragmento de aproximadamente 1 cm 2. Pellizcar la piel con pinzas de tejido y se corta con tijeras. Trate de no cortar la capa de grasa con la piel, la grasa interfiere con la digestión colagenasa. Para recoger las muestras de pulmón, lave el área del pecho con un 70% de etanol, y abrir la piel en el pecho con unas tijeras, haciendo una incisión en forma de T y separando las aletas de la piel. Lave el área del músculo abrió con un 70% de etanol y dejar secar. Cortar las costillas con las pinzas y tijeras estériles (uso de cortadores de huesos de animales de mayor tamaño). Utilice técnicas de esterilización para evitar la contaminación de los órganos internos. No toque los órganos internos con los instrumentos que tocaba el pelo de los animales. Cortar los fragmentos de pulmón de aproximadamente 1 cm 2 utilizando una pinza estéril y tijeras.
  6. Fragmentos de tejido en lugar de tubos de 50 ml con PBS estéril para evitar la desecación.
  7. Lavar la parte externa de la tubos de 50 ml con fragmentos de tejido con etanol, y los llevan a la capilla de cultivo de tejidos.
  8. Como deshacerse de los cadáveres de animales.

3. Extraer células

  1. La transferencia de los fragmentos de tejido en una placa de cultivo de 10 cm de tejido utilizando bisturí estéril. No transfiera demasiado PBS con la muestra.
  2. Cortar el tejido en trozos de 1 mm ~ con dos escalpelos. Use dos hojas con una acción de tijera a partir del centro y separando. Mantenga la bola con el tejido, no corte pieza por pieza. Cuando el corte es suficiente, la piel se asemeja a la masilla, no se separará en pedazos, pero se estrecha franja. El tejido pulmonar es más fácil de cortar, y se separará en pequeños pedazos.
  3. El uso de un bisturí, la transferencia de los tejidos cortados en el vaso estéril de 30 ml con barra de agitación estéril. Lavar la placa utilizada para el corte de tejidos con 10 ml de DMEM/F12 los medios de comunicación, con 0,14 unidades Wunsch / mL Liberase Blendzyme 3, y 1X antibiótico / antimicótico, y la solución en el vaso de 30 mL con fragmentos de tejido.
  4. Cubrir el vaso con una lámina estéril, y se incuba a 37 ° C, revolviendo lentamente, durante 30 a 90 minutos. La duración de la incubación depende del tipo de la especie y el tejido. Tenga cuidado de no sobre-digerir el tejido. Mejores rendimientos se obtienen cuando los fragmentos de tejidos están todavía presentes en la final de la digestión. La piel necesita más tiempo para digerir que el pulmón. La piel de animales de gran tamaño tarda más tiempo en digerir. Compruebe la digestión después de 30 minutos, y luego cada 10 min. Cuando la digestión de la piel se haya completado, los medios de comunicación se vuelve turbia y fragmentos de piel separados unos de otros, y los bordes de las piezas se convierten en "confusos". La digestión de pulmón debe ser parado cuando los pulmones cambian de color fragmentos de rojo a blanco y empezar a formar las fibras pegajosas.
  5. Pipeta la solución que contiene fragmentos de tejido de arriba abajo para romper los terrones. Transferir la solución a un tubo estéril de 50 ml. Si los fragmentos se mueven fácilmente a través del corte de una pipeta de 10 ml y la digestión se hace bien. Lavar el vaso tres veces con 10 ml de agua tibia DMEM/F12 los medios de comunicación con FBS al 15%, antibiótico / antimicótico 1X y añadir los medios de comunicación en el tubo de 50 ml con fragmentos de tejido. Cierre el tubo de 50 ml y mezclar por inversión varias veces. El FBS en los medios de comunicación se detendrá la digestión Liberase.
  6. Giran a 524 g en una centrífuga de la cultura basculante tejido durante 5 min. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 10 ml de agua tibia DMEM/F12 los medios de comunicación con FBS al 15%, 1X antibiótico / antimicótico. Pipeta con la suspensiónla máxima fuerza para romper las piezas de tejido.
  7. Añadir otro 30 ml de DMEM/F12 los medios de comunicación con FBS al 15%, 1X antibiótico / antimicótico, mezclar y centrifugar a 524 g en una centrífuga de la cultura basculante tejido durante 5 min. Repetir una vez más para eliminar los restos de Liberase.
  8. Resuspender el precipitado en 10 ml de DMEM/F12 los medios de comunicación con FBS al 15%, 1X antibiótico / antimicótico y la transferencia a un plato de cultivo de 10 cm de tejido y colocarlo en un cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2, el 3% O 2 .
  9. Revise las placas de todos los días para los fibroblastos y el color de los medios de comunicación. Si el aislamiento se ha realizado correctamente, los fibroblastos se arrastran fuera de los fragmentos de tejido y se adhieren a la placa (Figura 1). Los fibroblastos comienzan a salir de fragmentos de tejido dentro de 2-5 días.
  10. Si el color de los medios de comunicación cambia a amarillo, lo que indica una posible contaminación o el hacinamiento de las celdas. Examinar las placas bajo el microscopio a gran aumento. Si las bacterias, hongos o parásitos están presentes descartar las placas (esto no suele ser un problema con los animales de laboratorio, sin embargo puede ocurrir cuando las muestras se recogen de la naturaleza). Si no hay contaminación está presente, pero los medios de comunicación cambió de color, esto es causado por muchas células o fragmentos de tejido demasiados colocado en el mismo plato. Si más del 60% de la placa está cubierto por los fibroblastos adjunto, cambie los medios de comunicación en la placa y la transferencia de los fragmentos de tejido para una nueva placa con los nuevos medios. Si no los fibroblastos muchos unido a la placa, cambiar los medios de comunicación y dividir las piezas de tejido a un 2-4 placas.
  11. Después de 7 días, si los medios de comunicación no se había modificado anteriormente, el cambio de los medios y la transferencia de los fragmentos de tejido para una nueva placa con los nuevos medios.
  12. Se incuban las células y fragmentos de tejido durante 7 días. El día 14 todos los fibroblastos viables han salido los fragmentos de tejido.
  13. Después de 14 días desde el inicio de la celda de aislamiento, desechar los viejos medios y fragmentos de tejido, las células de la cosecha y la placa en un plato nuevo en 5x10 5 células / EMEM placa con FBS al 15%, 1X penicilina / estreptomicina, aminoácidos no esenciales y sodio piruvato. Los medios de comunicación EMEM apoyará el crecimiento de los fibroblastos tipos de células y otros sólo se mueren o dejan de proliferar.
  14. Después de llegar a las células del 80-90% de confluencia, congelar una parte alícuota de las células para su uso futuro.
  15. Continuar cultivando las células de dividir a 5x10 5 células / placa cuando las células alcanzan el 80-90% de confluencia.

4. Resultados representante

Fibroblastos normales son células grandes con protuberancias prominentes (lamellipodia) (Figura 2). Fibroblastos crecen en una monocapa. Una cultura sana de crecimiento contiene células 10.1% en la etapa M, reconocidos como detenidos células elevada sobre la superficie de la placa, pero no separado de la placa (Figura 3). Por lo general, un plato de 10 cm sembrados con 5x10 5 células confluentes se convierte en 3-4 días. El tiempo de duplicación varía mucho entre las especies, y puede ser mayor para algunas de las especies de roedores de larga duración 1. Cuando las células se llenan de una placa que detener la proliferación en la fase G1. Plato típico confluentes de fibroblastos contiene una capa apretada de las células (Figura 4). Cuando las células llegan al 90% de confluencia que están listos para partir. Si lo desea, las células se pueden mantener en una placa confluente detenidos durante largos períodos de tiempo con cambios regulares de medios (una o dos veces a la semana).

Figura 1
Figura 1. Aislamiento de fibroblastos de piel de ratón (A) y pulmón (B). El medio se cambió para eliminar las células sueltas y escombros antes de tomar las imágenes en el día 7.

Figura 2
Figura 2. Fibroblastos de ratón de pulmón.

Figura 3
Figura 3. Un campo de fibroblastos de ratón con células de M-etapa, fotografiado con un aumento de 10 veces.

Figura 4
Figura 4. Una placa confluente de fibroblastos de ratón, fotografiado con un aumento de 10 veces.

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Discussion

Normal de los fibroblastos primarios ofrecen una excelente alternativa para establecer líneas celulares de cáncer en la investigación biológica. Una ventaja importante de los fibroblastos, es que no son portadores de mutaciones en oncogenes y los supresores de tumores y mantener intactos los puestos de control del ciclo celular. Esto hace que los fibroblastos normales de un sistema preferido para los estudios de la regulación del ciclo celular, reparación del ADN y la apoptosis. El protocolo aquí descrito proporciona una sencilla receta para el aislamiento y el mantenimiento de los fibroblastos primarios. Este protocolo se utilizó para aislar con éxito fibroblastos de más de 20 especies de roedores.

Es importante para mantener la esterilidad en todo momento cuando se trabaja con cultivos celulares para evitar la contaminación. Si el laboratorio también las culturas agresivas líneas celulares de cáncer, como las células HeLa, fibroblastos debe ser manejado por separado de las células cancerosas. Es preferible tener una campana de designados y vivero de cultivos primarios.

Es preferible mantener cultivos primarios de células de concentración de oxígeno fisiológicas del 3%. Atmosférica (20%) de oxígeno reduce la vida útil de las culturas y aumenta el estrés oxidativo. Fibroblastos de ratón son sensibles al estrés oxidativo y senescencia o entrar en crisis dentro de unos 14 duplicaciones de la población cuando se mantiene en 20% (la atmósfera) de oxígeno. Fibroblastos de ratón se puede mantener indefinidamente a las 2 de oxígeno del 3%.

Siempre mantenga un registro del número de duplicación de la población de las culturas. Especies de gran tamaño (masa corporal superior a 8.000 g) son propensos a exhibir la senescencia replicativa, y tendrá una duración limitada en la cultura, incluso en un 3% de oxígeno. Las células de las especies más pequeñas, como los ratones y las ratas, que proliferan de forma indefinida en el 3% de oxígeno, pero con el tiempo pueden llegar a ser aneuploides. Si es posible, comenzar los experimentos con células en duplicación de la población de bajos.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Steven Austad para que nos proporciona la primera versión de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH y la Ellison Medical Foundation de VG y AS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 media Invitrogen 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Invitrogen 01437-036 The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic Invitrogen 15420-096
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Liberase TM Research Grade Roche 05401127001 Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media ATCC 30-203 The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel Multiple suppliers
Three Gas Control incubator Forma or Heraeus

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References

  1. Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
  2. Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).

Comments

29 Comments

  1. Very helpful protocol. Got it working at the very first try, Would highly recommend the protocol.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 14, 2012 - 5:10 PM
  2. I have recently isolated fibroblasts from fresh fibrotic human lung. I used collagenase and plated the cells via your protocol. the cells seem to be of ² populations: one is long (²0% of plate) typical of fibroblast but the other cells are round. They look like they just started to adhere to the plate. What cells could these be? Is this happen often? COuld they be a subset of fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 4, 2012 - 9:33 AM
  3. Hi
    The round cells are epithelial cells that always accompany lung fibroblast isolation. These cells will just float. After you switch the media to EMEM (mentioned in Step 13) and start splitting the fibroblasts, these cells will go away.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:11 PM
  4. I have used your protocol successfully before on human lung tissue. However this time, the majority of our cells were epithelial- look very much like keritanocytes. Is there something we could do to only keep the fibroblasts growing- change to MEM media?
    Also, the next time we try this protocol, is there anything we can do to not get so many epithelial cells?WIll be happy for any suggestions. Thanks.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 5, 2012 - 8:14 AM
  5. Hi Barbara,
    We always get the round epithelial cells during our lung fibroblast isolation too. When you switch to EMEM media and start splitting the fibroblasts, they will be selected for and the epithelial cells will be lost.
    Next time you try the protocol, you can use EMEM media for the whole isolation procedure instead of DMEM/F1² to minimize the epithelial cells you get. But the trade-off is that the efficiency of isolation might decrease. Good luck.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:15 PM
  6. A note from the authors:
    Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3, they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 054011²7001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:31 PM
  7. Thank you so much for your reply. I split them yesterday and changed the media to MEM.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 6, 2012 - 7:35 AM
  8. What is the best way to remove tissue peices on day 7? Especially with the larger tissue peices, ones that you can clearly see, produce more epithelial cells, where as the small peices (as in your pictures) produce mostly pure fibroblasts. Also, do you transplant the tissues on day 7 regardless of the confluency of your plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:59 AM
  9. On day 7, we gently aspirate the supernatant (with the tissue pieces) with a pipette, transfer it to a new plate and provide the original plate with fresh media. In this way, the small pieces attached to the plate are not disturbed and the other tissue debris with the potential to give out more fibroblasts can do so on a new plate.
    Also, yes, it is a good idea to transfer the tissues on a new plate on day 7.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 3:43 PM
  10. When you trypsinize initially, do you do this aggressively and try to remove all the cells from the plate (fibroblast and epithelial)? I have found that the fibroblasts seem to trypsinize first and can thus help to purify the culture, but my cell yield is significantly smaller (too small). Thank you for you help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:05 PM
  11. The first trypsinization dŒs not have to be aggressive. As long as all the fibroblasts are off the plate and floating, we dont worry about the epithelial cells. They usually disappear after the first couple of passages with EMEM media. The fibroblasts are fast growing and will be selected for with passaging.
    To improve the yield, I would suggest ² things in the isolation procedure : Mincing the tissue very well and incubating the tissue pieces for a longer time in the Collagenase enzyme (while taking care to avoid over-digestion).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:18 PM
  12. You recommend storing 0.5 mL aliquots of Blendzyme at ²8 units/ml (i.e. 14 wunsch units per aliquot) but you recommend using 0.14 units/ml in 10 mls of media, or 1.4 wunsch units per digestion) This implies each aliquot is for 10 digestions. Is this correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 10:59 AM
  13. Yes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 11:04 AM
  14. After 14 days I achieve confluence and then split into fibroblast specific growth media and these cells have no trouble reaching 80-90%. When I subsequently split this population the cells senesce. Is there any obvious reason for this? It would think that 14 days of growth would cause a primary cell to senesce but your protocol suggests that I should be able to continue splitting my cells and further purfy in the process. I appreciate your help!

    Reply
    Posted by: Justin K.
    May 4, 2012 - 10:49 AM
  15. Hi Justin
    Are these mouse fibroblasts? Are you growing them in ²0% oxygen? If you are, then they will senesce. We grow all our cells in 3% oxygen and 5% CO² conditions.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 9, 2012 - 3:06 PM
  16. Hi, one of the first steps recommends to euthanize the animal and store it at 4oC. Do we complete this step even if we plan on using the animal right away? If so, for how long do we store the animal at 4oC? Is putting it on ice also acceptable?

    Reply
    Posted by: J A.
    May 13, 2012 - 7:49 PM
  17. No..It is best to use the animal right away. The 4C step is only if circumstances make it impossible to process it right away. In this case, we store the corpse at 4C(better) or on ice(in case of wild caught animals) for not more than ²4 hours.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 13, 2012 - 7:57 PM
  18. Also, another question I have is about the tissue fragments in the media. When would be the best time to remove them from the cells and replace them with media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 14, 2012 - 12:42 AM
  19. It depends. Usually, if the media turns yellow a few days after isolation and if there aren't enough fibroblasts on the plate, we collect the fragments, suspend them in fresh media and plate them back. As the protocol says, day 14 is when we usually get rid of the tissue fragments.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 14, 2012 - 2:51 PM
  20. Hi,

    I a couple of questions about the reagents used. My first question is about the liberase enzyme used. I noticed that the liberase enzyme 3 from Roche has been discontinued. Would you recommend replacing it with the Liberase TM Research Grade medium enzyme with Thermolysin? If so, would you recommend keeping the concentration the same (.14 U/mL)? My second question is about the Fetal Bovine Serum used in this experiment. I understand that you recommend using the Qualified Fetal Bovine Serum because it has been shown to support the growth of primary fibroblast cultures. In my lab we use heat-inactivated FBS. Would you recommend me switching from heat-inactivated to qualified FBS?

    Thank you in advance for your help :)

    Reply
    Posted by: J A.
    May 21, 2012 - 11:25 AM
  21. Yes. We now use TM instead of Liberase 3 with the same concentration.
    I understand that heat-inactivation of FBS is usually done to get rid of complement factors. I don't know how critical it is for your experiments to do this but we never use heat-inactivated serum.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 3:06 PM
  22. I also have a question about plating the tissue into the media. ²4- hours after I plated my tissue pieces into the media, I looked at my cultures under the microscope and saw little round cells that adhered to the plate. I understand that the protocol mentions that fibroblasts do not typically exit the tissue for at least 48 hours, and the round epithelial cells that assist the growth of fibroblasts usually float through the media. I was just wondering if seeing these cells after ²4 hours is normal.

    Reply
    Posted by: J A.
    May 24, 2012 - 12:59 PM
  23. Yes it is normal, more for lung fibroblast isolation. Once the fibroblasts start growing, the round cells will be selected against.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 2:57 PM
  24. Hi,

    I was wondering what concentration of trypsin EDTA you used? I use trypsin 0.²5% trypsin EDTA to remove my cells during splitting (after an incubation time of 4 minutes). After trypsinizing the cells for 4 minutes, I have noticed that less than half of them are detached from the plate. I am afraid to leave the cells in trypsin for longer than 4 minutes because I do not want to damage them. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: J A.
    July 18, 2012 - 1:05 AM
  25. We use Red trypsin with 0.²5% EDTA..Its very strong and we only treat cells with it for 1-² minutes. So you wash/rinse the plate with PBS after aspirating media, before adding trypsin? Because the FBS in the media inhibits trypsin activity and if the plates are not washed with PBS first, trypsin cannot act properly.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    July 18, 2012 - 11:28 AM
  26. Thank you for such detailed procedure. I am curious is it possible that the keratinocytes also exist in the fibroblast culture? Thank you.

    Reply
    Posted by: Hua-Ling C.
    September 19, 2012 - 3:16 AM
  27. Dear all, my adult fibroblasts (GFP positive C67Bl/6 mice) are not growing very well (DMEM, high glucose, Na-pyrovate, Pen/Strp, 15%FBS). Do you have any suggestions about what I could add to the media to increase proliferation? Thanks a lot. Gunnar

    Reply
    Posted by: Gunnar P.
    March 1, 2013 - 2:03 PM
  28. Can this protocol be adapted to isolate cancer-associated fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Wei L.
    July 9, 2013 - 2:59 PM
  29. Do you know what is the best marker to check the purity of mouse lung fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Jenny t.
    July 15, 2014 - 5:02 PM

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