Estabelecer culturas de fibroblastos adultos primária de roedores

Biology

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Summary

Este artigo descreve um protocolo para isolamento e manutenção de culturas de fibroblastos primários da pele e do tecido pulmonar dos roedores silvestres.

Cite this Article

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Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).

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Abstract

A importância de usar pilhas, ao invés de linhas celulares de cancro, para estudos biológicos está se tornando amplamente reconhecida. Pilhas são preferidas em estudos de células a apoptose ciclo de controle, e reparo do DNA, como as células cancerosas carregam mutações em genes envolvidos nestes processos. Pilhas não podem ser cultivadas indefinidamente devido ao início da senescência replicativa ou aneuploidization. Assim, novas culturas devem ser estabelecidas regularmente. O procedimento para o isolamento de fibroblastos de roedores embrionárias está bem estabelecida, mas isolar culturas de fibroblastos adultos, muitas vezes representa um desafio. Fibroblastos de roedores adultos isolados a partir de modelos do rato da doença humana pode ser um controle preferidos quando comparando-os com fibroblastos de pacientes humanos. Além disso, os fibroblastos adultos são o único material disponível quando se trabalha com roedores silvestres onde as fêmeas grávidas não podem ser facilmente obtidos. Aqui nós fornecemos um protocolo para isolamento e cultura de fibroblastos da pele de roedores adultos e os pulmões. Nós usamos este procedimento com sucesso para isolar os fibroblastos de mais de vinte espécies de roedores a partir de ratos de laboratório e em ratos de roedores silvestres como o castor, porco-espinho, e esquilo.

Protocol

1. Antes de Começar

  1. Esterilizar a tesoura e uma pinça com etanol 70%.
  2. Lugar agitador magnético pequeno dentro de um copo 30 mL, cobrir com duas camadas de papel alumínio, e autoclave.
  3. Prepare a 28 unidades Wunsch / mL solução estoque de Liberase Blendzyme 3 em água estéril. Faça alíquotas 0,5 mL e congelar a -20 ° C. Descongelar uma alíquota de novo antes de cada utilização. A solução pode parecer turvo após o descongelamento. Vortex a solução até que fique claro.
  4. Aqueça o meio de cultura celular.

2. Preparação de amostras de animais

Cuidado: animais selvagens podem conter agentes patogênicos, como um vírus da raiva. Sempre estar ciente de abrir farelos.

  1. Eutanásia do animal e colocar a carcaça a 4 ° C. O melhor é usar a carcaça de imediato, no entanto, se isso não é prático, como se os animais são recolhidos no campo, as carcaças podem ser usados ​​dentro de 24 horas. Após 24 horas a queda de produção celular.
  2. Dissecar o animal no centro cirúrgico ou na capa químicos (não na capa da cultura de tecidos).
  3. Axilas área é um local conveniente para coletar amostras de pele como a pele das axilas é mais fino, contém menos gordura, ea pele é menos denso. Limpar o local da incisão com etanol 70%. Verifique se o pêlo é embebido com álcool.
  4. Raspar os pêlos ao redor do local da incisão com um bisturi afiado. Raspar uma área maior do que o local da incisão desejada. Tentar minimizar cortes na pele. Pulverizar a área com álcool 70% e deixe secar.
  5. Para coletar uma amostra de pele especial sobre o consumo de um fragmento de aproximadamente 1 cm 2. Beliscar a pele com uma pinça, e cortar com tesoura. Tente não cortar a camada de gordura com a pele, como gordura interfere com a digestão da colagenase. Para coletar as amostras de pulmão, lave a área do peito com etanol 70%, e abra a pele do peito com uma tesoura, fazendo uma incisão em forma de T e puxar as abas para além da pele. Lave a área do músculo abriu com etanol 70% e deixe secar. Cortar a caixa torácica com a pinça estéril e tesoura (use cortadores de osso para animais de maior porte). Uso de técnicas estéreis para evitar a contaminação dos órgãos internos. Não toque os órgãos internos com instrumentos que tocou a pele de animal. Cortar fragmentos de pulmão de aproximadamente 1 cm 2 usando uma pinça e tesouras estéreis.
  6. Fragmentos de tecido lugar em tubos de 50 ml com PBS estéril, para evitar a secagem.
  7. Lavar a parte externa do tubos de 50 ml com fragmentos de tecido com etanol, e levá-los para a capa de cultura de tecidos.
  8. Devidamente dispor de carcaça animal.

3. Células extrair

  1. Transferir os fragmentos de tecido em um prato de 10 centímetros cultura de tecidos utilizando bisturi estéril. Não transferir PBS muito com a amostra.
  2. Corte o tecido em pedaços ~ 1 mm com dois bisturis. Use duas lâminas usando uma tesoura ação a partir do centro e afastamento. Manter o tecido enrolado, não corte pedaço por pedaço. Quando o corte é suficiente a pele se assemelha putty, ele não vai separar em pedaços, mas vai esticar fina. O tecido pulmonar é mais fácil de cortar, e ele irá separar-se em pequenos pedaços.
  3. Usando um bisturi, transferir o tecido cortado em copo mL estéril 30 com barra de agitação estéril. Lave a placa usada para cortar tecido com 10 mL de DMEM/F12 mídia com 0,14 unidades Wunsch / mL Liberase Blendzyme 3, e 1X antibiótico / antimicótico e adicionar a solução para o copo 30 mL com fragmentos de tecido.
  4. Cobrir o copo com papel alumínio estéril e incubar a 37 ° C, mexendo lentamente, por 30 a 90 minutos. A duração da incubação depende do tipo de espécies e tecidos. Tome cuidado para não sobre-digerir o tecido. Melhores rendimentos são obtidos quando fragmentos de tecido ainda estão presentes no final da digestão. Pele demora mais tempo para digerir do que o pulmão. Pele de animais de grande porte leva mais tempo para digerir. Verifique a digestão depois de 30 min, e depois a cada 10 min. Quando a digestão da pele é concluída, a mídia torna-se turva e fragmentos de pele separados uns dos outros, e as bordas das peças tornam-se "fuzzy". Digestão pulmonar deve ser interrompido quando mudam de cor fragmentos de pulmão de vermelho para branco e começar a formar fibras pegajosas.
  5. Solução de pipeta contendo o fragmento de tecido para cima e para baixo para quebrar os aglomerados. Transferir a solução para tubo de 50 mL estéril. Se os fragmentos de mover-se facilmente através do corte da pipeta 10 mL e digestão foi bem feito. Lavar o copo 3 vezes com 10 mL de morno DMEM/F12 media com 15% FBS, 1X antibiótico / antimicótico e adicione os meios de comunicação para o tubo de 50 mL com fragmentos de tecido. Fechar o tubo de 50 mL e misturar por inversão várias vezes. A FBS na mídia vai parar a digestão Liberase.
  6. Giram em 524 g em uma centrífuga balançando cultura balde do tecido por 5 min. Remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 10 mL de morno DMEM/F12 media com 15% FBS, 1X antibiótico / antimicótico. Pipeta com a suspensãoforça máxima para quebrar os pedaços de tecido.
  7. Adicionar outro, 30 mL de DMEM/F12 media com 15% FBS, 1X antibiótico / antimicótico mix, e centrifugar a 524 g em uma centrífuga balançando cultura balde do tecido por 5 min. Repita mais uma vez para remover os vestígios do Liberase.
  8. Ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM/F12 mídia com FBS 15%, 1X antibiótico / antimicótico e transferir para um prato de 10 centímetros cultura de tecidos e coloque em uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C, 5% CO 2, 3% O 2 .
  9. Verifique as placas todos os dias para fibroblastos e cor media. Se o isolamento foi bem-sucedida, fibroblastos rastejar para fora dos fragmentos de tecido e fixe a placa (Figura 1). Os fibroblastos começam a sair fragmentos de tecido dentro de 2-5 dias.
  10. Se a mídia muda de cor para amarelo, indica contaminação em potencial ou a superlotação de celas. Examine as placas sob o microscópio em grandes ampliações. Se as bactérias, fungos ou vermes estão presentes descartar as placas (isso raramente é um problema com animais de laboratório, no entanto pode ocorrer quando as amostras são coletadas na natureza). Se não houver contaminação está presente, mas a mídia mudou de cor, isso é causado por um excesso de células ou fragmentos de tecido demais colocados no mesmo prato. Se mais de 60% da placa é coberta por fibroblastos anexa, alterar a mídia sobre a placa e transferir os fragmentos de tecido para um novo prato com a nova mídia. Se não fibroblastos muitos ligados à placa, alterar a mídia e dividir os pedaços de tecido para um 2-4 pratos.
  11. Após 7 dias, se a mídia não tivesse sido alterado anteriormente, alterar a mídia e transferir os fragmentos de tecido para um novo prato com as novas mídias.
  12. Incubar as células e fragmentos de tecido para um adicional de 7 dias. Por 14 dias todos os fibroblastos viáveis ​​tenham saído os fragmentos de tecido.
  13. Após 14 dias desde o início do isolamento de células, descartar a velha mídia e fragmentos de tecido, a colheita das células e placa-los em um novo prato de 5x10 5 células / EMEM placa com FBS 15%, 1X Penicilina / Estreptomicina, não aminoácidos essenciais , sódio e piruvato. EMEM mídia vai apoiar o crescimento de fibroblastos tipos de células e outros só vai morrer ou parar de proliferar.
  14. Depois que as células chegar confluência de 80-90%, congelar uma alíquota de células para utilização futura.
  15. Continue cultivando as células, dividindo-os em 5x10 5 células / placa quando as células atingem confluência de 80-90%.

4. Resultados representante

Fibroblastos normais são células grandes com saliências proeminentes (lamellipodia) (Figura 2). Fibroblastos crescer em uma monocamada. Uma cultura saudável e em crescimento contém células 1-10% na fase M, reconhecido como arredondado células elevados sobre a superfície da placa, mas não retirado da placa (Figura 3). Tipicamente, um prato de 10 cm semeados com 5x10 5 células se torna confluente em 3-4 dias. O tempo de duplicação varia muito entre as espécies, e pode ser maior para algumas das espécies de vida longa de roedores 1. Quando as células encher um prato eles prendem a proliferação na fase G1. Prato típico confluentes de fibroblastos contém uma camada de células hermeticamente embalados (Figura 4). Quando as células atingem confluência de 90% que eles estão prontos para dividir. Se desejado, as células podem ser mantidos em uma placa presa confluentes por longos períodos de tempo com mudanças regulares de mídia (uma ou duas vezes por semana).

Figura 1
Figura 1. Isolamento de fibroblastos da pele do rato (A) e pulmão (B). A mídia foi mudado para remover as células solto e detritos antes de tirar as fotos no dia 7.

Figura 2
Figura 2. Fibroblastos de pulmão de rato.

Figura 3
Figura 3. Um campo de fibroblastos de rato com células em estágios M, fotografadas com ampliação de 10x.

Figura 4
Figura 4. Uma placa confluentes de fibroblastos de rato, fotografadas com ampliação de 10x.

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Discussion

Fibroblastos normais primárias oferecem uma excelente alternativa para as linhas de células de câncer estabelecido na pesquisa biológica. Uma vantagem importante de fibroblastos é que eles não carregam mutações em oncogenes e supressores de tumor e manter postos de controle do ciclo celular intacto. Isso faz com que fibroblastos normais de um sistema preferido para os estudos de regulação do ciclo celular, reparo do DNA e apoptose. O protocolo aqui descrito fornece uma receita simples para o isolamento e manutenção de fibroblastos primários. Este protocolo foi utilizado com sucesso para isolar os fibroblastos de mais de 20 espécies de roedores.

É importante manter a esterilidade em todas as vezes quando se trabalha com culturas de células para evitar a contaminação. Se o laboratório também culturas linhas de câncer agressivo de células, como células HeLa, fibroblastos deverão ser tratadas separadamente a partir de células de câncer. É preferível ter um capuz designado e incubadora de culturas primárias.

É preferível manter culturas celulares primárias na concentração de oxigênio fisiológicos de 3%. Atmosférica (20%) de oxigênio reduz expectativa de vida de culturas e aumenta o estresse oxidativo. Fibroblastos de rato são sensíveis ao estresse oxidativo e senesce ou digite crise dentro ~ 14 duplicações população, quando mantida em 20% (atmosférica) de oxigênio. Fibroblastos de rato pode ser mantida indefinidamente, 2 3% de oxigénio.

Sempre manter o registro do número de duplicação da população das culturas. Espécies de grande porte (massa corporal acima de 8.000 g) são propensos a apresentar senescência replicativa, e terá uma duração limitada na cultura, mesmo com 3% de oxigénio 1. Células a partir de espécies menores, como ratos e camundongos, irão proliferar indefinidamente em 3% de oxigénio, mas pode eventualmente tornar-se aneuplóides. Se possível, começar os experimentos utilizando células, à duplicação populacional.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Steven Austad para fornecer-nos com a primeira versão do presente protocolo. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH e da Ellison Medical Foundation para VG e AS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 media Invitrogen 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Invitrogen 01437-036 The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic Invitrogen 15420-096
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Liberase TM Research Grade Roche 05401127001 Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media ATCC 30-203 The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel Multiple suppliers
Three Gas Control incubator Forma or Heraeus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
  2. Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).

Comments

29 Comments

  1. Very helpful protocol. Got it working at the very first try, Would highly recommend the protocol.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 14, 2012 - 5:10 PM
  2. I have recently isolated fibroblasts from fresh fibrotic human lung. I used collagenase and plated the cells via your protocol. the cells seem to be of ² populations: one is long (²0% of plate) typical of fibroblast but the other cells are round. They look like they just started to adhere to the plate. What cells could these be? Is this happen often? COuld they be a subset of fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 4, 2012 - 9:33 AM
  3. Hi
    The round cells are epithelial cells that always accompany lung fibroblast isolation. These cells will just float. After you switch the media to EMEM (mentioned in Step 13) and start splitting the fibroblasts, these cells will go away.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:11 PM
  4. I have used your protocol successfully before on human lung tissue. However this time, the majority of our cells were epithelial- look very much like keritanocytes. Is there something we could do to only keep the fibroblasts growing- change to MEM media?
    Also, the next time we try this protocol, is there anything we can do to not get so many epithelial cells?WIll be happy for any suggestions. Thanks.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 5, 2012 - 8:14 AM
  5. Hi Barbara,
    We always get the round epithelial cells during our lung fibroblast isolation too. When you switch to EMEM media and start splitting the fibroblasts, they will be selected for and the epithelial cells will be lost.
    Next time you try the protocol, you can use EMEM media for the whole isolation procedure instead of DMEM/F1² to minimize the epithelial cells you get. But the trade-off is that the efficiency of isolation might decrease. Good luck.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:15 PM
  6. A note from the authors:
    Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3, they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 054011²7001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:31 PM
  7. Thank you so much for your reply. I split them yesterday and changed the media to MEM.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 6, 2012 - 7:35 AM
  8. What is the best way to remove tissue peices on day 7? Especially with the larger tissue peices, ones that you can clearly see, produce more epithelial cells, where as the small peices (as in your pictures) produce mostly pure fibroblasts. Also, do you transplant the tissues on day 7 regardless of the confluency of your plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:59 AM
  9. On day 7, we gently aspirate the supernatant (with the tissue pieces) with a pipette, transfer it to a new plate and provide the original plate with fresh media. In this way, the small pieces attached to the plate are not disturbed and the other tissue debris with the potential to give out more fibroblasts can do so on a new plate.
    Also, yes, it is a good idea to transfer the tissues on a new plate on day 7.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 3:43 PM
  10. When you trypsinize initially, do you do this aggressively and try to remove all the cells from the plate (fibroblast and epithelial)? I have found that the fibroblasts seem to trypsinize first and can thus help to purify the culture, but my cell yield is significantly smaller (too small). Thank you for you help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:05 PM
  11. The first trypsinization dŒs not have to be aggressive. As long as all the fibroblasts are off the plate and floating, we dont worry about the epithelial cells. They usually disappear after the first couple of passages with EMEM media. The fibroblasts are fast growing and will be selected for with passaging.
    To improve the yield, I would suggest ² things in the isolation procedure : Mincing the tissue very well and incubating the tissue pieces for a longer time in the Collagenase enzyme (while taking care to avoid over-digestion).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:18 PM
  12. You recommend storing 0.5 mL aliquots of Blendzyme at ²8 units/ml (i.e. 14 wunsch units per aliquot) but you recommend using 0.14 units/ml in 10 mls of media, or 1.4 wunsch units per digestion) This implies each aliquot is for 10 digestions. Is this correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 10:59 AM
  13. Yes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 11:04 AM
  14. After 14 days I achieve confluence and then split into fibroblast specific growth media and these cells have no trouble reaching 80-90%. When I subsequently split this population the cells senesce. Is there any obvious reason for this? It would think that 14 days of growth would cause a primary cell to senesce but your protocol suggests that I should be able to continue splitting my cells and further purfy in the process. I appreciate your help!

    Reply
    Posted by: Justin K.
    May 4, 2012 - 10:49 AM
  15. Hi Justin
    Are these mouse fibroblasts? Are you growing them in ²0% oxygen? If you are, then they will senesce. We grow all our cells in 3% oxygen and 5% CO² conditions.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 9, 2012 - 3:06 PM
  16. Hi, one of the first steps recommends to euthanize the animal and store it at 4oC. Do we complete this step even if we plan on using the animal right away? If so, for how long do we store the animal at 4oC? Is putting it on ice also acceptable?

    Reply
    Posted by: J A.
    May 13, 2012 - 7:49 PM
  17. No..It is best to use the animal right away. The 4C step is only if circumstances make it impossible to process it right away. In this case, we store the corpse at 4C(better) or on ice(in case of wild caught animals) for not more than ²4 hours.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 13, 2012 - 7:57 PM
  18. Also, another question I have is about the tissue fragments in the media. When would be the best time to remove them from the cells and replace them with media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 14, 2012 - 12:42 AM
  19. It depends. Usually, if the media turns yellow a few days after isolation and if there aren't enough fibroblasts on the plate, we collect the fragments, suspend them in fresh media and plate them back. As the protocol says, day 14 is when we usually get rid of the tissue fragments.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 14, 2012 - 2:51 PM
  20. Hi,

    I a couple of questions about the reagents used. My first question is about the liberase enzyme used. I noticed that the liberase enzyme 3 from Roche has been discontinued. Would you recommend replacing it with the Liberase TM Research Grade medium enzyme with Thermolysin? If so, would you recommend keeping the concentration the same (.14 U/mL)? My second question is about the Fetal Bovine Serum used in this experiment. I understand that you recommend using the Qualified Fetal Bovine Serum because it has been shown to support the growth of primary fibroblast cultures. In my lab we use heat-inactivated FBS. Would you recommend me switching from heat-inactivated to qualified FBS?

    Thank you in advance for your help :)

    Reply
    Posted by: J A.
    May 21, 2012 - 11:25 AM
  21. Yes. We now use TM instead of Liberase 3 with the same concentration.
    I understand that heat-inactivation of FBS is usually done to get rid of complement factors. I don't know how critical it is for your experiments to do this but we never use heat-inactivated serum.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 3:06 PM
  22. I also have a question about plating the tissue into the media. ²4- hours after I plated my tissue pieces into the media, I looked at my cultures under the microscope and saw little round cells that adhered to the plate. I understand that the protocol mentions that fibroblasts do not typically exit the tissue for at least 48 hours, and the round epithelial cells that assist the growth of fibroblasts usually float through the media. I was just wondering if seeing these cells after ²4 hours is normal.

    Reply
    Posted by: J A.
    May 24, 2012 - 12:59 PM
  23. Yes it is normal, more for lung fibroblast isolation. Once the fibroblasts start growing, the round cells will be selected against.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 2:57 PM
  24. Hi,

    I was wondering what concentration of trypsin EDTA you used? I use trypsin 0.²5% trypsin EDTA to remove my cells during splitting (after an incubation time of 4 minutes). After trypsinizing the cells for 4 minutes, I have noticed that less than half of them are detached from the plate. I am afraid to leave the cells in trypsin for longer than 4 minutes because I do not want to damage them. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: J A.
    July 18, 2012 - 1:05 AM
  25. We use Red trypsin with 0.²5% EDTA..Its very strong and we only treat cells with it for 1-² minutes. So you wash/rinse the plate with PBS after aspirating media, before adding trypsin? Because the FBS in the media inhibits trypsin activity and if the plates are not washed with PBS first, trypsin cannot act properly.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    July 18, 2012 - 11:28 AM
  26. Thank you for such detailed procedure. I am curious is it possible that the keratinocytes also exist in the fibroblast culture? Thank you.

    Reply
    Posted by: Hua-Ling C.
    September 19, 2012 - 3:16 AM
  27. Dear all, my adult fibroblasts (GFP positive C67Bl/6 mice) are not growing very well (DMEM, high glucose, Na-pyrovate, Pen/Strp, 15%FBS). Do you have any suggestions about what I could add to the media to increase proliferation? Thanks a lot. Gunnar

    Reply
    Posted by: Gunnar P.
    March 1, 2013 - 2:03 PM
  28. Can this protocol be adapted to isolate cancer-associated fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Wei L.
    July 9, 2013 - 2:59 PM
  29. Do you know what is the best marker to check the purity of mouse lung fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Jenny t.
    July 15, 2014 - 5:02 PM

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