Etablera primärkulturer Vuxen Fibroblast från gnagare

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denna artikel beskriver ett protokoll för isolering och underhåll av primära fibroblast kulturer från hud och lungvävnad hos vilda gnagare.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vikten av att använda galvaniska element, snarare än cancer cellinjer, för biologiska studier blir allmänt erkänd. Primärceller är att föredra i studier av kontrollen av cellcykeln, apoptos, och DNA-reparation, som cancerceller bär mutationer i gener som är inblandade i dessa processer. Primärceller kan inte odlas på obestämd tid på grund av uppkomsten av replikationsförmåga åldrande eller aneuploidization. Därför, nya kulturer måste fastställas regelbundet. Förfarandet för isolering av gnagare embryonala fibroblaster är väl etablerad, men isolera vuxna fibroblast kulturer ofta en utmaning. Vuxen gnagare fibroblaster isolerade från musmodeller för mänskliga sjukdomar kan vara en god kontroll man jämför dem med fibroblaster från mänskliga patienter. Dessutom vuxna fibroblaster är den enda tillgängliga materialet när man arbetar med vilda gnagare där dräktiga honor inte enkelt kan erhållas. Här ger vi ett protokoll för isolering och odling av vuxna fibroblaster från gnagare hud och lungor. Vi använde den här proceduren framgångsrikt att isolera fibroblaster från över tjugo gnagare från laboratorie-möss och råttor till vilda gnagare som bäver, piggsvin och ekorre.

Protocol

1. Innan du börjar

  1. Sterilisera sax och pincett med 70% etanol.
  2. Lägg små magnetomrörare inne i en 30 ml bägare, täck med två lager folie och autoklav.
  3. Förbered en 28 Wunsch enheter / ml stamlösning av Liberase Blendzyme 3 i sterilt vatten. Gör 0,5 mL alikvoter och fryser vid -20 ° C. Tina en ny alikvot före varje användning. Lösningen kan visas grumlig efter upptining. Vortex lösningen tills det blir klart.
  4. Värm upp i media cellkultur.

2. Animal Provberedning

Varning: vilda djur kan innehålla patogener som en rabiesvirus. Alltid vara medveten om öppna vassa föremål.

  1. Euthanize djuret och placera kroppen i 4 ° C. Det är bäst att använda kroppen direkt, men om detta inte är praktiskt t.ex. om djur samlas in på fältet, kan slaktkroppar användas inom 24 timmar. Efter 24 timmar i cellen avkastningen minskar.
  2. Dissekera djuret i den kirurgiska svit eller i kemiska huva (inte i vävnadsodling huva).
  3. Armhålan är en bekväm plats för att samla in huden prover armarna hud är tunnare, innehåller mindre fett, och pälsen är mindre tät. Rengör snitt platsen med 70% etanol. Se till att päls är blöt med etanol.
  4. Raka pälsen runt snittet plats med en vass skalpell. Raka ett större område än den önskade snitt webbplatsen. Försök att minimera nedskärningar i huden. Spraya området med 70% etanol och låt den torka.
  5. Att samla ett hudprov punktskatt ett fragment av ca 1 cm 2. Nyp ihop huden med vävnad pincett och klipp med sax. Försök att inte klippa fettlager med huden, som fett stör kollagenas matsmältningen. Att samla lungan prover, tvätta bröstet med 70% etanol, och öppna huden på bröstet med en sax genom att göra en T-form snitt och dra isär flikarna i huden. Tvätta öppnade muskeln området med 70% etanol och låt torka. Skär bröstkorgen med hjälp av steril pincett och sax (använd ben saxar för större djur). Använd sterila tekniker för att undvika kontaminering av inre organ. Rör inte de inre organen med instrument som rörde djuret päls. Klipp lunga fragment av ca 1 cm 2 med hjälp av steril pincett och sax.
  6. Placera vävnad fragment i 50 ml rör med steril PBS för att undvika uttorkning.
  7. Tvätta utsidan av 50 ml rör med vävnad fragment med etanol, och ta dem till vävnadsodling huven.
  8. Kassera djurkropp.

3. Extrahera celler

  1. Överför vävnaden fragment i en 10 cm vävnadsodling maträtt med steril skalpell. Överför inte alltför mycket PBS med provet.
  2. Skär vävnaden i ~ 1 mm bitar med två skalpeller. Använd två blad med hjälp av en sax åtgärd från mitten och dra isär. Håll vävnaden balled upp, klipp inte bit för bit. När den skärande räcker huden liknar spackel, kommer det inte separera i bitar, men kommer att sträcka tunn. I lungvävnad är lättare att skära, och det kommer att skilja i små bitar.
  3. Med hjälp av en skalpell, överföra skär vävnaden i sterila 30 ml bägare med sterilt rör bar. Tvätta plattan används för att skära vävnad med 10 mL DMEM/F12 media med 0,14 Wunsch enheter / ml Liberase Blendzyme 3 och 1X antibiotika / antimykotika, och tillsätt lösningen till 30 ml bägare med vävnad fragment.
  4. Täck bägaren med steril folie och inkubera vid 37 ° C under omrörning långsamt, för 30 till 90 minuter. Längden på inkubationstiden beror på art och vävnadstyp. Se till att inte över-smälta vävnad. Bästa avkastningen erhålls när vävnad fragment fortfarande finns kvar i slutet av matsmältningen. Hud tar längre tid att smälta än lungan. Hud från stora djur, tar längre tid att smälta. Kontrollera matsmältningen efter 30 min, och därefter var 10 min. När huden matsmältningen är klar, blir media molnighet och fragment hud skilda från varandra, och kanterna på bitarna blir "luddiga". Lung matsmältningen bör avslutas när lungorna fragment ändrar färg från rött till vitt och börja bilda klibbiga fibrer.
  5. Pipettera lösningen innehållande väv fragment upp och ner för att bryta klumpar. Överför lösningen till sterila 50 ml tub. Om fragmenten rör sig lätt genom 10 ml pipett skärning och matsmältningen gjordes bra. Skölj bägaren 3 gånger med 10 ml varmt DMEM/F12 media med 15% FBS, 1X antibiotika / antimykotika och lägga till media till 50 ml tub med vävnad fragment. Stäng 50 ml tub och blanda genom inversion några gånger. Den FBS i media kommer att sluta Liberase matsmältningen.
  6. Snurra på 524 g på en svängig hink vävnadsodling Centrifugera i 5 minuter. Avlägsna supernatanten. Återsuspendera pelleten i 10 ml varmt DMEM/F12 media med 15% FBS, 1X antibiotika / antimykotika. Pipettera suspensionen medmaximal kraft att bryta vävnaden bitar.
  7. Lägg till ytterligare 30 ml DMEM/F12 media med 15% FBS, 1X antibiotika / antimykotika, blanda och centrifugera vid 524 gi en svängig hink vävnadsodling Centrifugera i 5 minuter. Upprepa en gång till för att ta bort spår av Liberase.
  8. Återsuspendera pelleten i 10 ml DMEM/F12 media med 15% FBS, 1X antibiotika / antimykotika och överför till en 10 cm vävnadsodling skål och lägg i en vävnadsodling inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2, 3% O 2 .
  9. Kontrollera plattorna varje dag för fibroblaster och media färg. Om isoleringen lyckades, fibroblaster krypa ut ur vävnaden fragment och fäster plattan (Figur 1). Den fibroblast börja avsluta vävnad fragment inom 2-5 dagar.
  10. Om media ändrar färg till gult, visar detta eventuella föroreningar eller överbeläggning av celler. Undersök plattorna under mikroskop med hög förstoring. Om bakterier, svampar eller maskar kasta närvarande plattorna (detta är sällan ett problem med försöksdjur, kan dock uppstå när proven tas från naturen). Om ingen smitta finns, men media ändrat färg, detta orsakas av antingen alltför många celler eller för många fragment vävnad placeras i samma maträtt. Om mer än 60% av plåten är täckt av bifogad fibroblaster, ändra media på tallriken och överför vävnaden fragment till en ny platta med de nya medierna. Om inte många fibroblaster fäst plattan, ändra media och dela vävnad bitar till en 2-4 tallrikar.
  11. Efter 7 dagar, om media inte hade ändrats tidigare, ändra medier och överför vävnaden fragment till en ny platta med nya medier.
  12. Inkubera cellerna och fragment vävnad för ytterligare 7 dagar. Efter 14 dagar är alla livskraftiga fibroblaster har lämnat vävnaden fragment.
  13. Efter 14 dagar från början av cellens isolering, kassera den gamla medier och fragment vävnad, skörda celler och platta dem på en ny platta på 5x10 5 celler / platta EMEM med 15% FBS, 1X Penicillin / streptomycin, icke essentiella aminosyror , och natrium pyruvat. EMEM media kommer att stödja tillväxt av fibroblaster bara och andra celltyper dör eller slutar breder ut sig.
  14. Efter att cellerna når 80-90% sammanflödet, frysa en alikvot av celler för framtida bruk.
  15. Fortsätt att odla cellerna genom att dela upp dem på 5x10 5 celler / platta när cellerna når 80-90% sammanflödet.

4. Representativa resultat

Normala fibroblaster är stora celler med framträdande utskjutande delar (lamellipodia) (Figur 2). Fibroblaster växa i en monolager. Ett friskt växande kultur innehåller 1-10% celler i M skede erkännas som avrundas uppåt celler förhöjda över ytan av plattan, men inte loss från plattan (Figur 3). Vanligtvis blir en 10 cm parabolantenn ympats med 5x10 5 celler konfluenta i 3-4 dagar. Fördubblingen varierar kraftigt mellan arter och kan vara större för några av de långlivade gnagare 1. När celler fyller en tallrik de arresterar spridning i G1 skede. Typiska sammanflytande tallrik fibroblaster innehåller ett tätt lager av celler (Figur 4). När cellerna når 90% sammanflödet de är redo för klyvning. Om så önskas kan cellerna upprätthållas på ett gripits konfluenta plåt för längre perioder med regelbundna medier förändringar (en eller två gånger i veckan).

Figur 1
Figur 1. Fibroblast isolering från mus hud (A) och lunga (B). Medierna har ändrats för att avlägsna lös celler och skräp innan man tar bilder på dag 7.

Figur 2
Figur 2. Mus lung fibroblaster.

Figur 3
Figur 3. Ett fält med musfibroblaster innehåller celler i M-stadium, fotograferad vid 10x förstoring.

Figur 4
Figur 4. En sammanflytande tallrik musfibroblaster fotograferad vid 10x förstoring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Normal primära fibroblaster ger ett utmärkt alternativ till etablerade cancercellinjer i biologisk forskning. En viktig fördel med fibroblaster är att de inte bär på mutationer i onkogener och tumör stötvågsfilter och bibehålla intakt checkpoints cellcykeln. Detta gör normala fibroblaster en önskad system för studier av cellcykeln reglering, DNA-reparation, och apoptos. Protokollet som beskrivs här är ett enkelt recept för isolering och underhåll av primära fibroblaster. Detta protokoll har använts för att framgångsrikt isolera fibroblaster från över 20 arter av gnagare.

Det är viktigt att behålla steriliteten vid alla tillfällen när du arbetar med cellkulturer för att undvika kontaminering. Om laboratoriet också kulturer aggressiva linjer cancercell som HeLa celler, bör fibroblaster hanteras separat från cancerceller. Det är att föredra att ha en utsedd huva och inkubator för primära kulturer.

Det är bättre att behålla primära cellkulturer vid fysiologiska syrekoncentration på 3%. Atmosfärisk (20%) syre förkortar livslängden av kulturer och ökar oxidativ stress. Musfibroblaster är känsliga för oxidativ stress och kommer senesce eller ange krisen inom ~ 14 befolkning dubbleringar när bibehålls på 20% (atmosfäriskt) syre. Musfibroblaster kan bevaras i oändlighet till 3% syre 2.

Alltid föra register över antalet invånare fördubbling av kulturer. Stora arter (body mass över 8000 g) kommer sannolikt att ställa ut replikationsförmåga åldrande, och kommer att ha en begränsad livslängd på kultur, även på 3% syre 1. Celler från mindre arter, som möss och råttor, kommer att föröka sig på obestämd tid på 3% syre, men kan så småningom bli aneuploid. Om möjligt påbörja experiment med celler med låg befolkning fördubblas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Vi tackar Dr Steven Austad för att förse oss med den första versionen av detta protokoll. Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH och Ellison Medical Foundation till VG och AS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 media Invitrogen 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Invitrogen 01437-036 The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic Invitrogen 15420-096
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Liberase TM Research Grade Roche 05401127001 Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media ATCC 30-203 The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel Multiple suppliers
Three Gas Control incubator Forma or Heraeus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
  2. Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).

Comments

29 Comments

  1. Very helpful protocol. Got it working at the very first try, Would highly recommend the protocol.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 14, 2012 - 5:10 PM
  2. I have recently isolated fibroblasts from fresh fibrotic human lung. I used collagenase and plated the cells via your protocol. the cells seem to be of ² populations: one is long (²0% of plate) typical of fibroblast but the other cells are round. They look like they just started to adhere to the plate. What cells could these be? Is this happen often? COuld they be a subset of fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 4, 2012 - 9:33 AM
  3. Hi
    The round cells are epithelial cells that always accompany lung fibroblast isolation. These cells will just float. After you switch the media to EMEM (mentioned in Step 13) and start splitting the fibroblasts, these cells will go away.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:11 PM
  4. I have used your protocol successfully before on human lung tissue. However this time, the majority of our cells were epithelial- look very much like keritanocytes. Is there something we could do to only keep the fibroblasts growing- change to MEM media?
    Also, the next time we try this protocol, is there anything we can do to not get so many epithelial cells?WIll be happy for any suggestions. Thanks.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 5, 2012 - 8:14 AM
  5. Hi Barbara,
    We always get the round epithelial cells during our lung fibroblast isolation too. When you switch to EMEM media and start splitting the fibroblasts, they will be selected for and the epithelial cells will be lost.
    Next time you try the protocol, you can use EMEM media for the whole isolation procedure instead of DMEM/F1² to minimize the epithelial cells you get. But the trade-off is that the efficiency of isolation might decrease. Good luck.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:15 PM
  6. A note from the authors:
    Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3, they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 054011²7001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:31 PM
  7. Thank you so much for your reply. I split them yesterday and changed the media to MEM.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 6, 2012 - 7:35 AM
  8. What is the best way to remove tissue peices on day 7? Especially with the larger tissue peices, ones that you can clearly see, produce more epithelial cells, where as the small peices (as in your pictures) produce mostly pure fibroblasts. Also, do you transplant the tissues on day 7 regardless of the confluency of your plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:59 AM
  9. On day 7, we gently aspirate the supernatant (with the tissue pieces) with a pipette, transfer it to a new plate and provide the original plate with fresh media. In this way, the small pieces attached to the plate are not disturbed and the other tissue debris with the potential to give out more fibroblasts can do so on a new plate.
    Also, yes, it is a good idea to transfer the tissues on a new plate on day 7.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 3:43 PM
  10. When you trypsinize initially, do you do this aggressively and try to remove all the cells from the plate (fibroblast and epithelial)? I have found that the fibroblasts seem to trypsinize first and can thus help to purify the culture, but my cell yield is significantly smaller (too small). Thank you for you help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:05 PM
  11. The first trypsinization dŒs not have to be aggressive. As long as all the fibroblasts are off the plate and floating, we dont worry about the epithelial cells. They usually disappear after the first couple of passages with EMEM media. The fibroblasts are fast growing and will be selected for with passaging.
    To improve the yield, I would suggest ² things in the isolation procedure : Mincing the tissue very well and incubating the tissue pieces for a longer time in the Collagenase enzyme (while taking care to avoid over-digestion).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:18 PM
  12. You recommend storing 0.5 mL aliquots of Blendzyme at ²8 units/ml (i.e. 14 wunsch units per aliquot) but you recommend using 0.14 units/ml in 10 mls of media, or 1.4 wunsch units per digestion) This implies each aliquot is for 10 digestions. Is this correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 10:59 AM
  13. Yes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 11:04 AM
  14. After 14 days I achieve confluence and then split into fibroblast specific growth media and these cells have no trouble reaching 80-90%. When I subsequently split this population the cells senesce. Is there any obvious reason for this? It would think that 14 days of growth would cause a primary cell to senesce but your protocol suggests that I should be able to continue splitting my cells and further purfy in the process. I appreciate your help!

    Reply
    Posted by: Justin K.
    May 4, 2012 - 10:49 AM
  15. Hi Justin
    Are these mouse fibroblasts? Are you growing them in ²0% oxygen? If you are, then they will senesce. We grow all our cells in 3% oxygen and 5% CO² conditions.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 9, 2012 - 3:06 PM
  16. Hi, one of the first steps recommends to euthanize the animal and store it at 4oC. Do we complete this step even if we plan on using the animal right away? If so, for how long do we store the animal at 4oC? Is putting it on ice also acceptable?

    Reply
    Posted by: J A.
    May 13, 2012 - 7:49 PM
  17. No..It is best to use the animal right away. The 4C step is only if circumstances make it impossible to process it right away. In this case, we store the corpse at 4C(better) or on ice(in case of wild caught animals) for not more than ²4 hours.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 13, 2012 - 7:57 PM
  18. Also, another question I have is about the tissue fragments in the media. When would be the best time to remove them from the cells and replace them with media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 14, 2012 - 12:42 AM
  19. It depends. Usually, if the media turns yellow a few days after isolation and if there aren't enough fibroblasts on the plate, we collect the fragments, suspend them in fresh media and plate them back. As the protocol says, day 14 is when we usually get rid of the tissue fragments.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 14, 2012 - 2:51 PM
  20. Hi,

    I a couple of questions about the reagents used. My first question is about the liberase enzyme used. I noticed that the liberase enzyme 3 from Roche has been discontinued. Would you recommend replacing it with the Liberase TM Research Grade medium enzyme with Thermolysin? If so, would you recommend keeping the concentration the same (.14 U/mL)? My second question is about the Fetal Bovine Serum used in this experiment. I understand that you recommend using the Qualified Fetal Bovine Serum because it has been shown to support the growth of primary fibroblast cultures. In my lab we use heat-inactivated FBS. Would you recommend me switching from heat-inactivated to qualified FBS?

    Thank you in advance for your help :)

    Reply
    Posted by: J A.
    May 21, 2012 - 11:25 AM
  21. Yes. We now use TM instead of Liberase 3 with the same concentration.
    I understand that heat-inactivation of FBS is usually done to get rid of complement factors. I don't know how critical it is for your experiments to do this but we never use heat-inactivated serum.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 3:06 PM
  22. I also have a question about plating the tissue into the media. ²4- hours after I plated my tissue pieces into the media, I looked at my cultures under the microscope and saw little round cells that adhered to the plate. I understand that the protocol mentions that fibroblasts do not typically exit the tissue for at least 48 hours, and the round epithelial cells that assist the growth of fibroblasts usually float through the media. I was just wondering if seeing these cells after ²4 hours is normal.

    Reply
    Posted by: J A.
    May 24, 2012 - 12:59 PM
  23. Yes it is normal, more for lung fibroblast isolation. Once the fibroblasts start growing, the round cells will be selected against.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 2:57 PM
  24. Hi,

    I was wondering what concentration of trypsin EDTA you used? I use trypsin 0.²5% trypsin EDTA to remove my cells during splitting (after an incubation time of 4 minutes). After trypsinizing the cells for 4 minutes, I have noticed that less than half of them are detached from the plate. I am afraid to leave the cells in trypsin for longer than 4 minutes because I do not want to damage them. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: J A.
    July 18, 2012 - 1:05 AM
  25. We use Red trypsin with 0.²5% EDTA..Its very strong and we only treat cells with it for 1-² minutes. So you wash/rinse the plate with PBS after aspirating media, before adding trypsin? Because the FBS in the media inhibits trypsin activity and if the plates are not washed with PBS first, trypsin cannot act properly.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    July 18, 2012 - 11:28 AM
  26. Thank you for such detailed procedure. I am curious is it possible that the keratinocytes also exist in the fibroblast culture? Thank you.

    Reply
    Posted by: Hua-Ling C.
    September 19, 2012 - 3:16 AM
  27. Dear all, my adult fibroblasts (GFP positive C67Bl/6 mice) are not growing very well (DMEM, high glucose, Na-pyrovate, Pen/Strp, 15%FBS). Do you have any suggestions about what I could add to the media to increase proliferation? Thanks a lot. Gunnar

    Reply
    Posted by: Gunnar P.
    March 1, 2013 - 2:03 PM
  28. Can this protocol be adapted to isolate cancer-associated fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Wei L.
    July 9, 2013 - 2:59 PM
  29. Do you know what is the best marker to check the purity of mouse lung fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Jenny t.
    July 15, 2014 - 5:02 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics