الفأر الجنينية الثقافة الرئة ، وهو نظام لتقييم الآليات الجزيئية من التفرع

Biology
 

Summary

في وقت مبكر جهاز الرئة الجنينية الثقافة هي نظام مفيدة جدا لدراسة التفاعلات الوسيطة - الظهارية. حصيلة كل من التشكل الظهارة والوسيطة في ظل ظروف محددة يمكن بسهولة التلاعب في هذا النظام.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

مواصفات الرئة البدائية فضلا عن التشكل المتفرعة ، وتشكيل خلية رئوية مختلفة الأنساب يتطلب التفاعل محددة من الأديم الباطن مع اللحمة المتوسطة الرئة المحيطة بها وميسوثيليوم. وقد تبين الرئة اللحمة المتوسطة لتكون مصدرا للإشارات الاستقرائي لالتشكل الرئة المتفرعة. الظهارية - الوسيطة - الظهارية التفاعلات هي أيضا حاسمة في التشكل الرئة الجنينية. في وقت مبكر جهاز الرئة الجنينية الثقافة هي نظام مفيدة جدا لدراسة التفاعلات الوسيطة - الظهارية. حصيلة كل من التشكل الظهارة والوسيطة في ظل ظروف محددة يمكن بسهولة التلاعب في هذا النظام (في غياب الأم وتأثير تدفق الدم). يمكن أن الأهم من ذلك أن هذه التقنية القيام به بسهولة في serumless وسائل الاعلام ثقافة محددة كيميائيا. ويمكن تحقيق الربح والخسارة من وظيفة باستخدام بروتينات المعبر عنها ، ناقلات فيروسية المؤتلف و / أو تحليل سلالات الماوس المعدلة وراثيا ، RNA العقاقير ، فضلا عن التدخل الجيني RNA ضربة قاضية.

Protocol

ثقافة الجهاز هو تقنية مفيدة جدا وتنوعا لدراسة الجينات والتعبير البروتين. ويمكن استخدام هذه الثقافة الحية السابقين أساليب أولية أو مكملة لفي الدراسات المجراة.

1. عزل الرئة الجنينية

  1. وضحى توقيت الحامل الفئران يوم postcoitum 11.5 أو 12.5 (12.5 - E11.5) من الخدر CO 2 وفقا لمبادئ توجيهية والمعاهد الوطنية للصحة OLAW. يوضع الحيوان في غرفة وقدم 100 ٪ CO 2. بعد هذا الحيوان هو اللاوعي هو زيادة تدفق ثاني أكسيد الكربون 2. ويجب ضمان الموت السريري للحيوان.
  2. جميع الخطوات التالية يجب أن تكتمل في ظل ظروف معقمة في تدفق الصفحي هود. يتم إزالة الرحم من الإناث الحوامل. لإزالة الرحم من الحيوان ، ويتم وضع الإناث الحوامل على ظهورهم ورشها مع الايثانول 70 ٪. يتم إجراء شق في البطن ، ويتم إزالة الجلد عن طريق سحب الجلد صعودا في حين عقد ساقيه الخلفيتين الحيوان. فتح التجويف البريتوني ويتم إزالة الرحم من الحيوان.
  3. يتم شطف قبالة الدم عن طريق وضع الرحم في أنبوب مخروطي 50 مل مملوءة هانكس الباردة محلول الملح المتوازن (HBSS) ، وبلطف هزت الأنبوب لمدة 2 دقيقة.
  4. ثم يتم وضع الرحم في طبق بتري تحت المجهر مجسمة تشريح ، وأفرج عنه من الأجنة في الرحم عن طريق عمل قطع في جدار الرحم باستخدام مقص الربيع. ويتم حصاد الأجنة باستخدام ملعقة مثقوبة ، ووضعها على الجليد في طبق بتري جديدة تحتوي على HBSS.
  5. تحت المجهر مجسمة تشريح ، يتم تشريح الرئتين الجنينية واحدا تلو الآخر في طبق بتري تحتوي HBSS الباردة (الشكل 1).
  6. يتم وضع الرئة معزولة الجنينية على الجليد في طبق بتري تحتوي HBSS باستخدام ماصة نقل معقمة.

2. الجنينية الرئة الثقافة

  1. يضاف 500 مليلتر microliters إلى 1 لكل بئر من D-MEM/F-12 تستكمل مع 50 وحدة / مل من البنسلين ، الستربتوميسين في صحن Nunclon البوليستيرين.
  2. يتم وضع المسار البولي Nuclepore - إحفر الغشائية على رأس وسائل الإعلام. عندما يتم وضع المسار البولي Nuclepore - إحفر الغشائية على رأس وسائل الإعلام ، تأكد من أن الجانب اللامع هو ضد وسائل الإعلام ، والوجه الخشن تواجه صعودا.
  3. يتم وضع الرئة تشريح الجنينية على قمة غشاء Nuclepore المسار - إحفر البولي باستخدام ماصة نقل معقمة.
  4. يتم ضبط الموقف الرئة الجنينية باستخدام ملقط. وينبغي أن توضع على الرئة الجنينية مرشح لها سليمة والقصبة الهوائية وضعها مع القصبة الهوائية نظرهم فان وجود موقف مستقيم ، وبالتالي السماح لجميع الرئتين نفس الضغط الداخلي.
  5. يتم نقل طبق البوليستيرين Nunclon للمرة الثقافة المطلوبة في حاضنة الخلية (الشكل 2).

3. المواد

1. الجنينية عزل الرئة الجامعة

  1. توقيت الحامل (C57BL6 نوع البرية أو المعدلة وراثيا) الفئران لا بد من التضحية في يوم postcoitum 11،5-13،5 (E11.5 - 13.5).
  2. هانكس "محلول الملح المتوازن (HBSS) (1X) والسائلة ، دون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم وكبريتات المغنيسيوم أو. (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) تستكمل مع 50 وحدة / مل من البنسلين ، الستربتوميسين (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا). HBSS تخزين في درجة حرارة الغرفة وعند 4 درجات مئوية بعد الافتتاح. قسامة وتخزين البنسلين ، الستربتوميسين في -20 درجة مئوية.
  3. مجهر تشريح مجسمة (لايكا ، يتزلا ، ألمانيا).
  4. بما في ذلك أدوات تشريح ملقط دومون ، مقص القزحية الجميلة (على التوالي) ، نوييز مقص الربيع وموريا ® الملعقة (مثقب) (العلوم أدوات الجميلة ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا).

2. الجنينية الثقافة الرئة الجامعة

  1. Dulbecco في التعديل النسر متوسطة : مزيج من المغذيات F - 12 (D-MEM/F-12) (1X) ، السائل ، يحتوي 01:01 L - الجلوتامين ، ولكن لا HEPES العازلة. (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) تستكمل مع 50 وحدة / مل من البنسلين ، الستربتوميسين (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا). إبقاء زجاجة DMEM/F-12 بعيدا عن الضوء (غطت مثلا رقائق الألومنيوم) وتخزينها في 4 درجات مئوية. قسامة وتخزين البنسلين ، الستربتوميسين في -20 درجة مئوية.
  2. Nuclepore المسار البولي - إحفر الأغشية ، 8.0 متر ، 13mm (Whatman Nuclepore المسار - إحفر غشاء (Whatman ، Florham بارك ، نيو جيرسي).
  3. Nunclon طبق البوليستيرين مع الأغطية ، و 4 آبار (روتشستر ، نيويورك).
  4. ماصات نقل المتاح ، والعقيمة (فيشر العلمية ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا).

الشكل 1
الشكل 1. تشريح E12 الرئتين الجنينية. (A) E12.5 الجنين كله ينظر إليها من الجانب الأيمن. (B) تمت إزالة forelimb الحق من جنين (C) الملقط الذي عقدته اليد اليسرى عقد الجنين المطرد في الطبق. السهام تشير خطة تشريح (D) الجنينية الرئة يكمن الخلفي للقلب (إزالة) والأمامية إلى العمود الفقري. هذا الرقم يدل على الرئتين بعد إزالة الجلد والقلب. (E) إزالة البلعوم يسمح الفصل بين رئة سليمة من الجنين. (F) قد قلصت أنسجة البلعوم والمريء الغريبة بعيدا. يظهر تشريح E12.5 الرئة الجنينية مع القصبة الهوائية والحنجرة سليمة. (الكروم) الفص القحف ، (ميد) الفص الإنسي ، (CA) الذيل الفص ، (ACC) الفص ملحقة ، (لو) الفص الأيسر.

الشكل 2
الشكل 2. FGF9 يدفع التوسع في اللحمة المتوسطة واتساع الظهارة في الرئة المزروعة في المختبر. يزرع (AC) E12.5 الرئة لمدة 48 ساعة في غياب FGF9. ملاحظة الزيادة في المتفرعة (مدافع) E12.5 الرئة نمت لمدة 48 ساعة في حضور FGF9. لاحظ اتساع الظهارة واللحمة المتوسطة في أقرب وقت بعد 24 ساعة من ثقافة (E). بعد 48 ساعة (F) ، وأثر على ظهارة هو أكثر وضوحا. مقياس شريط : AF 400 ميكرومتر 4.

بروتوكول النص الكامل لهذا النهج التجريبي هو متاح في البروتوكولات سبرينغر .

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل على جائزة بحوث سابان تمهيدي الدكتوراه معهد (PMDM) ، والمعاهد الوطنية للصحة RO1 HL75773 (DW)

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
  5. Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  6. Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures. Cell Differ. 24, 105-117 (1988).
  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics