Мышиных эмбриональных легких культуры, системы оценки Молекулярные механизмы Ветвление

Biology
 

Summary

Раннее эмбриональное органной культуры легких очень полезная система для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий. Оба эпителиальных и мезенхимальных морфогенез протекает в специфических условиях, которые можно легко манипулировать в этой системе.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Легкого изначальный спецификации, а также ветвление морфогенеза и формирования различных легочных клеточных поколений требует специфического взаимодействия легких энтодермы с окружающей его мезенхимы и мезотелия. Легкого мезенхимы было показано, быть источником индуктивных сигналов для легких ветвления морфогенеза. Эпителиальные-мезенхимальных-мезотелиальной взаимодействия также имеет важное значение для эмбрионального морфогенеза легких. Раннее эмбриональное органной культуры легких очень полезная система для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий. Оба эпителиальных и мезенхимальных морфогенез протекает в специфических условиях, которые можно легко манипулировать в этой системе (при отсутствии материнского влияния и кровотока). Что еще более важно этот метод может быть легко сделано в serumless определенным химическим медиа культуры. Усиление и потери функции можно достичь с помощью выразил белков, рекомбинантных вирусных векторов и / или анализа трансгенных линий мышей, антисмысловые РНК, а также РНК-интерференции генов нокдаун.

Protocol

Органная культура очень полезный и универсальный метод для изучения генов и экспрессии белка. Эти бывшие культуры методами естественных условиях можно использовать в качестве предварительного или в дополнение к в естественных исследованиях.

1. Эмбриональные изоляции легких

  1. Временный беременных мышей приносятся в жертву на postcoitum день 11,5 или 12,5 (E11.5-12.5) СО 2 наркоза в соответствии с НИЗ и OLAW руководящих принципов. Животное помещают в камеру и 100% СО 2 введен. После животное находится в бессознательном состоянии CO 2 потока увеличивается. Клиническая смерть животного должна быть обеспечена.
  2. Все следующие шаги должны быть завершены в стерильных условиях в ламинарном боксе. Матка удаляется из беременных женщин. Для удаления матки из животных, беременных самок расположены на спине и опрыскивают 70% этанола. Надрез в брюшной полости и кожи удаляется, потянув кожу вверх, держа задние ноги животного. Брюшную полость открывается и матка удаляется от животного.
  3. Кровь смывается, помещая матки в 50 мл коническую трубку, наполненную холодной Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS), и трубка мягко качались в течение 2 минут.
  4. Матку помещают в чашку Петри под стереоскопическим микроскопом рассечение, и эмбрионы освобожден из матки надрезание стенки матки с помощью пружинных ножниц. Эмбрионы убирают с использованием перфорированной ложкой, и помещают на лед в новой чашки Петри содержащие HBSS.
  5. Под стереоскопический микроскоп рассекает, эмбриональные легкие расчлененный по одному в чашки Петри, содержащие холодной HBSS (рис. 1).
  6. Изолированных эмбриональных легких находится на льду в чашке Петри содержащие HBSS помощью стерильной пипетки передачи.

2. Эмбриональные культуры легких

  1. 500 мкл на 1 мл на лунку D-MEM/F-12 дополнена с 50 ЕД / мл пенициллина, стрептомицина добавляют в блюда из полистирола Nunclon.
  2. Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембрана помещается в верхней части средств массовой информации. Когда Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембрана помещается в верхней части средств массовой информации, чтобы убедиться, что блестящая сторона выступает против средств массовой информации, и грубой стороной вверх.
  3. Расчлененный эмбриональных легких находится на вершине Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембранные использованием стерильной пипетки передачи.
  4. Эмбриональной позиции легкого регулируется с помощью щипцов. Эмбриональные легких размещены на фильтр должен иметь нетронутой трахеи и быть размещены с их трахеи, имеющие прямое положение, что позволяет все легкие иметь те же внутреннее давление.
  5. Блюдо Nunclon Полистирол переносится на желаемый культуры времени в клетке инкубатора (рис. 2).

3. Материалы

1. Эмбриональные Всего изоляции легких

  1. Временный беременных (C57BL6 дикого типа или трансгенных) мышей быть принесен в жертву на postcoitum день 11,5 до 13,5 (E11.5-13.5).
  2. Сбалансированный Соль Хэнкса Решение (HBSS) (1X), жидкие, без хлорида кальция, хлорид магния или сульфата магния. (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 50 ЕД / мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Магазин HBSS при комнатной температуре и при температуре 4 ° С после открытия. Алиготе и хранить пенициллин-стрептомицина при температуре -20 ° C.
  3. Стереоскопический микроскоп рассекает (Leica, Wetzlar, Германия).
  4. Препарирование инструментов, включая Дюмон щипцы, ножницы изобразительных радужной оболочки глаза (прямо), Нойес весной ножницы и Мории ® ложке (перфорированные) (изобразительных инструментов науки, Foster City, CA).

2. Эмбриональные Всего культуры легких

  1. Дульбеко изменения Eagle среда: Питательная Mix F-12 (D-MEM/F-12) (1X), жидкие, 1:1 Содержит L-глютамина, но не HEPES буфера. (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с добавлением 50 ЕД / мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Держите бутылку DMEM/F-12 от света (например, покрыты алюминиевой фольгой) и хранить при 4 ° C. Алиготе и хранить пенициллин-стрептомицина при температуре -20 ° C.
  2. Nuclepore Поликарбонат Трек-Etch Мембрана, 8.0-м, 13 мм (Ватман Nuclepore Трек-Etch мембраны (ватман, Florham Парк, штат Нью-Джерси).
  3. Nunclon Полистирол блюда с крышками, 4 скважины (Рочестер, штат Нью-Йорк).
  4. Одноразовые пипетки передачи, стерильные (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания).

Рисунок 1
Рисунок 1. Препарирование E12 эмбриональных легких. (А) E12.5 весь эмбрион смотреть с правой стороны. (B) правой передней лапе был удален из эмбриона. (С) Пинцет проводимых левой рукой держа эмбриона устойчивы в блюдо. Стрелки указывают план расчленения (D) эмбриональных легких лежит кзади от сердца (удален) И впереди позвоночника. Эта цифра показывает, легких после кожи и сердца удаления. (Е) глотки удаления допускает разделение нетронутыми из легких эмбриона. (F) Посторонние глотки и пищевода ткани были отделаны прочь. Расчлененный E12.5 эмбриональных легких с неповрежденными трахеи и гортани показано на рисунке. (Cr) Черепные доли, (Med) медиальной доли, (Ca) Хвостовой доли, (ACC) Аксессуары доли, (Le) Левая доля.

Рисунок 2
Рисунок 2. FGF9 вызывает расширение мезенхимы и расширение эпителий легких, выращенных в лабораторных условиях. (AC) E12.5 легких выращивают в течение 48 часов при отсутствии FGF9. Обратите внимание на увеличение ветвления. (DF) E12.5 легких выросла на 48 часов в присутствии FGF9. Обратите внимание на расширение эпителия и мезенхимы уже после 24 часов культуры (E). Через 48 часов (F), воздействие на эпителий становится еще более заметным. Шкала бар: AF 400 мкм 4.

Полный текст протокола для этого экспериментальный подход доступен в протоколах Springer .

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Сабан-исследовательский институт Предварительно докторской Award (PMDM), а также NIH RO1 HL75773 (DW).

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
  5. Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  6. Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures. Cell Differ. 24, 105-117 (1988).
  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics