マウス胎児肺の文化、分岐の分子機構を評価するシステム

Biology
 

Summary

初期の胎児肺の器官培養では、上皮 - 間葉相互作用を研究するために非常に便利なシステムです。容易にこのシステムで操作可能な特定の条件下での上皮と間葉の両方の形態形成が進行する。

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Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

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Abstract

肺原初の仕様だけでなく、分岐形態形成、および様々な肺の細胞系譜の形成は、その周囲の間充織と中皮と肺の内胚葉の特定の相互作用を必要とします。肺間葉は、肺の分岐形態形成のための誘導信号の源であることが示されている。上皮 - 間葉 - 中皮相互作用はまた、胎児肺の形態形成に重要です。初期の胎児肺の器官培養では、上皮 - 間葉相互作用を研究するために非常に便利なシステムです。容易に(母親の影響と血流が途絶えることで)このシステムで操作可能な特定の条件下での上皮と間葉の両方の形態形成が進行する。さらに重要なことは、この手法は容易にserumless、化学的に定義された培地で行うことができます。関数のゲインと損失が発現したタンパク質、組換えウイルスベクターおよび/またはトランスジェニックマウスの系統、アンチセンスRNAだけでなく、RNA干渉の遺伝子ノックダウンの解析を使用して達成することができます。

Protocol

器官培養は、遺伝子やタンパク質の発現を研究するために非常に有用かつ汎用性の高いテクニックです。これらのex vivoの培養方法は、予備として、またはin vivo試験を補完するものに使用することができます。

1。胎児肺の分離

  1. 時限妊娠マウスは、NIHとOLAWガイドラインにしたがってCO 2ナルコーシスでpostcoitum日11.5または12.5(E11.5 - 12.5)に屠殺されています。動物は、チャンバ内に配置されており、100%のCO 2が導入されています。動物が意識不明になった後、CO 2流量が増加しています。動物の臨床死が確保されなければならない。
  2. すべての次の手順では、層流フードで無菌条件下で完了する必要があります。子宮は妊娠した女性から削除されます。動物から子宮を削除するには、妊娠中の女性は彼らの後ろに配置され、70%エタノールを噴霧されています。切開は、腹部に行われ、皮膚は動物の後ろ足を押しながら上方に皮膚を引っ張って削除されます。腹腔が開かれると子宮が動物から削除されます。
  3. 血液を50 mlコニカルチューブ冷ハンクス平衡塩溶液(HBSS)で満たされた、そしてチューブを静かに2分間揺動さで子宮を置くことによって洗い流したされる。
  4. 子宮は、立体的な解剖顕微鏡下でペトリ皿に入れ、そして胚は、春のはさみを使用して子宮壁を切開によって子宮から放出される。胚は、穴あきスプーンを使って回収し、HBSSを含む新しいペトリ皿に氷の上に配置されます。
  5. 立体解剖顕微鏡下では、胚の肺は、冷HBSS(図1)を含むペトリ皿に一つずつ解剖されています。
  6. 分離された胎児肺を無菌トランスファーピペットを使用してHBSSを含むペトリ皿に氷の上に配置されます。

2。胎児肺の文化

  1. 1ミリリットルにウェルあたりD-MEM/F-12 500マイクロリットルがペニシリン - ストレプトマイシンを50単位/ mlを添加したがNunclonポリスチレン皿に追加されます。
  2. Nucleporeポリカーボネートトラックエッチメンブレンは、メディアの上に配置されます。 Nucleporeポリカーボネートトラックエッチメンブレンは、メディアの上に配置されると、光沢のある面は、メディア、そしてラフサイド上を向いている反対であることを確認してください。
  3. 解剖胎児肺を無菌トランスファーピペットを使用してNucleporeポリカーボネートトラックエッチメンブレンの上に配置されます。
  4. 胎児肺の位置は、鉗子を用いて調整されます。フィルター上に配置胎児肺はそのまま気管を持つ必要がありますし、ストレートポジションを持つ彼らの気管を配置して、したがって、すべての肺が同じ内圧ができるようになります。
  5. Nunclonのポリスチレンディッシュは、細胞培養器(図2)で目的の培養時間のために転送されます。

3。材料

1。胚性肺全体の分離

  1. 時限妊娠(C57BL6野生型またはトランスジェニック)マウス13.5(E11.5 - 13.5)にpostcoitum日11.5に犠牲になる。
  2. ハンクス平衡塩類溶液(HBSS)(1X)、液体、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、または硫酸マグネシウムなし。 (Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州)50単位/ペニシリン - ストレプトマイシンのML(Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州)を補充した。室温と4℃で開栓後はHBSSを保管してください。分注して保管-20℃でペニシリン - ストレプトマイシン
  3. 立体解剖顕微鏡(ライカ、ヴェッツラー、ドイツ)。
  4. デュモン鉗子、ファインアイリスハサミ(ストレート)、ノイス春はさみとモリア®スプーン(穴あき)(ファインサイエンスツール、フォスターシティー、CA)を含む解剖ツール。

2。胚性肺全体の文化

  1. ダルベッコ改変イーグル培地:栄養がミックスF - 12(D-MEM/F-12)(1X)、液体、1:1はL -グルタミン、ないHEPES緩衝液が含まれています。 (Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州)50単位/ペニシリン - ストレプトマイシンのML(Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州)を補充した。 4で光を避けDMEM/F-12ボトルをキープ(例えばアルミ箔でカバー)と店舗℃の分注して保管-20℃でペニシリン - ストレプトマイシン
  2. Nucleporeポリカーボネートトラックエッチメンブレン、8.0 - M、13ミリメートル(ワットマンNucleporeトラックエッチメンブレン(ワットマン、フォーハムパーク、ニュージャージー州)。
  3. 蓋付きNunclonポリスチレン皿、4ウェル(ロチェスター、ニューヨーク州)。
  4. 使い捨て転送ピペット、滅菌(フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、PA)。

図1
図1。 E12胎児肺の解剖。 ()E12.5全胚では右側から見た。(B)右前肢は胚から削除されています。皿に胚を固定左手によって保持される(C)鉗子。矢印は、(D)胚の肺は、心臓(除去の後方にある解剖の計画を示す)と脊椎の前方。この図は、肌と心の除去の後に肺を示しています。(E)咽頭除去が胚から無傷の肺の分離を可能にする。(F)余分な咽頭組織と食道を離れてトリミングされています。無傷の気管と喉頭との解剖E12.5胎児肺が表示されます。 (Cr)が頭蓋側頭葉、(メッド)中葉、(Ca)の尾部ローブ、(ACC)副肺、(ル)左葉。

図2
図2。E12.5肺がFGF9のない状態で48時間成長させた。FGF9は、間充織の拡大を誘導し、肺の上皮の拡張は、in vitroで増殖させた。(AC)分岐の増加に注意してください。(DF)E12.5肺はFGF9の存在下で48時間増殖させた。文化の24時間後、早ければ上皮と間充(E)の拡張に注意してください。 48時間(F)の後、上皮への影響はさらに顕著です。スケールバー:AF400μmである4。

この実験的なアプローチのための完全なテキストのプロトコルがで可能ですシュプリンガープロトコル

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgements

この作品は、サバン研究所プリ博士賞(PMDM)によってサポートされており、NIH RO1 HL75773(DW)でした。

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
  5. Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
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  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

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