Cultura de embriones de ratón de pulmón, un sistema para evaluar los mecanismos moleculares de la ramificación

Biology
 

Summary

Principios de la cultura de órganos embrionarios de pulmón es un sistema muy útil para estudiar las interacciones epitelio-mesenquimal. Epiteliales y mesenquimales procede morfogénesis en condiciones específicas que pueden ser fácilmente manipulados en este sistema.

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Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

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Abstract

Especificación de pulmón primordial, así como la morfogénesis de ramificación, y la formación de varios linajes de células pulmonares requiere una interacción específica del endodermo de pulmón con su mesénquima circundante y mesotelio. Mesénquima pulmonar ha demostrado ser la fuente de señales inductivas para la morfogénesis de pulmón ramificación. Epitelio-mesénquima-mesoteliales interacciones también son esenciales para la morfogénesis de pulmón embrionario. Principios de la cultura de órganos embrionarios de pulmón es un sistema muy útil para estudiar las interacciones epitelio-mesenquimal. Epiteliales y mesenquimales procede morfogénesis en condiciones específicas que pueden ser fácilmente manipulados en este sistema (en ausencia de la influencia de la madre y el flujo de sangre). Más importante que esta técnica puede ser fácilmente hecho en un medio de comunicación serumless, la cultura de constitución química definida. Ganancia y pérdida de la función se puede lograr utilizando las proteínas expresadas, vectores virales recombinantes y / o análisis de las cepas de ratones transgénicos, el ARN antisentido, así como la caída en la interferencia del ARN del gen.

Protocol

El cultivo de órganos es una técnica muy útil y versátil para el estudio de genes y expresión de la proteína. Estos métodos ex vivo la cultura puede ser utilizado como preliminar o como complemento de los estudios in vivo.

1. Aislamiento de pulmón embrionario

  1. Cronometrada embarazadas ratones son sacrificados en el día postcoitum 11,5 o 12,5 (E11.5-12.5) de CO 2 narcosis de acuerdo con las directrices del NIH y OLAW. El animal se coloca en una cámara y un 100% de CO 2 se introduce. Después de que el animal está inconsciente el flujo de CO2 es mayor. La muerte clínica del animal debe estar garantizada.
  2. Todos los pasos siguientes deben ser cumplidos bajo condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Se extirpa el útero de las hembras preñadas. Para extirpar el útero del animal, las mujeres embarazadas se colocan en la espalda y se rocían con etanol al 70%. Se hace una incisión en el abdomen y la piel se quita tirando de la piel hacia arriba, manteniendo las patas traseras del animal. La cavidad peritoneal se abre y se extirpa el útero del animal.
  3. La sangre se aclara mediante la colocación de la matriz en un tubo cónico de 50 ml llena de solución salina fría Hanks equilibrada (HBSS), y el tubo se mecía suavemente durante 2 minutos.
  4. El útero se coloca en una placa de Petri bajo el microscopio estereoscópico de disección, y los embriones dado de alta del útero mediante una incisión en la pared del útero con unas tijeras de primavera. Los embriones se recogen con una cuchara perforada y se coloca en hielo en una nueva placa de Petri que contiene HBSS.
  5. Bajo el microscopio estereoscópico de disección, pulmones embrionarias se disecan uno por uno en una placa de Petri que contiene HBSS frío (Figura 1).
  6. El pulmón de embriones aislados se coloca en el hielo en un plato de Petri que contiene HBSS con una pipeta de transferencia estéril.

2. Cultura de pulmón embrionario

  1. 500 microlitros de 1 mililitro por pocillo de D-MEM/F-12 suplementado con 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina, se añade en una placa de poliestireno Nunclon.
  2. A Nuclepore policarbonato pista Etch membrana se coloca en la parte superior de los medios de comunicación. Cuando el Nuclepore policarbonato pista Etch membrana se coloca en la parte superior de los medios de comunicación, asegúrese de que el lado brillante contra los medios de comunicación, y cara rugosa está hacia arriba.
  3. Un pulmón disecados embrionarias se coloca en la parte superior de la pista Nuclepore policarbonato-Etch membrana con una pipeta de transferencia estéril.
  4. La posición de pulmón embrionario se ajusta con las pinzas. Pulmón embrionario colocado en el filtro debe tener una traquea intactos y se coloca con su tráquea con una posición recta, permitiendo así que todos los pulmones que tiene la misma presión interna.
  5. El plato de poliestireno Nunclon se transfiere por el momento la cultura deseada en una incubadora de células (Figura 2).

3. Materiales

1. Aislamiento embrionarias todo el pulmón

  1. Tiempo de espera del embarazo (C57BL6 tipo salvaje o transgénicos) en ratones que se sacrificaron el día postcoitum 11,5 a 13,5 (E11.5-13.5).
  2. Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) (1X), líquido, sin cloruro de calcio, cloruro de magnesio o sulfato de magnesio. (Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Guarde el HBSS a temperatura ambiente ya 4 ° C después de la apertura. Alícuota y almacenar la penicilina-estreptomicina a -20 ° C.
  3. Microscopio estereoscópico de disección (Leica, Wetzlar, Alemania).
  4. Herramientas de disección incluyendo Dumont pinzas, tijeras iris Artes (recto), tijeras Noyes primavera y Moria cuchara ® (perforada) (Herramientas de Bellas Ciencia, Foster City, CA).

2. Cultura embrionarias todo el pulmón

  1. Dulbecco modificado del medio Eagle: mezcla de nutrientes F-12 (D-MEM/F-12) (1X), líquido, 01:01 Contiene L-glutamina, pero no tampón HEPES. (Invitrogen, Carlsbad, CA), complementado con 50 unidades / ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mantenga la botella DMEM/F-12 lejos de la luz (por ejemplo, cubiertas con papel de aluminio) y se almacenan a 4 ° C. Alícuota y almacenar la penicilina-estreptomicina a -20 ° C.
  2. Nuclepore policarbonato pista Etch de membrana, de 8,0 m, 13 mm (Whatman Nuclepore pista Etch membrana (Whatman, Florham Park, NJ).
  3. Nunclon plato de poliestireno con tapas, 4 pozos (Rochester, NY).
  4. Pipetas desechables de transferencia, estéril (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

Figura 1
Figura 1. La disección de los pulmones E12 embrionarias. (A) E12.5 embrión todo visto desde el lado derecho (B). Extremidad anterior derecha ha sido removido del embrión. (C) Pinzas en poder de la mano izquierda sostiene el embrión constante en el plato. Las flechas indican el plan de la disección (D) de pulmón embrionario se encuentra por detrás del corazón (eliminado) Y por delante de la columna vertebral. Esta figura muestra los pulmones después de la piel y eliminación de corazón. (E) eliminación de la faringe permite la separación del pulmón intacto desde el embrión. (F) los tejidos extraños faringe y el esófago se recorta. Disecados E12.5 pulmón embrionario con la tráquea y la laringe intacta se muestra. (Cr) del lóbulo craneal, (Med) lóbulo (Ca) del lóbulo caudal, (Acc) lóbulo accesorio, (Le) del lóbulo izquierdo.

Figura 2
Figura 2. FGF9 induce la expansión del mesénquima y la dilatación del epitelio en el pulmón cultivadas in vitro. (AC) E12.5 pulmón se cultiva durante 48 horas en ausencia de FGF9. Tenga en cuenta el aumento de la ramificación. (DF) E12.5 pulmón crecido durante 48 horas en presencia de FGF9. Tenga en cuenta la dilatación del epitelio y el mesénquima tan temprano como a las 24 horas de cultivo (E). Después de 48 horas (F), el efecto sobre el epitelio es aún más pronunciada. Barra de escala: AF 400 m 4.

El protocolo de texto completo de este enfoque experimental está disponible en los Protocolos Springer .

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Saban Research Institute Pre-doctoral Premio (PMDM), y por el NIH RO1 HL75773 (DW).

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
  5. Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  6. Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures. Cell Differ. 24, 105-117 (1988).
  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

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