Culture poumon embryonnaire de la souris, un système pour évaluer les mécanismes moléculaires des Branching

Biology
 

Summary

Début culture embryonnaire d'orgue du poumon est un système très utile pour étudier les interactions épithélio-mésenchymateuses. Les deux produits morphogenèse épithéliales et mésenchymateuses dans des conditions spécifiques qui peuvent être facilement manipulées dans ce système.

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Carraro, G., del Moral, P., Warburton, D. Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching. J. Vis. Exp. (40), e2035, doi:10.3791/2035 (2010).

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Abstract

Spécifications du poumon primordiale ainsi que la morphogenèse de branchement, et la formation de diverses lignées cellulaires pulmonaires nécessite une interaction spécifique de l'endoderme du poumon avec son mésenchyme environnant et de mésothélium. Lung mésenchyme a été montré pour être la source de signaux inductifs pour la morphogenèse des poumons de branchement. Épithélio-mésenchymateuse-mésothéliales interactions sont également essentielles à la morphogenèse poumon embryonnaire. Début culture embryonnaire d'orgue du poumon est un système très utile pour étudier les interactions épithélio-mésenchymateuses. Les deux produits morphogenèse épithéliales et mésenchymateuses dans des conditions spécifiques qui peuvent être facilement manipulées dans ce système (en l'absence de l'influence maternelle et la circulation sanguine). Plus important encore, cette technique peut être facilement fait dans un serumless, milieux de culture chimiquement défini. Gain et perte de fonction peut être réalisée en utilisant des protéines exprimées, vecteurs viraux recombinants et / ou l'analyse des souches de souris transgéniques, l'ARN antisens, ainsi que knockdown gène de l'ARN interférence.

Protocol

La culture d'organes est une technique très utile et polyvalent pour étudier l'expression génique et protéique. Ces méthodes de cultures ex vivo peut être utilisé comme préliminaire ou en complément à des études in vivo.

1. Isolement poumon embryonnaire

  1. Timed enceintes souris sont sacrifiées le jour postcoitum 11.5 ou 12.5 (E11.5-12.5) par le CO 2 narcose selon les directives des NIH et OLAW. L'animal est placé dans une chambre et de CO 2 de 100% est introduit. Après que l'animal est inconscient du flux de CO 2 est augmentée. La mort clinique de l'animal doit être assurée.
  2. Toutes les étapes suivantes doivent être remplies dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. L'utérus est retiré de la femmes enceintes. Pour enlever l'utérus de l'animal, les femelles enceintes sont placées sur leur dos et pulvérisé avec de l'éthanol à 70%. Une incision est faite dans l'abdomen, et la peau est enlevée en tirant la peau vers le haut tout en maintenant pattes postérieures de l'animal. La cavité péritonéale est ouvert et l'utérus est retiré de l'animal.
  3. Le sang est rincé en plaçant l'utérus dans un tube conique de 50 ml remplie de froid Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), et le tube est bercé pendant 2 minutes.
  4. L'utérus est ensuite placé dans une boîte de Pétri sous le microscope stéréoscopique disséquer, et les embryons libérés de l'utérus par incision de la paroi utérine à l'aide des ciseaux à ressort. Les embryons sont récoltés à l'aide d'une cuillère perforée, et placé sur la glace dans un nouveau plat de Pétri contenant HBSS.
  5. Sous le microscope stéréoscopique de dissection, poumons embryonnaires sont disséqués, un par un dans une boîte de Petri contenant HBSS froid (figure 1).
  6. Le poumon embryonnaire isolée est placée sur la glace dans une boîte de Petri contenant HBSS aide d'une pipette de transfert stérile.

2. Culture poumon embryonnaire

  1. 500 microlitres de 1 millilitre par puits de D-MEM/F-12 supplémenté avec 50 unités / ml de pénicilline-streptomycine est ajouté dans un plat en polystyrène Nunclon.
  2. Un Nuclepore polycarbonate Track-Etch membrane est placée sur le dessus du support. Lorsque le Nuclepore polycarbonate Track-Etch membrane est placée sur le dessus du support, assurez-vous que le côté brillant est contre les médias, et le côté rugueux est tourné vers le haut.
  3. Un poumon disséqué embryon est placé au sommet de la Nuclepore polycarbonate Track-Etch membrane à l'aide d'une pipette de transfert stérile.
  4. La position de poumon embryonnaire est ajusté à l'aide de la pince. Poumon embryonnaire placé sur le filtre devrait avoir une trachée intact et être placés avec leur trachée avoir une position droite, permettant ainsi à tous d'avoir les poumons la même pression interne.
  5. Le plat de polystyrène Nunclon est transféré pour la culture souhaitée dans un incubateur à cellules (figure 2).

3. Matériaux

1. Isolement embryonnaires poumon entier

  1. Timed-enceintes (C57BL6 de type sauvage ou transgéniques) des souris à être sacrifiés au jour postcoitum 11,5 à 13,5 (E11.5-13.5).
  2. Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquide, sans chlorure de calcium, chlorure de magnésium, ou sulfate de magnésium. (Invitrogen, Carlsbad, CA) complété avec 50 unités / ml de pénicilline-streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stocker le HBSS à température ambiante et à 4 ° C après ouverture. Aliquoter et de stocker les pénicilline-streptomycine à -20 ° C.
  3. Stéréoscopique loupe binoculaire (Leica, Wetzlar, Allemagne).
  4. Des outils de dissection dont Dumont forceps, beaux ciseaux à iris (droite), Noyes ciseaux printemps et Moria ® cuillère (perforés) (Outils Fine Science, Foster City, CA).

2. Culture embryonnaire poumon entier

  1. Dulbecco milieu de Eagle modifié: mélange nutritif F-12 (D-MEM/F-12) (1X), liquide, 01h01 Contient de la L-glutamine, mais pas de tampon HEPES. (Invitrogen, Carlsbad, CA) complété avec 50 unités / ml de pénicilline-streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Conserver le flacon DMEM/F-12 abri de la lumière (par exemple, couvert par une feuille d'aluminium) et stocker à 4 ° C. Aliquoter et de stocker les pénicilline-streptomycine à -20 ° C.
  2. Nuclepore polycarbonate Track-Etch membrane, 8,0 m, 13mm (Whatman Nuclepore Track-Etch membrane (Whatman, Florham Park, NJ).
  3. Vaisselle en polystyrène Nunclon avec couvercles, 4 puits (Rochester, NY).
  4. Pipettes de transfert jetable, stérile (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

Figure 1
Figure 1. Dissection de E12 poumons embryonnaires humaines. (A) E12.5 embryon complet vu du côté droit (B). Forelimb droit a été retiré de l'embryon. (C) Pince tenait par la main gauche tenant l'embryon constante dans le plat. Les flèches indiquent le plan de dissection (D) est postérieure des poumons embryonnaires au cœur (enlevé) Et antérieure à la colonne vertébrale. Cette figure montre les poumons après l'enlèvement de la peau et le cœur. (E) la suppression du pharynx permet la séparation des poumons intacts de l'embryon (F). Étrangères tissus du pharynx et l'œsophage ont été coupé. Disséqué E12.5 poumon embryonnaire avec la trachée et du larynx intacte est montré. (Cr) du lobe crânien, (Med) lobe, (Ca) du lobe caudal, lobe accessoire (Acc), (Le) lobe gauche.

Figure 2
Figure 2. FGF9 induit une expansion du mésenchyme et la dilatation de l'épithélium dans les poumons cultivées in vitro. (AC) E12.5 poumon est cultivé pendant 48 heures en l'absence de FGF9. Notez l'augmentation de la ramification. (DF) E12.5 pulmonaires cultivées pendant 48 heures en présence de FGF9. Notez la dilatation de l'épithélium et le mésenchyme dès après 24 heures de culture (E). Après 48 heures (F), l'effet sur ​​l'épithélium est encore plus prononcée. Échelle bar: AF 400 um 4.

Le protocole texte complet de cette approche expérimentale est disponible en protocoles Springer .

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l'Institut de recherche Saban pré-doctoral Prix (PMDM), et par le NIH RO1 HL75773 (DW).

References

  1. Alescio, T., Cassini, A. Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium. J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).
  2. Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. The molecular basis of lung morphogenesis. Mech Dev. 92, 55-81 (2000).
  3. Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight. J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).
  4. Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung. Dev Biol. 293, 77-89 (2006).
  5. Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  6. Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures. Cell Differ. 24, 105-117 (1988).
  7. Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy. Dev Biol. 158, 555-559 (1993).

Comments

9 Comments

  1. Liked the video. Very helpful. I always took out the lung from anterior side and didn't know the easy way you showed here. Many thanks for that.
    Question-1: DŒs it make any difference if I don't kill the pregnant mouse with CO² and do it by cervical dislocation?
    Question-²: I am trying to find a good marker for lung mesenchymal cells. Can you please suggest one (other than vimentin which dŒs not work on my hands)?
    Thanks

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 20, 2010 - 3:37 PM
  2. You can use any approved protocol to sacrifice your mice.
    For mesenchymal cells you can try c-Myc or dermo-1

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    August 20, 2010 - 5:03 PM
  3. Thank you for this wonderful demonstration.
    Do you have the protocol for siRNA-mediated gene knockdown in lung culture?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2010 - 10:16 PM
  4. Here you can find a protocol I used for LNA. Carraro et al. Dev. Biol. ²009.

    Reply
    Posted by: Gianni C.
    September 17, 2010 - 7:35 PM
  5. Great, clear video. Should there be fetal calf serum in the media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 10:38 PM
  6. This depends on the purpose of the experiment
    If you need serum less conditions leave it out and the lungs will still grow
    Otherwise you can include ² percent serum and the branching gŒs a bit better
    Ten percent serum is too much because it inhibits branching and is toxic

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 13, 2011 - 1:11 AM
  7. Do you collect fetal lungs from multiple litters and sort them based on their developmental stage or do you just work with rudiments from one litter? How do you deal with the variation (I seem to notice)? Is there is a particular number of lung rudiments you try to assign to each group? n= 3, 4 or 5?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 5:05 PM
  8. Thanks for the video. Perfect.

    Would you recommend the use of 8.0 or 5.0 microliter Nuclepore Track-Etch Membrane?

    Reply
    Posted by: Lucy M.
    July 24, 2012 - 3:59 PM
  9. Thank you for your helpful video.
    I have tried whole lung culture at E1², but we found that the branching was inhomogenous (in some areas the branching proceeded, but in another areas airways were ballooning). Do you have any ideas?

    Reply
    Posted by: Keiko U.
    May 26, 2013 - 11:04 PM

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