人类胚胎干细胞畸胎瘤形成命运的映射

Biology
 

Summary

人类胚胎干细胞定向分化成特定的细胞在再生医学产生了很大的兴趣。我们提供一个简洁,一步一步确定协议

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Ritner, C., Bernstein, H. S. Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation . J. Vis. Exp. (42), e2036, doi:10.3791/2036 (2010).

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Abstract

人类胚胎干细胞(胚胎干细胞)具有无限的自我更新能力,并能分化成所有三个胚层(1)衍生的细胞。导演的人类胚胎干细胞分化成特定类型的细胞在再生医学领域(如(2-5))产生了很大的兴趣,并确定方法

Protocol

报告的作者,与一些修改,公布的参数是基于以下书面协议。该协议是由加州大学旧金山分校的机构动物护理和使用(IACUC)和干细胞研究(SCRO)监督委员会的批准。

一,文化的人类胚胎干细胞(胚胎干细胞)

  1. 成长在标准6孔(3.5厘米直径的井)板的人类胚胎干细胞。
  2. 至少12小时之前,传代细胞,种子小鼠胚胎成纤维细胞(MEF; CF1的一天获得E12.5定时的小鼠交配,在1000次照射)的饲养层细胞上板涂1%明胶(6,7)。 MEFs应镀在50-60%的汇合点,或4 × 10 5%以及3.5厘米直径的细胞( 图1)
  3. 通道殖民地时已达到〜70%汇合( 图2)细胞。
  4. 通行的细胞,吸KSR生长中期(6)从井和0.5毫升含1毫克/毫升的浓度胶原酶IV KSR介质取代。
  5. 板与胶原酶在37 ° C / 5%的CO 2 5分钟,或直至菌落边缘开始从板抬起。
  6. 胶原酶从盘子中取出,每孔中加入0.5毫升的KSR,手动刮细胞完全从板块中删除。
  7. 从每口井的地方,在一个15毫升的锥形管,收集细胞悬液,使细胞受重力,5分钟解决。
  8. 从试管中取出上清液,留在了〜300μL总量的细胞和介质。
  9. 在全卷中使用200μL的微移液器设置,轻轻的吸管将细胞悬液的5-6倍,打破了殖民地。
  10. 把总量的9%使用KSR中( 也就是说 ,如果一个收获,管应包含9毫升)的原始细胞以及毫升细胞悬液。补充重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的12.5纳克/毫升的浓度介质。
  11. 洗衣机的贝科的磷酸盐的MEF细胞(见步骤2)新井后缓冲生理盐水(DPBS),以除去所有的血清,添加3毫升细胞悬液,每孔和孵化在37 °的C / 5%的CO 2板块。
  12. KSR媒介变化与碱性成纤维细胞生长因子通过后24小时,每24-48小时,直到细胞准备再次传代。

二。嫁接人类胚胎干细胞颗粒的制备

  1. 在嫁接前24小时,加冰糖抑制剂KSR介质的终浓度为10μM增加细胞活力(8)。 〜70%汇合时(5 × 10 5细胞)的细胞之一,将创建两个小球,每肾囊中的两个颗粒。
  2. 要准备细胞颗粒移植术(9),孵化的岩石5分钟胶原酶IV抑制剂治疗的文化,在37 ° C / 5%的CO 2。
  3. 从井里吸胶原酶,替换10%的青霉素/链霉素(PEN /链球菌),并用1 ml DPBS。
  4. 手动刮盘的殖民地,一个额外的1笔/链球菌毫升DPBS冲洗井,每个细胞悬液1毫升等分转移到1.5 ml离心管。
  5. 简单地说,在8000 X克旋转的离心管吸出上清,重新悬浮颗粒,用钢笔/链球菌500μL DPBS。
  6. 为了帮助结合在一起,供移植的细胞,每管加入100μL1毫克/毫升菜豆在DPBS凝集素(PHA)。
  7. 细胞/ PHA的悬挂在室温孵育5分钟,然后分拆为2分钟在8000 X克。旋转180 °的管内的转子井和自旋为2分钟在8000 X克。
  8. 小心吸出上清液,留下颗粒完好无损。
  9. 打跑管细胞沉淀轻轻吹打200μLKSR颗粒边缘,直到它慢慢升起。
  10. 一旦脱落,立即转移颗粒0.4μmMillicell小插入,放置在含3毫升KSR,直径为3.5厘米的井,并在37 ° C / 5%的CO 2为2小时至过夜孵育。

三。肾包膜移植术

  1. 执行根据使用适当的无菌技术体制指引,所​​有的动物程序。
  2. 麻醉的免疫缺陷米色小鼠(CB17.Cg Prkdc SCID Lyst BG / CRL),年龄在8-12周,使用吸入3%isoflurane/0.5%O2和腹腔tribromoethanol(Avertin; 25毫克/公斤新鲜配制)的组合。将嫁接使用技术(10)每鼠细胞颗粒。
  3. 放在加热垫,以防止低温鼠标后,刮胡子的切口面积,然后用洗必泰消毒。在一个2.5厘米的切口,通过皮肤,但只是偏离中心脊柱平行。
  4. 保持无菌盐度的切口面积潮湿E,通过肌肉的小切口,肋骨下方,从脊椎〜1厘米。切口应足够大,以拉肾脏通过,但足够小,没有力量,肾将不滑进入腹腔。
  5. 通过肌肉的切口,用一个玻璃巴斯德吸管已拉成钝,略呈弧形钩的形状,轻轻地拉出肾脏。
  6. 湿用无菌DPBS的肾脏,以防止晒出胶囊。重复整个过程中,胶囊是很脆弱的的,这可能是必要的。
  7. 使用杜蒙#5镊子,轻轻一拉胶囊从肾脏和一个2毫米的切口,用Vannas弹簧剪刀。
  8. 已拉成很细的,迟钝的探头与另一玻璃吸管,胶囊和肾脏之间的一个小口袋。
  9. 利用大孔放置在一次性移液管吸头,从Millicell小插入一个单细胞沉淀。请一定要采取尽可能一点额外的媒体,多余的介质可以干扰颗粒转移。
  10. 按住切口创建口袋的边缘,轻轻地放在旁开的颗粒,并推入朝拉吸管肾脏的一极的口袋。
  11. 重复第二个颗粒的过程。下放置相同的肾囊,而是朝着相反的一极。
  12. 小心地将胶囊回落到颗粒。颗粒应留在口袋,没有缝线有必要关闭胶囊。
  13. 轻轻推入肾,进入腹腔,关闭使用附加的反向切割针4-0丝缝线(或更小的)的肌壁。切口应足够小,只有一个单一的缝合是必要的。
  14. 关闭了一系列4-5中断针的皮肤,使用相同的缝合材料。
  15. 之前,它在笼中放置鼠标,作为短期和长期的止痛药0.05毫克/公斤丁丙诺啡(11,12)和5毫克/公斤酮基布洛芬(12,13),分别。受控物质只应按照机构指引。
  16. 动物转移到笼子里,并允许它恢复从麻醉加热垫。这大约需要20-30分钟。
  17. 一旦鼠标是完全卧床,它可以返回畜舍设施。

四。畸胎瘤的收获,固定和切片

  1. 在手术后8-12周,应该有一个肾脏附近勉强扪畸胎瘤。大,充满液体的囊肿,往往会以及发展,在6-8个星期开始。如果他们造成困扰的动物,这可能需要一个早期收获。然而,由于增长速度比囊肿畸胎瘤,你会希望尽可能长时间等待来获得足够的规模进行分析( 至少8个星期)的畸胎瘤。
  2. 取出的肾,畸胎瘤,并使用相同的手术方法,其中肾最初访问,从腹部腔作为一个组织块周围的任何囊肿(见第三节,步骤1-4以上)。
  3. 整个切除组织块放入一个含有10%的福尔马林管。
  4. 允许畸胎瘤固定在4℃过夜° C。
  5. 次日,从管中删除的畸胎瘤。解剖,不破坏本身的畸胎瘤( 图3)任何可能与尽可能多的肾囊肿。较大的畸胎瘤可能被削减了一半,以方便清扫和嵌入。
  6. 使用标准的石蜡固定技术工艺的畸胎瘤。自动单位( 例如 ,Shandon超中心):
    80%的Flex酒精 2个小时
    二。 80%的Flex酒精 1小时
    三。 85%的Flex酒精 1.5小时
    四。 95%的Flex酒精 1小时
    Flex的酒精100% 1小时
    六。 Flex的酒精100% 1小时
    七。 Flex的酒精100% 1小时
    八。 清除祭3 1小时
    九。 清除祭3 1小时
    X。 清除祭3 1小时
    十一。 石蜡(TissuePrep) 2个小时
    十二。 石蜡(TissuePrep) 2个小时

五,免疫组织化学和分析

  1. 一旦嵌入石蜡,第畸胎瘤在使用旋转式切片机5μm的串行片,幻灯片上的浮动部分。
  2. 染色前,烘烤至少一小时的幻灯片。
  3. 苏木精和曙红染色的幻灯片,使用标准的方法来识别每个三个胚层( 4)的组织结构代表:
    二甲苯洗 3-5分钟
    二。 二甲苯 3-5分钟
    三。 100%的酒精 3-5分钟
    四。 100%的酒精 3-5分钟
    95%的酒精 3-5分钟
    六。 80%的酒精 3-5分钟
    七。 水洗(一些变化) 2分钟
    八。 吉尔的苏木#3 2-5分钟
    九。 水洗(一些变化) 直到水运行明确
    X。 斯科特的水(蓝色细胞核) 3分钟或更长时间
    十一。 水洗(一些变化) 1-2分钟
    十二。 曙红Y 1分钟
    十三。 水洗(一些变化) 30秒
    十四。 80%的酒精 1分钟
    十五。 95%的酒精 2分钟
    十六。 95%的酒精 2分钟
    十七。 100%的酒精 3分钟
    十八。 100%的酒精(清洁) 3分钟
    十九。 二甲苯 2分钟或更长时间
    二十。 二甲苯 2分钟或更长时间
  4. 山Permount与每个幻灯片上的盖玻片。

六。代表性的成果

图1
图1。电镀照射CF1的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层未分化的胚胎干细胞培养。MEFs镀〜50%汇合,在这里显示,或4 × 10 5细胞,每3.5厘米,直径在6孔培养皿。酒吧,100微米。

图2
图2。在MEF饲养层的未分化的胚胎干细胞subconfluent文化的例子。人类胚胎干细胞是生长在MEF饲养层〜70%汇合之前,如下所示,然后传所述。酒吧,100微米。

图3
图3。 explanted畸胎瘤的范例 。explantation,畸胎瘤,肾,任何配件的组织固定在福尔马林块,然后肾和配套组织都经过精心修剪掉之前,石蜡包埋。

图4
图4。未分化的胚胎干细胞衍生的畸胎瘤包含在体内的所有三个胚层组织的代表。一个畸胎瘤如图3所示的切片,苏木精和曙红染色,以确定胚胎组织。人类胚胎干细胞会引起所有三个胚层(外胚层(A,B),中胚层(C)内胚层衍生组织(四)。 (一)新生的神经管结构。 (二)原始鳞状上皮。 (三)软骨所包围简明间质胶囊。 (四)肠腺结构。酒吧,100微米。图片作者许可转载。

图5
图5。畸胎瘤分析可用于地图上的标签,未分化的胚胎干细胞的命运,正如先前公布(9),特别标记的未标记的胚胎干细胞的人类胚胎干细胞的混合物,可用于地图标记的细胞在畸胎瘤形成实验的命运。如上所示,未分化的胚胎干细胞表达的表面标志,CD133,和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记,无标记的,未分化的胚胎干细胞混合。这些都是用于肾移植术胶囊形成的畸胎瘤。苏木精和曙红染色畸胎瘤部分抗- EGFP抗体的免疫组织化学分析表明神经外胚层的CD133 +的人类胚胎干细胞的命运。畸胎瘤进行了处理, 如图4和抗- EGFP抗体( 棕色 )counterstained本地化内组织的CD133 + GFP +细胞的衍生工具。观察从胚胎外胚层,特别是神经上皮( )和新生的神经管样结构( )所产生的组织的CD133 +源性细胞(箭头)。酒吧,100微米。图片作者许可转载。

明胶

  • 猪明胶0.1%
  • 99.9%DPBS
    • 添加明胶DPBS,在37 ° C的一个小时或直到所有的明胶成溶液,过滤和消毒(0.22μm的)在使用前孵育。

MEF的介质

  • 10%胎牛血清(合格)
  • 90%贝科的修改必要的中等(D - MEM)
  • 1X大号-谷氨酰胺
  • 1X笔/链球菌
    • 过滤器在使用前消毒。

KSR(淘汰赛血清替代)中型

  • 20%的淘汰赛血清替代
  • 80%的基因敲除的D - MEM
  • 1X大号-谷氨酰胺
  • 1X非必需氨基酸
  • 0.1毫米β-巯基乙醇/
  • 12.5纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子
    • 过滤消毒。
    • 储存于4 ° C,但加热到37℃前加入到细胞。
    • 使用前添加碱性成纤维细胞生长因子。

胶原酶

  • 配售为1-2小时或在37 ° C到溶液中去,直到所有粉末溶解在KSR介质1毫克/毫升。
  • 过滤消毒。

Avertin

  • 2,2,2 - tribromoethanol 0.25克
  • 0.25毫升2 - 甲基-2 - 丁醇
    • 在37 ° C孵育过夜,以形成100%的解决方案。
    • 手术前的几个小时,稀释至2.5%的工作液使用DPBS和孵化,在37 ° C为至少1小时。
    • 过滤消毒和分装。
    • Tribromoethanol光非常敏感,所以在编制和使用的各个阶段保护光。
    • 使用前准备不超过12-24小时。

丁丙诺啡

  • 1毫克/毫升原液甲醇
    • 稀释至0.015毫克/毫升工作液用无菌H 2 O。
    • 在-20 ° C存储长达1个月。

酮基布洛芬

  • 0.5 mg / ml的工作液在DPBS
    • 添加DPBS,孵化过夜,于37 ° C的1-2个小时,直到所有粉末成溶液。
    • 过滤消毒,并储存于4 ° C。

Discussion

我们已经适应了一个高效的映射在体内环境中的人类胚胎干细胞分化的命运的目的畸胎瘤形成实验。一个专门挑选的人类胚胎干细胞的数量少,混合的未分化的野生型胚胎干细胞和菜豆凝集素,形成一个细胞沉淀。这是嫁接在免疫缺陷小鼠的肾囊下方。最初选定的人类胚胎干细胞的命运,然后可以通过免疫组化( 5)确定,如前呈报(9 )。这种方法提供了有价值的工具,识别和生成组织特定试剂,细胞治疗。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是支持由来自加州再生医学研究所(RC1 - 00104),公共卫生服务津贴(HL085377)从NHLBI,以及从波林基金会的礼物,以恒生银行的综合研究资助

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 240486 Avertin
2,2,2-Tribrom–thanol Sigma-Aldrich T48402 Avertin
4-0 silk sutures Ethicon Inc. 641G
bFGF R&D Systems 233FB
Buprenorphine Sigma-Aldrich B7536
Clear-Rite 3 Fisher Scientific 22-046-341
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138
D-MEM Invitrogen 11965
DPBS Invitrogen 14190
Dupont #5 forceps World Precision Instruments, Inc. 500233 Kidney capsule
Eosin Y Fisher Scientific 23-245-658
Fetal Bovine Serum (Qualified) Invitrogen 26140-079
Flex alcohol Fisher Scientific 22-046344
Gill’s Hematoxylin #3 Fisher Scientific 22-050-204
Hemostat, straight World Precision Instruments, Inc. 501241 General surgery
Iris forceps World Precision Instruments, Inc. 15914 General surgery
Ketoprofen Sigma-Aldrich K2012
KnockOut D-MEM Invitrogen 10829
KnockOut Serum Replacement Invitrogen 10828-028
L-glutamine Invitrogen 25020-081
MILLICELL inserts EMD Millipore PICM01250
Nonessential Amino Acids Invitrogen 11140-050
Operating scissors World Precision Instruments, Inc. 501754 General surgery
Paraffin (TissuePrep) Fisher Scientific 8002-74-02
Pen/Strep Invitrogen 15140-122
Permount Fisher Scientific SP15-100
PHA Sigma-Aldrich L1668
Porcine gelatin Sigma-Aldrich G6144
ROCK inhibitor Calbiochem Y-27632
SCID beige mice Charles River Laboratories 250
Scott’s Wash Fisher Scientific 6697-32 Ricca Chemicals
Vannas spring scissors World Precision Instruments, Inc. 14003 Kidney capsule
β-mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522

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References

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