توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

الانقاذ من فيروسات الانفلونزا من الحمض النووي البلازميد هو تقنية أساسية وضرورية التجريبية التي تسمح للباحثين لتوليد فيروسات الانفلونزا المؤتلف لدراسة جوانب متعددة في البيولوجيا من فيروس الانفلونزا ، وإلى أن تستخدم ناقلات المحتملة أو اللقاحات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA. J. Vis. Exp. (42), e2057, doi:10.3791/2057 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد بذلت جهود من قبل عدد من المجموعات البحثية الأنفلونزا محوريا في تطوير وتحسين الأنفلونزا من الوراثة عكس الفيروس. أنشئت أصلا في عام 1999

Protocol

1. فيروس الانفلونزا ترنسفكأيشن الانقاذ

فيروس انفلونزا تنتمي إلى أسرة Orthomyxoviridae فيروسات الحمض النووي الريبي يلفها السلبية الذين تقطعت بهم السبل. الأنفلونزا فيروس A الجينوم يتكون من ثمانية جينات مختلفة من الحمض النووي الريبي القطبية السلبية التي ترميز ، على الأقل ، و 11 من البروتينات الفيروسية (الشكل 1) 4. سنركز في هذا التقرير ، على إنقاذ واحد من سلالة المختبر الأكثر شيوعا ، وأنفلونزا A/PR/8/34 ، 5 باستخدام البلازميدات ambisense (pDZ) يحتوي على 8 شرائح A/PR/8/34 الأنفلونزا الفيروسية ( الشكل 2).

للانقاذ من فيروسات الانفلونزا المؤتلف من الحمض النووي البلازميد ، نوصي 3 transfections مستقلة لكل فيروس المؤتلف. إذا حاولت أكثر من انقاذ فيروس المؤتلف ، وجدول الخطوات التالية accordantly لعدد من الفيروسات لانقاذهم. يتم تأسيس ترنسفكأيشن التالية وبروتوكول العدوى لمدة 6 لوحات رفاه. ويتضح تمثيل التخطيطي للبروتوكول في الشكل 3.

  1. OptiMEM Lipofectamine - 2000 (LPF2000) الخليط : إعداد 250 ميكرولتر من وسائل الاعلام OptiMEM و 6-8 ميكرولتر من LPF2000 ترنسفكأيشن الواحد. احتضان لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). وفي الوقت نفسه ، وإعداد خليط ترنسفكأيشن البلازميد.
  2. البلازميد خليط ترنسفكأيشن : تحضير الكوكتيل ترنسفكأيشن البلازميد في 50 ميكرولتر من وسائل الاعلام OptiMEM. نستخدم عادة 1 ميكروغرام لكل DNA البلازميد الأنفلونزا في الانقاذ. إضافة 1 ميكروليتر من البلازميدات pDZ (في 1 ميكروغرام / ميكرولتر) PB2 ، PB1 ، والسلطة الفلسطينية ، المغير ، NP ، NA ، M ، وNS لأنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من وسائل الاعلام OptiMEM.
  3. OptiMEM - LPF2000 الدنا خليط البلازميد : أضف 250 ميكرولتر من الخطوة 1.1 في خليط DNA البلازميد ترنسفكأيشن الأنفلونزا (الخطوة 1.2). احتضان هذا الخليط لمدة 20-30 دقيقة في RT. وفي الوقت نفسه ، وإعداد تعليق من الخلايا 293T وMDCK لترنسفكأيشن.
  4. إعداد 293T/MDCK الثقافة المشتركة : قبل أن تبدأ ، وجعل 1X PBS ، DMEM FBS 10 ٪ 1 ٪ وسائل الاعلام PS ، وخليط EDTA - التربسين إلى 37 درجة مئوية. وينبغي أن كثافة الخلايا تكون في التقاء 80-90 ٪ في اليوم من ترنسفكأيشن. عادة ، يمكن أن تستخدم واحدة متموجة طبق بقطر 100 ملم واحد من 293T متموجة طبق بقطر 100 ملم من الخلايا لمدة 10-12 MDCK الإنقاذ. نحن نذهب إلى استخدام 250 خلية لكل ميكرولتر من جيد. وسيتم معلق الخلية في كلا الخطين ما مجموعه 3 مل من FBS DMEM PS 10 ٪ 1 ٪.
    • resuspend بعناية كل سطر الخلية في 10 مل من FBS DMEM PS 10 ٪ 1 ٪ في أنبوب 15 مل الطرد المركزي. سيكون لديك أنبوب واحد لخلايا 293T وأنبوب واحد لخلايا MDCK.
    • Resuspend الخلايا 293T في 3 مل من FBS DMEM PS 10 ٪ 1 ٪ ، وعندما معلق ، وتقديم 3 مل إلى الخلايا MDCK resuspend لتلك الخلايا. هذا وسوف تعطيك مزيجا من الخلايا 293T وMDCK لاستخدامها للثقافة المشترك الخاص.
    • إضافة 250 ميكرولتر من الخلايا 293T/MDCK لكل بئر (10-12 6 آبار جيدا).
  5. بعد حضانة RT 20-30 دقيقة (الخطوة 1.3) ، إضافة 1 مل من FBS DMEM PS 10 ٪ 1 ٪ إلى خليط DNA - OptiMEM LPF2000 الأنفلونزا البلازميد.
  6. إضافة مل 1.3 (1.5 خطوة) في الآبار مع ميكرولتر 250 من خلايا 293T/MDCK (الخطوة 1.4).
  7. يهز بلطف 6 - جيدا لوحة ، والسماح للاحتضان ترنسفكأيشن بين عشية وضحاها (ON) في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2.
  8. اليوم التالي ، وحوالي 16-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن ، وتغير وسائل الاعلام واحتضان ترنسفكأيشن الخلايا على درجة البكالوريوس في transfected DMEM 0.3 ٪ 1 ٪ PS يحتوي على 1 ميكروغرام / مل من TPCK - التربسين لمدة 48 ساعة.
  9. بعد 48 ساعة من تغيير وسائل الإعلام ، ونقل طاف من الخلايا transfected في أنبوب microcentrifuge.
  10. أجهزة الطرد المركزي لطاف زراعة الأنسجة في microcentrifuge لمدة 1-2 دقائق ، 13000 دورة في الدقيقة.
  11. إصابة خلايا جديدة في MDCK 6 - جيدا لوحات (مطلي قبل يوم واحد) أو بيض الدجاج 10 يوما من العمر المحتوي مع 200 ميكرولتر من طرد supernatants زراعة الأنسجة من الخطوة 1.10. احتضان الخلايا و / أو البيض عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
    1. يتم تنفيذ كافة الإجراءات التي تصيب الدجاج البيض المحتوي تحت ظروف معقمة : العدوى من بيض الدجاج لمدة 10 أيام عمره المحتوي.
      1. شمعة البيض 10 يوما باستخدام مربع الضوء تشميع لرؤية التفاعل بين كيس الهواء وجوف السقاء. جعل علامة قلم رصاص على الحدود واجهة.
      2. بإبرة حقنة 5 مل جعل حفرة في قشرة البيضة.
      3. مع حقنة 1 مل ، تصيب كل البيض مع 200 ميكرولتر من supernatants زراعة الأنسجة من الخطوة 1.10.
      4. تغطية فتحة في قشر البيض مع ذاب الشمع باستخدام مسحة القطن.
      5. احتضان البيض المصابة في 37οC لمدة 2-3 أيام.
    2. إصابة خلايا جديدة MDCK : قبل يوم من مرور طاف زراعة الأنسجة من 293T/MDCK المشترك الثقافات ، قبلأطباق حلج وحة 6 بشكل جيد مع الخلايا للوصول إلى نقطة التقاء MDCK 80-90 ٪ في اليوم التالي. عادة ، يمكن تقسيم الأنسجة متموجة 100 ملم لوحة الثقافة في 08/06 الآبار. غسل الخلايا ، مرتين ، مع 1X PBS ، يعرض للتريبسين وإعداد لوحات 6 - جيدا. هزة برفق باليد على لوحات من أجل أن يكون توزيع الزي الرسمي للخلايا. ثقافة الخلايا ، ON ، في الحاضنة 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2. قبل الإصابة ، والتحقق من الخلايا تحت المجهر لتأكيد أحادي الطبقة ، ثم انتقل مع العدوى :
      • غسل الخلايا ، مرتين ، مع 1 مل من 1X PBS.
      • تصيب مع ميكرولتر 200 من طرد supernatants زراعة الأنسجة لمدة 1 ساعة على RT. لا تدع الخلايا الجافة. صخرة 6 - جيدا لوحة كل 10 دقائق.
      • بعد 1 ساعة من امتصاص الفيروسية ، وإزالة وسائل الإعلام العدوى من الخلايا MDCK وإضافة 2 مل من 0.3 ٪ BA DMEM PS 1 ٪ يحتوي على 1 ميكروغرام / مل من TPCK - التربسين.
      • في 48-72 ساعة بعد مرور ، اعتمادا على كفاءة ترنسفكأيشن وتحميل الفيروس ، وتأثير الاعتلال الخلوي (CPE) يمكن ملاحظتها في الخلايا المصابة MDCK. CPE تقترح خطة انقاذ ناجحة. ومع ذلك ، ينبغي أن تزال هناك مقايسة HA (القسم 2) يجب القيام بها لتأكيد وجود الفيروس في supernatants زراعة الأنسجة.
  12. يتم تنفيذ كافة الإجراءات لحصاد السائل السقائي من البيض المصابة تحت ظروف معقمة : الحصاد السائل السقائي من بيض الدجاج المصاب المحتوي. يمكن حصاده حوالي 8-12 مل من السائل السقائي البيض من كل 10 يوما من عمره مصاب. قبل الحصاد السائل السقائي ، احتضان للبيض الدجاج لمدة 2 ساعة (أو على) في 4 درجات مئوية لقتل الجنين الدجاج وتخثر الدم.
    • غسل قشر البيض مع الايثانول 70 ٪ إلى تهيئة الظروف العقيمة.
    • فتح البيض ، وبعناية ، عبر الهواء عن طريق التنصت على تجويف بملعقة. إزالة قشرة البيضة المكسورة بمساعدة ملقط.
    • بإبرة 1 مل ، إزالة الغشاء السقائي دون كسر صفار البيض و.
    • استقرار الجنين الدجاج مع ملعقة وأنتم تقودون ماصة 10 مل في السائل السقائي. كما جمع السائل السقائي أكبر قدر ممكن من أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل على الجليد في دلو الثلج دون كسر أو جمع أي من صفار البيض و. استخدام أجهزة الطرد المركزي أنبوب 15 مل لكل بيضة.
    • أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية ونقل السائل السقائي (من دون أخذ مكعبات خلايا الدم الحمراء) إلى 15 الطازجة أنابيب الطرد المركزي مل.
    • تخزين السوائل التي تحتوي على أنابيب طرد السقائي في 4 درجات مئوية حتى يتم التحقق من وجود الفيروس انقاذ مع مقايسة (HA) التراص.

2. HA مقايسة لتأكيد الانقاذ لفيروسات الأنفلونزا المؤتلف

يستخدم بشكل روتيني مقايسة التراص الدموي (HA) للكشف عن وجود الفيروس في انقاذ MDCK supernatants زراعة الأنسجة و / أو السائل السقائي البيض المقطوع. بدلا من ذلك ، يمكن المقايسات المناعي (IFA) يقوم أيضا. بمجرد أن يحدد الفحص وجود الفيروس انقاذ ، ينبغي أن يكون الفيروس وحة المنقى وسيتم التأكيد على التركيب الجيني للفيروس الذي RT - PCR وتسلسلها.

ويمكن تحديد وجود الفيروس في supernatants نسيج الثقافة MDCK و / أو في السائل السقائي من البيض المصابة به ظاهريا هكتار من الدجاج (أو مصدر آخر) خلايا الدم الحمراء (RBC). وجود الفيروس من RBC يدفع التراص في حين أن عدم وجود الفيروس يسمح تشكيل بيليه الحمراء في قاع البئر (الشكل 4). في حالة من فيروس الانفلونزا ، ويعتقد أن هناك حاجة وحدات اللوحة حوالي 10 3 4 -10 تشكيل (PFU) لإعطاء إشارة إيجابية في مقايسة HA ، وبالتالي ، يمكن أن يتم تنفيذ ايفا بالتوازي مع مقايسة لتأكيد HA نتيجة حقيقية سلبية. ايفا مع أضداد الأنفلونزا الأساسي هو أكثر حساسية من مقايسة HA لأنه يمكن الكشف عن أقل من 103-104 الفيروسات مع هذه التقنية. فمن الممكن من supernatants أو السوائل التي يتم السقائي HA - السلبية ايجابية من قبل شركة ايفا. في هذه الحالة ، ينبغي تضخيم الفيروس عن طريق الركض ، مرة أخرى ، أو في خلايا MDCK في البيض. وينبغي أن السائل السقائي و / أو supernatants زراعة الأنسجة من مرور الثانية ستكون إيجابية بشكل واضح الآن في مقايسة HA.

وتجرى فحوصات HA في لوحات 96 - V - جيدا القاع. السلبية (على سبيل المثال ، في برنامج تلفزيوني 1X) وإيجابية ينبغي (supernatants زراعة الأنسجة و / أو السائل السقائي من عدوى فيروس الأنفلونزا) دائما عينات مراقبة يتم تضمينها في أي فحص للتحقق من صحة HA عليه.

  • الاستغناء عن 50 ميكروليتر من PBS 1X في كل بئر من القاع - V - 96 لوحة جيدا.
  • إضافة ميكرولتر من 50وزراعة الأنسجة MDCK supernatants و / أو السائل السقائي من البيض المصابة إلى البئر الأولى ، وجعل 2 أضعاف التخفيفات التسلسلي للآبار التالية. تجاهل إضافية تبلغ 50 ميكرولتر من البئر الماضي.
  • إضافة 50 ميكرولتر 0.5 ٪ -1.0 ٪ خلايا الدم الحمراء الدجاج (المعد في برنامج تلفزيوني 1X) إلى كل بئر.
  • احتضان لV - 96 - أسفل جيدا لوحة 30-45 دقيقة (حتى نقطة حمراء واضحة في الجزء السفلي من عينة السيطرة السلبية PBS) على الجليد. قراءة وinterpretate النتائج كما هو مبين في الشكل 4.

3. مرور supernatants زراعة الأنسجة

قد تكون نتيجة الفحص سلبية في HA يكون نتيجة لانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن مع مستويات منخفضة من الفيروس الموجود حاليا في supernatants زراعة الأنسجة و / أو السوائل السقاء. ومرور هذه العينات في البيض الطازج MDCK و / أو المحتوي تسمح التضخيم من الفيروس (كما هو مبين في الشكل 3) تتم العدوى كما هو موضح سابقا في القسم 1.11.2.

4. ممثل النتائج

وسيتم تأكيد نجاح الانقاذ بواسطة فيروس الانفلونزا وجود فحص ايجابي HA (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، فإن وجود CPE في الخلايا المصابة مع supernatants زراعة الأنسجة أو مع البيض السائل السقائي من اقتراح الانقاذ ايجابية الفيروسية.

الشكل 1
الشكل 1. إنفلونزا بنية الفيروسات : فيروس الأنفلونزا ويحيط بها طبقة ثنائية المادة الدهنية التي تحتوي على جليكوبروتينات two الفيروسي (HA ، NA) ، وأيضا البروتين القناة الايونية ، M2. ها هو البروتين الفيروسي المرفق ، وهو مسؤول عن الربط السياليك المحتوية على حامض المستقبلات. NA هي المسؤولة عن اطلاق سراح الفيروسية من الخلايا المضيفة. تحت طبقة ثنائية المادة الدهنية ، هي طبقة من البروتين يتكون من البروتين السطح الداخلي المغلف مصفوفة 1 ، M1 ، والتي تلعب دورا في التجمع الفيريون والناشئين والبروتين النووي المصدرة (النيب) ، واللازمة لتصدير المواد النووية من ribonucleocapsids الفيروسية. يرصد الأساسية للفيروس من مجمع (RNP) بروتين نووي ريبوزي ، التي تتألف من 8 المفرد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي الجينات الفيروسية encapsidated السلبية التي البروتين النووي الفيروسي ، NP. المرتبطة RNP المعقدة هي الفيروسية بوليميريز الحمض النووي الريبي النووي الريبي التي تعتمد على مفارز السلطة الفلسطينية ، PB1 وPB2. البروتينات غير البنيوية وNS1 PB1 F2 ، المشفرة بواسطة الحمض النووي الريبي وشرائح NS PB1 ، على التوالي ، ليست جزءا من هيكل الفيريون.

الشكل 2
الشكل 2. البلازميدات الأنفلونزا فيروس الإنقاذ : يشار إلى أن فيروس انفلونزا eight الجينات المستنسخة في pDZ ambisense البلازميد. pDZ البلازميد 6 ، المستمدة من بروتين تعبير البلازميد pCAGGs 7 ، هي ناقلات ثنائية الاتجاه البلازميد مع بوليميريز الحمض النووي الريبي الإنسان أنا المروج وتسلسل فاصل الفأر الذي بترميز الجينومية بالمعنى السلبي الحمض النووي الريبي ، في اتجاه معاكس للبوليميريز أنا توحد ، والثاني بوليميريز الكاسيت النسخ (دجاج β - أكتين المروج وpolyA) بترميز البروتينات الفيروسية من الجينات الفيروسية نفسها. تتولد من كل قطعة cDNAs الفيروسية التي كتبها RT - PCR مع الاشعال إلى الأمام وعكس نوكلياز داخلية تحتوي على قيود SAPI الموقع والمناطق noncoding كل جزء (مربعات سوداء في نهاية الجينات الفيروسية). هو استنساخ للمنتج PCR في pDZ يهضم مع SAP - I.

الشكل 3
الشكل 3. ثمانية البلازميد المستندة إلى نظام الانقاذ الإنفلونزا : هي البلازميدات pDZ تحتوي على جينات الأنفلونزا الفيروسية 8 transfected المشترك ، في التعليق ، في 293T - MDCK الخلايا المشترك الثقافات (يوم 1). يتم استبدال أربع وعشرين ساعة بعد ترنسفكأيشن وسائل الاعلام ولكن من دون FBS تحتوي TPCK / التربسين (يوم 2). ثمان وأربعين ساعة بعد تغيير وسائل الإعلام ، هو المقطوع طاف نسيج الثقافة وتستخدم لنقل العدوى MDCK أو 10 يوما القديمة بيض الدجاج المحتوي (يوم 4). ويتم حصاد 48-72 ساعة بعد التضخيم ، supernatants زراعة الأنسجة من الخلايا المصابة MDCK أو السائل السقائي من البيض ويعاير عن وجود الفيروس بواسطة HA (اليوم 6). إذا لم يتم الكشف عن الفيروس ، يمكن supernatants نفسه و / أو السوائل السقائي إعادة passaged الى خلايا MDCK جديدة و / أو البيض المحتوي.

الشكل 4
الشكل 4. راصة دموية مقايسة (HA) : RBC التراص من جسيمات الفيروس التي مرئيا وظاهريا هو الأساس للكشف عن الجسيمات الفيروسية في supernatants زراعة الأنسجة و / أو السوائل السقاء. على الرغم من أن الفحص HA لا يميز بين الجزيئات الفيروسية المعدية التي والجزيئات التي تتدهور وأنه لم يعد قادرا على إصابة الخلايا ، مقايسة يعد مؤشرا جيدا من وجود الفيروس في العينات. أ) يتم تحديد الغياب (أعلى) وجود (القاع) من الفيروس في العينات البيولوجية بواسطة جود RBC في الجزء السفلي من لوحة أو غيابهم ، التركيبectively. ب) ويرد ممثل عن نتيجة الفحص HA دون المستويات التي يمكن اكتشافها من فيروس (أعلى) أو وجود (القاع) من الفيروس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الانقاذ من فيروسات الانفلونزا المؤتلف من الحمض النووي البلازميد هو عملية بسيطة ومباشرة مرة واحدة يتم تنفيذ البروتوكول بشكل روتيني في المختبر ، ولكن في البداية ، يمكن للعديد من الأمور على غير ما يرام. لا بد أن يكون إعداد البلازميد جيدة لتوليد الفيروس. الصيانة السليمة للخطوط الخلية (293T وMDCK) أمر حاسم لانقاذ الفيروسية الناجحة. تقليديا ، يتم إدراج العلامة الجينية الى الأنفلونزا الجينات ترميز البلازميد ، عن طريق الطفرات الصامتة. مقدمة هذا التحول الصامت (ق) وخلق ، على سبيل المثال ، يتم استخدام انزيم التقييد موقع الرواية للتمييز بين نوع البرية والمؤتلف فيروس الانفلونزا بواسطة انزيم الهضم. لذا ، وبعد التضخيم من البلاك تنقية الفيروس المؤتلف ، ينبغي القيام RT - PCR وتسلسل النهج للتحقق من طبيعة الفيروس انقاذهم. وسوف تطور هذه التقنيات الوراثة العكسية وانقاذ ناجحة لفيروسات الأنفلونزا المؤتلف من البلازميدات تسمح لك للرد على أسئلة محددة حول بيولوجيا الفيروس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جبل سيناء كلية الطب وحقوق الملكية الفكرية في مجال فيروسات الأنفلونزا المؤتلف ، وAG - S هو المخترع في هذه الملكية الفكرية.

Acknowledgments

الكتاب أريد أن أشكر أعضاء سابقون وحاليون في أدولفو غارسيا ساستري وبيتر باليس مختبرات لتطوير تقنيات الوراثة عكس الإنفلونزا والبلازميدات. وتمول جزئيا البحوث في مختبرات AG - S و التراث ، وهو مركز NIAID الممولة من التميز لأبحاث الأنفلونزا ومراقبة (HHSN266200700010C) ، ومنح NIAD R01AI046954 ، وU01AI070469 P01AI058113. ويمول جزئيا البحث في LM - S المختبر منح NIAID RO1AI077719.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11995-065 Store at 4°C
OptiMEM Invitrogen 51985-034 Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019 Store at 4°C
TPCK-trypsin Sigma-Aldrich T-8802 Store at -20°C
Bovine Albumin (BA) Sigma-Aldrich A7979 Store at 4°C
Trypsin-EDTA Invitrogen 25300-054 Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X Invitrogen 15140-122 Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates Nalge Nunc international 249570

Embryonated chicken eggs

Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures.

Chicken red blood cells (RBC)

Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC).

Tissue culture supernatants and allantoic fluids

Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C.

Plasmids

All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2.

Viruses

The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed.

Tissue culture media and solutions

DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media.

10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.

1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).
  2. Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J Virol. 73, 9679-9682 (1999).
  3. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Recombinant influenza virus vectors. Future Virology. 2, 401-416 (2007).
  4. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae. The viruses and their replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. H. 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins. PA, USA. 1647-1689 (2006).
  5. Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).
  6. Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein. J Virol. 79, 8431-8439 (2005).
  7. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).

Comments

3 Comments

  1. The PDF of this article is not possible to download, gives some syntex error. Please make it fixed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2010 - 12:33 PM
  2. Yes it is like this. Please correct it.

    Reply
    Posted by: Muhammad M.
    August 21, 2010 - 12:43 PM
  3. Our apologies. This has been fixed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2010 - 12:50 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics