पुनः संयोजक इन्फ्लुएंजा वायरस के डीएनए प्लाज्मिड से पीढ़ी

Immunology and Infection

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Summary

प्लास्मिड डीएनए से इन्फ्लूएंजा ए वायरस के बचाव एक बुनियादी और आवश्यक प्रयोगात्मक तकनीक है कि इन्फ्लूएंजा शोधकर्ताओं उत्पन्न करने के लिए पुनः संयोजक वायरस इन्फ्लूएंजा वायरस के जीव विज्ञान में कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए, और संभावित वैक्टर या टीके के रूप में इस्तेमाल किया जा अनुमति देता है.

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Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA. J. Vis. Exp. (42), e2057, doi:10.3791/2057 (2010).

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Abstract

इन्फ्लूएंजा अनुसंधान समूहों की एक संख्या से प्रयास और एक इन्फ्लूएंजा वायरस रिवर्स आनुवंशिकी के विकास में सुधार में निर्णायक किया गया है. मूलतः 1999 में स्थापित

Protocol

1. इन्फ्लुएंजा वायरस बचाव अभिकर्मक

इन्फ्लुएंजा ए वायरस Orthomyxoviridae नकारात्मक असहाय आरएनए छा वायरस के परिवार के अंतर्गत आता है है . इन्फ्लूएंजा ए वायरस जीनोम आठ नकारात्मक polarity के विभिन्न आरएनए जीन है कि सांकेतिक शब्दों में बदलना करने के लिए, कम से कम 11 वायरल प्रोटीन (चित्रा 1) 4 के होते हैं. हम इस रिपोर्ट में सबसे आम प्रयोगशाला तनाव, A/PR/8/34 इन्फ्लूएंजा, 5 8 इन्फ्लूएंजा A/PR/8/34 वायरल क्षेत्रों युक्त ambisense (pDZ) plasmids का उपयोग कर के एक के बचाव पर ध्यान दिया जाएगा ( चित्रा 2).

प्लास्मिड डीएनए से पुनः संयोजक इन्फ्लूएंजा वायरस के बचाव के लिए, हम प्रत्येक पुनः संयोजक वायरस के प्रति 3 स्वतंत्र transfections सलाह देते हैं. यदि एक से अधिक पुनः संयोजक वायरस बचाव करने का प्रयास है, निम्न चरणों का पालन accordantly वायरस की संख्या करने के लिए बचाया जा पैमाने पर. निम्नलिखित अभिकर्मक और संक्रमण प्रोटोकॉल 6-अच्छी तरह से प्लेटों के लिए स्थापित है. प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 3 में सचित्र है.

  1. मिश्रण 2000 OptiMEM Lipofectamine (LPF2000): OptiMEM मीडिया के 250 μl और LPF2000 प्रति अभिकर्मक के 6-8 μl तैयार. कमरे के तापमान (आर टी) पर 5-10 मिनट के लिए सेते हैं. इस बीच, प्लाज्मिड अभिकर्मक मिश्रण तैयार करते हैं.
  2. प्लाज्मिड अभिकर्मक मिश्रण: OptiMEM मीडिया के 50 μl में प्लाज्मिड अभिकर्मक कॉकटेल तैयार है. हम आमतौर पर प्रत्येक इन्फ्लूएंजा बचाव प्रति प्लास्मिड डीएनए के एक μg का उपयोग करें. OptiMEM मीडिया के 50 μl युक्त ट्यूब के लिए एक μl pDZ plasmids (1 μg / μl) PB2, PB1, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, हा, एनपी, एनए, एम, और एन एस जोड़ें.
  3. OptiMEM - LPF2000 डीएनए प्लाज्मिड मिश्रण: 1.1 कदम से इन्फ्लूएंजा डीएनए प्लाज्मिड अभिकर्मक मिश्रण (1.2 चरण) में 250 μl जोड़ें. आरटी पर 20-30 मिनट के लिए इस मिश्रण को सेते हैं. इस बीच, अभिकर्मक के लिए 293T और MDCK कोशिकाओं के निलंबन को तैयार करते हैं.
  4. 293T/MDCK सह संस्कृति की तैयारी: शुरू करने से पहले, 37 पीबीएस 1X, DMEM 10% FBS 1% पुनश्च मीडिया, और EDTA trypsin मिश्रण लाने डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं के घनत्व 80-90% के संगम पर अभिकर्मक के दिन किया जाना चाहिए. आमतौर पर, एक मिला हुआ 100 मिमी 293T और एक मिला हुआ MDCK कोशिकाओं के 100 मिमी पकवान के पकवान 10-12 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बचाता है. हम अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की 250 μl का उपयोग करने के लिए जा रहे हैं. दोनों सेल लाइनों DMEM 10% FBS% 1 पी एस 3 मिलीलीटर की एक कुल में resuspended जाएगा.
    • ध्यान DMEM 10% FBS% 1 पी एस के 10 मिलीलीटर में एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में प्रत्येक कोशिका लाइन resuspend. आप 293T और MDCK कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं को एक ट्यूब के लिए एक ट्यूब होगा.
    • Resuspend DMEM 10% FBS% 1 पी एस 3 मिलीलीटर में 293T कोशिकाओं और जब resuspended, MDCK कोशिकाओं 3 मिलीलीटर देने के लिए उन कोशिकाओं resuspend. यह आप 293T और MDCK अपने सह - संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं के मिश्रण दे देंगे.
    • अच्छी तरह से प्रति 293T/MDCK कोशिकाओं (12/10 कुओं 6 अच्छी तरह से) के 250 μl जोड़ें.
  5. 20-30 मिनट के आरटी ऊष्मायन (1.3 कदम) के बाद, OptiMEM - LPF2000-इन्फ्लूएंजा डीएनए प्लाज्मिड मिश्रण DMEM 10% FBS% 1 पी एस के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. कुओं में 293T/MDCK कोशिकाओं के 250 μl (1.4 कदम) के साथ 1.3 मिलीलीटर (1.5 कदम) जोड़ें.
  7. धीरे 6-अच्छी तरह से थाली मिलाने और 37 पर अभिकर्मक सेते रात इनक्यूबेटर में (पर) डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  8. अगले दिन, लगभग 16-24 पोस्ट अभिकर्मक घंटे, अभिकर्मक मीडिया परिवर्तन और DMEM 0.3% बीए% 1 में 48 घंटे के लिए 1 / TPCK trypsin के μg मिलीलीटर युक्त पुनश्च ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं सेते हैं.
  9. मीडिया बदलने के 48 घंटे के बाद, एक microcentrifuge ट्यूब में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण.
  10. 1-2 मिनट, १३००० rpm के लिए एक microcentrifuge में टिशू कल्चर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र.
  11. 6 अच्छी तरह प्लेटें (दिन पहले मढ़वाया) या 10 दिन पुरानी 1.10 कदम से centrifuged टिशू कल्चर supernatants के 200 μl के साथ चिकन अंडे embryonated में ताजा MDCK कोशिकाओं को संक्रमित. कोशिकाओं और / या 37 पर अंडे ° सी 2-3 दिनों के लिए सेते हैं.
    1. 10 दिन पुरानी चिकन embryonated अंडे के संक्रमण: सभी प्रक्रियाओं के चिकन embryonated अंडे संक्रमित बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं.
      1. मोमबत्ती 10 दिन पुरानी प्रकाश candling बॉक्स का उपयोग करने के लिए हवा की थैली और allantoic गुहा के बीच इंटरफेस को देखने के अंडे. इंटरफ़ेस की सीमा पर एक पेंसिल निशान बनाओ.
      2. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज सुई के साथ eggshell में एक छेद बना.
      3. 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ, 1.10 कदम से टिशू कल्चर supernatants के 200 μl के साथ प्रत्येक अंडे को संक्रमित.
      4. पिघला मोम के साथ एक कपास झाड़ू का उपयोग eggshell में छेद को कवर.
      5. 37οC पर 2-3 दिनों के लिए संक्रमित अंडों को सेते हैं.
    2. ताजा MDCK कोशिकाओं के संक्रमण: पारित होने से पहले दिन 293T/MDCK सह संस्कृतियों, पूर्व से टिशू कल्चर सतह पर तैरनेवालाछीलना 6-अच्छी तरह से MDCK कोशिकाओं के साथ थाली बर्तन 80-90% संगम अगले दिन तक पहुँचने के लिए. आमतौर पर, एक मिला हुआ 100 मिमी टिशू कल्चर प्लेट 6-8 कुओं में विभाजित किया जा सकता है. कोशिकाओं धो, दो बार, 1X पीबीएस के साथ trypsinize, और 6 अच्छी तरह प्लेटें तैयार. धीरे हाथ से क्रम में करने के लिए कक्षों की एक वर्दीधारी वितरण प्लेटें हिला. संस्कृति कोशिकाओं, पर, 37 में डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर, 5% सीओ 2. संक्रमण से पहले, खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जांच करने के लिए एक monolayer की पुष्टि, तो संक्रमण के साथ आगे बढ़ना:
      • कोशिकाओं को धो, पीबीएस 1X के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार.
      • आरटी से कम 1 घंटे के लिए centrifuged ऊतक संस्कृति supernatants के 200 μl के साथ संक्रमित. कोशिकाओं सूखी मत देना. 6-अच्छी तरह से थाली रॉक हर 10 मिनट.
      • वायरल अवशोषण के 1 घंटे के बाद, MDCK कोशिकाओं से संक्रमण मीडिया को हटाने और 1 / TPCK trypsin के μg मिलीलीटर युक्त पुनश्च DMEM 0.3% 1 बीए% के 2 मिलीलीटर जोड़ने.
      • 48-72 घंटे में पारित होने के बाद, अभिकर्मक दक्षता और वायरस लोड पर निर्भर करता है, एक cytopathic प्रभाव (CPE) MDCK संक्रमित कोशिकाओं में मनाया जाएगा. CPE एक सफल बचाव पता चलता है. हालांकि, एक हा परख (खंड 2) अभी भी टिशू कल्चर supernatants में वायरस की उपस्थिति की पुष्टि प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  12. हार्वेस्ट संक्रमित चिकन embryonated अंडे से allantoic द्रव: सभी प्रक्रियाओं संक्रमित अंडे से allantoic तरल पदार्थ की फसल बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं. Allantoic द्रव के लगभग 8-12 मिलीलीटर प्रत्येक 10 दिन पुरानी संक्रमित अंडे से काटा जा सकता है है. पहले allantoic द्रव कटाई करने के लिए, 4 में 2 घंटे के लिए चिकन अंडे सेते हैं (पर या) ° सी चिकन भ्रूण को मारने के लिए और रक्त जमना.
    • 70% इथेनॉल के साथ अनावश्यक कार्य धो बाँझ शर्तों की स्थापना की.
    • अंडे खोलें, ध्यान से एक चम्मच के साथ दोहन द्वारा हवा गुहा पर. संदंश की मदद से टूट eggshell निकालें.
    • 1 मिलीलीटर सुई के साथ, अंडे की जर्दी को तोड़ने के बिना allantoic झिल्ली को हटा दें.
    • एक रंग के साथ चिकन भ्रूण स्थिर के रूप में आप allantoic द्रव में एक 10 मिलीलीटर विंदुक गाइड. तोड़ने या अंडे की जर्दी के किसी भी एकत्रित के बिना एक बर्फ बाल्टी में बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में संभव के रूप में ज्यादा allantoic द्रव के रूप में ले लीजिए. प्रत्येक अंडे के लिए एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब का उपयोग करें.
    • 5 मिनट के लिए 4 पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस और एक ताजा 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों allantoic द्रव (pelleted लाल रक्त कोशिकाओं को लेने के बिना) हस्तांतरण.
    • 4 पर centrifuged allantoic तरल पदार्थ युक्त ट्यूबों स्टोर डिग्री सेल्सियस जब तक वे एक hemagglutination परख (हेक्टेयर) के साथ बचाया वायरस की उपस्थिति के लिए जाँच कर रहे हैं.

2. हा पुनर्योगज इन्फ्लूएंजा वायरस के बचाव की पुष्टि परख

Hemagglutination परख (हा) नियमित MDCK टिशू कल्चर supernatants और / या काटा अंडे की allantoic द्रव में बचाया वायरस की उपस्थिति का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. वैकल्पिक रूप से, immunofluorescence assays (यूके) भी किया जा सकता है. एक बार एक परख बचाया वायरस की उपस्थिति की पहचान, वायरस पट्टिका शुद्ध और वायरस की आनुवंशिक संरचना RT-पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा की पुष्टि की जाएगी है होना चाहिए.

MDCK ऊतक संस्कृति supernatants और / या संक्रमित अंडे से allantoic द्रव में वायरस की उपस्थिति macroscopically चिकन के हा (या किसी अन्य स्रोत) लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है है. वायरस की उपस्थिति आरबीसी के hemagglutination लाती है, जबकि वायरस के अभाव में अच्छी तरह के नीचे में एक लाल गोली (चित्रा 4) के गठन की अनुमति देता है. इन्फ्लूएंजा वायरस के मामले में, यह माना जाता है कि लगभग 10 -10 3 4 पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) हा परख में एक सकारात्मक संकेत देने के लिए आवश्यक हैं, इसलिए एक आइएफए हा परख के साथ समानांतर में प्रदर्शन किया जा सकता है पुष्टि करने के लिए एक सच्चे नकारात्मक परिणाम. प्राथमिक विरोधी इन्फ्लूएंजा एंटीबॉडी के साथ आइएफए हा परख की तुलना में अधिक संवेदनशील है क्योंकि कम से कम 103-104 वायरस इस तकनीक के साथ पता लगाया जा सकता है. यह supernatants या allantoic तरल पदार्थ है कि हा नकारात्मक आइएफए द्वारा सकारात्मक रहे हैं की तुलना में संभव है. इस मामले में, वायरस passaging द्वारा परिलक्षित होना चाहिए, फिर MDCK कोशिकाओं में या अंडे में. अब Allantoic तरल पदार्थ और / या ऊतक दूसरे बीतने से संस्कृति supernatants हा परख में स्पष्ट रूप से सकारात्मक होना चाहिए.

हा assays वि नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें में किया जाता है. (उदाहरण के लिए, 1X पीबीएस) नकारात्मक और सकारात्मक (टिशू कल्चर supernatants और / या एक इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण से allantoic तरल पदार्थ) नियंत्रण नमूने हमेशा किसी भी हा परख के लिए यह मान्य में शामिल किया जाना चाहिए.

  • वि नीचे के प्रत्येक अच्छी तरह से थाली 96 अच्छी तरह से में पीबीएस 1X के 50 μl बग़ैर.
  • 50 के μl जोड़ेंMDCK टिशू कल्चर supernatants और / या पहले अच्छी तरह से संक्रमित अंडे और से allantoic द्रव निम्नलिखित कुओं के लिए 2 गुना धारावाहिक dilutions बनाते हैं. अच्छी तरह से पिछले से अतिरिक्त 50 μl त्यागें.
  • 0.5% -1.0% चिकन प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं (पीबीएस 1X में तैयार) के 50 μl जोड़ें.
  • बर्फ पर 96 अच्छी तरह से वि नीचे 30-45 मिनट के लिए थाली (जब तक एक लाल बिंदी एक नकारात्मक नियंत्रण पीबीएस नमूना के नीचे दिखाई देता है) सेते हैं. पढ़ें और परिणाम के रूप में चित्रा 4 में संकेत दिया interpretate.

3. टिशू कल्चर supernatants के पारित होने

हा परख में एक नकारात्मक परिणाम वायरस टिशू कल्चर supernatants और / या allantoic तरल पदार्थ में किया जा रहा है वर्तमान के निम्न स्तर के साथ कम अभिकर्मक दक्षता का एक परिणाम हो सकता है. इन नमूनों की ताजा MDCK और / या embryonated अंडे में पारित होने वायरस का प्रवर्धन की अनुमति (के रूप में 3 चित्र में संकेत दिया) संक्रमण के पहले खंड 1.11.2 में वर्णित के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं.

4. प्रतिनिधि परिणाम

सफल इन्फ्लूएंजा वायरस बचाव एक सकारात्मक हा परख (चित्रा 4) की उपस्थिति द्वारा पुष्टि की जाएगी. इसके अतिरिक्त, टिशू कल्चर supernatants के साथ या अंडे से allantoic तरल पदार्थ के साथ संक्रमित कोशिकाओं में CPE के अस्तित्व को एक सकारात्मक वायरल बचाव का सुझाव देगा.

चित्रा 1
चित्रा 1. इन्फ्लुएंजा वायरस संरचना: इन्फ्लुएंजा वायरस एक लिपिड bilayer युक्त दो वायरल (हा, एनए) glycoproteins और से घिरा हुआ है भी, आयन चैनल प्रोटीन, M2. हा वायरल लगाव प्रोटीन, सियालिक के लिए बाध्य एसिड युक्त रिसेप्टर्स के लिए जिम्मेदार है. एनए मेजबान कोशिकाओं से वायरल रिहाई के लिए जिम्मेदार है. लिपिड bilayer के नीचे, एक प्रोटीन परत भीतरी सतह लिफाफा मैट्रिक्स एक प्रोटीन, M1, जो virion विधानसभा और नवोदित और परमाणु निर्यात (NEP) प्रोटीन वायरल ribonucleocapsids परमाणु निर्यात के लिए आवश्यक में एक भूमिका निभाता है से बना है. वायरस के कोर ribonucleoprotein जटिल (RNP) से बना है, 8 एकल असहाय नकारात्मक आरएनए वायरल वायरल nucleoprotein, एनपी द्वारा encapsidated जीन से बना है. RNP जटिल साथ एसोसिएटेड वायरल शाही सेना पर निर्भर शाही सेना पोलीमरेज़ सब यूनिटों फिलीस्तीनी अथॉरिटी, PB1, और PB2 हैं. गैर संरचनात्मक NS1 प्रोटीन और PB1-F2, शाही सेना के क्षेत्रों एन एस और PB1, क्रमशः द्वारा इनकोडिंग virion संरचना का हिस्सा नहीं हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2. इन्फ्लुएंजा वायरस बचाव plasmids: आठ इन्फ्लूएंजा वायरस ambisense प्लाज्मिड pDZ में क्लोन जीन संकेत कर रहे हैं. प्लाज्मिड pDZ 6, 7 pCAGGs प्लाज्मिड प्रोटीन अभिव्यक्ति से व्युत्पन्न एक मानव आरएनए पोलीमरेज़ मैं प्रमोटर और एक माउस टर्मिनेटर अनुक्रम कि नकारात्मक भावना जीनोमिक शाही सेना encodes के साथ एक द्विदिश प्लाज्मिड वेक्टर है, विपरीत ओरिएंटेशन में पोलीमरेज़ मैं एकजुट, एक पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन कैसेट (चिकन प्रमोटर β actin और Pólya) ही वायरल जीन से वायरल प्रोटीन encodes. प्रत्येक वायरल सेगमेंट से cDNAs आगे और रिवर्स SAPI प्रतिबंध endonuclease साइट और प्रत्येक खंड (वायरल जीनों के अंत में काले बक्से) noncoding क्षेत्रों युक्त प्राइमरों के साथ RT-पीसीआर द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. पीसीआर उत्पाद एसएपी - मैं के साथ पचा pDZ में क्लोन है.

चित्रा 3
चित्रा 3. आठ प्लाज्मिड आधारित इन्फ्लूएंजा बचाव प्रणाली: 8 इन्फ्लूएंजा वायरल जीन युक्त pDZ plasmids सह निलंबन में ट्रांसफ़ेक्ट 293T MDCK सह संस्कृतियों (1 दिन) कोशिकाओं में,. चौबीस बाद अभिकर्मक, मीडिया घंटे FBS बिना लेकिन TPCK / trypsin युक्त (2 दिन) प्रतिस्थापित किया गया है. मीडिया बदलने के बाद चालीस आठ घंटे, टिशू कल्चर सतह पर तैरनेवाला काटा और MDCK या 10 दिन पुरानी embryonated चिकन अंडे (4 दिन) को संक्रमित किया. 48-72 के बाद प्रवर्धन घंटे, ऊतक MDCK संक्रमित कोशिकाओं अंडे से या allantoic तरल पदार्थ से संस्कृति supernatants काटा और हा (6 दिन) द्वारा वायरस की उपस्थिति के लिए assayed. यदि कोई वायरस का पता चला है, वही supernatants और / या allantoic तरल पदार्थ हो सकते हैं और ताजा MDCK कोशिकाओं और / या embryonated अंडे में फिर passaged.

चित्रा 4
चित्रा 4. Hemagglutinin (हेक्टेयर) परख: आरबीसी के वायरस कण द्वारा Hemagglutination दिखाई macroscopically है और टिशू कल्चर supernatants या / और allantoic तरल पदार्थ में वायरल कणों का पता लगाने के लिए आधार है. हालांकि हा परख वायरल कणों कि संक्रामक हैं और कणों कि अपमानित कर रहे हैं और अब कोई कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम के बीच भेदभाव नहीं करता है, परख वायरस के नमूने में उपस्थिति का एक अच्छा संकेत है. ए) जैविक नमूनों में वायरस की उपस्थिति (नीचे) (ऊपर) की अनुपस्थिति प्लेट के नीचे या उनकी अनुपस्थिति, resp में आरबीसी की उपस्थिति द्वारा निर्धारित किया जाता हैectively. बी) वायरस का कोई detectable स्तर (ऊपर) या वायरस की उपस्थिति (नीचे) के साथ एक हा परख से एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है.

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Discussion

प्लास्मिड डीएनए से पुनः संयोजक इन्फ्लूएंजा वायरस के बचाव एक बार प्रोटोकॉल नियमित रूप से प्रयोगशाला में किया जाता है एक सरल और सीधा प्रक्रिया है, लेकिन शुरुआत में, कई बातें गलत जा सकते हैं. यह आवश्यक है के लिए अच्छा प्लाज्मिड तैयारी है वायरस उत्पन्न है. सेल लाइनों (293T और MDCK) के उचित रखरखाव के लिए एक सफल वायरल बचाव के लिए महत्वपूर्ण है. परंपरागत रूप से, एक आनुवंशिक टैग एक इन्फ्लूएंजा प्लाज्मिड जीन एन्कोडिंग में डाला जाता है चुप mutagenesis के द्वारा. इस मूक उत्परिवर्तन (ओं) और की, उदाहरण के लिए सृजन का परिचय, एक उपन्यास प्रतिबंध एंजाइम साइट जंगली प्रकार और एंजाइम पाचन द्वारा पुनः संयोजक इन्फ्लूएंजा वायरस के बीच अंतर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसलिए, पुनः संयोजक वायरस शुद्ध पट्टिका का प्रवर्धन के बाद, RT-पीसीआर और अनुक्रमण दृष्टिकोण बचाया वायरस की प्रकृति को सत्यापित करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए. इन रिवर्स आनुवंशिकी तकनीकों और plasmids से पुनः संयोजक इन्फ्लूएंजा वायरस के सफल बचाव के विकास आप वायरस के जीव विज्ञान के बारे में विशिष्ट सवाल का जवाब करने की अनुमति देगा.

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Disclosures

मेडिसिन के माउंट सिनाई स्कूल पुनर्योगज इन्फ्लूएंजा वायरस के क्षेत्र में बौद्धिक संपदा अधिकार है, और एजी-S इस बौद्धिक संपदा में एक आविष्कारक है.

Acknowledgments

लेखकों गार्सिया Sastre Adolfo और पीटर Palese प्रयोगशालाओं में इन्फ्लूएंजा रिवर्स आनुवंशिकी तकनीक और plasmids के विकास के लिए अतीत और वर्तमान सदस्यों को शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. एजी-एस प्रयोगशालाओं में अनुसंधान CRIP, इन्फ्लुएंजा अनुसंधान और निगरानी के लिए एक NIAID वित्त पोषित की उत्कृष्टता केंद्र (HHSN266200700010C) के द्वारा आंशिक रूप से और NIAD R01AI046954 अनुदान, U01AI070469 और P01AI058113 द्वारा वित्त पोषित है. LM-S प्रयोगशाला में अनुसंधान आंशिक रूप से NIAID RO1AI077719 अनुदान द्वारा वित्त पोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11995-065 Store at 4°C
OptiMEM Invitrogen 51985-034 Store at 4°C
Lipofectamine 2000 (LPF2000) Invitrogen 11668-019 Store at 4°C
TPCK-trypsin Sigma-Aldrich T-8802 Store at -20°C
Bovine Albumin (BA) Sigma-Aldrich A7979 Store at 4°C
Trypsin-EDTA Invitrogen 25300-054 Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X Invitrogen 15140-122 Store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30070.03 Store at -20°C
V-bottom 96-weel plates Nalge Nunc international 249570

Embryonated chicken eggs

Embryonated 10-day-old chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Eggs are incubated at 37°C preceding and after viral infection. Before and after viral infection, eggs are candled to determine viability of the embryos. It is very important to look for dead eggs before and after viral infection. Before infection a dead egg can be easily spotted by the absence of blood vessels as well as the absence of embryo mobility. When candled, live embryos move. After viral infection a dead egg (probably related to influenza virus infection) will be easily spotted by the bad appearance of the egg as seen by the smaller and bloody volume of allantoic fluid. Infected-eggs are discarded in double autoclavable bags and autoclaved following standard procedures.

Chicken red blood cells (RBC)

Chicken RBC can be purchased from Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620. Store at 4°C. For HA assays, wash 5 ml of the chicken RBC with 45 ml of PBS 1X in a 50 ml centrifuge tube. Centrifuge for 5 minutes at 1000 rpms, RT. Discard carefully the supernatant and use a 1:1000 dilution of the pelleted RBC in PBS 1X (final concentration of 0.5-1.0% RBC).

Tissue culture supernatants and allantoic fluids

Both, tissue culture supernatants and allantoic fluids can be stored at 4°C for a short period of time. After confirming virus rescue, viruses from cell supernatants or allantoic fluid are stored at -80°C.

Plasmids

All plasmids are prepared using a plasmid maxi kit following manufacturer’s recommendations. All plasmids are aliquot at concentrations of 1 μg/ml in ddH2O and stored at -20°C. For short-term storage, the plasmid can be keep at 4°C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriated for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel chromatography. Ambisense pDZ plasmids (6) containing the eight influenza A/PR/8/34 viral genes (7) are illustrated in Figure 2.

Viruses

The described protocol for rescuing influenza A/PR/8/34 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including tissue culture supernatants and embryonated eggs, should be sterilized before disposal. Rescue of other influenza virus may require higher BSL conditions and, therefore, special conditions/security measurements will need to be followed.

Tissue culture media and solutions

DMEM 10%FBS 1%PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4°C. This media will be used to maintain 293T and MDCK cells as well as for the transfections. DMEM 0.3%BA 1%PS: 495.7 ml of DMEM, 4.3 ml of 35% Bovine Albumin (BA). Store at 4°C. Just before use, add TPCK treated trypsin to a final concentration of 1 μg/ml. Infectious media.

10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.

1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).
  2. Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J Virol. 73, 9679-9682 (1999).
  3. Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. Recombinant influenza virus vectors. Future Virology. 2, 401-416 (2007).
  4. Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae. The viruses and their replication. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. H. 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins. PA, USA. 1647-1689 (2006).
  5. Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).
  6. Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein. J Virol. 79, 8431-8439 (2005).
  7. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).

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3 Comments

  1. The PDF of this article is not possible to download, gives some syntex error. Please make it fixed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2010 - 12:33 PM
  2. Yes it is like this. Please correct it.

    Reply
    Posted by: Muhammad M.
    August 21, 2010 - 12:43 PM
  3. Our apologies. This has been fixed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2010 - 12:50 PM

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