I vermicelli e test Manipolazione Capellini: Semplici misure quantitative della funzione zampe anteriori abile nel ratto e nel topo

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Summary

I vermicelli e test Manipolazione Capellini di destrezza zampe anteriori sfruttare l'inclinazione naturale di roditori di manipolare alimenti con zampe anteriori abili e movimenti cifra. Gli animali sono videoregistrate durante la manipolazione corti filamenti di crudo pasta secca. Lento movimento permette la riproduzione di video per la quantificazione di regolazioni zampe anteriori.

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Tennant, K. A., Asay, A. L., Allred, R. P., Ozburn, A. R., Kleim, J. A., Jones, T. A. The Vermicelli and Capellini Handling Tests: Simple quantitative measures of dexterous forepaw function in rats and mice. J. Vis. Exp. (41), e2076, doi:10.3791/2076 (2010).

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Abstract

Caratterizzazioni precedenti di comportamento roditore mangiare hanno rivelato che l'utilizzo coordinato i movimenti delle zampe anteriori per manipolare pezzi di cibo. Abbiamo esteso su questo lavoro per sviluppare una semplice misura quantitativa di destrezza zampe anteriori che è sensibile alle menomazioni lateralizzato e dipendente dall'età modifiche. Roditori imparano zampe anteriori abili e movimenti cifra di gestire i pezzi di pasta sottile, che si consumano avidamente. Abbiamo precedentemente descritto i metodi per quantificare la gestione vermicelli nei ratti e ha dimostrato che le misure sono molto sensibili alle alterazioni degli arti anteriori che derivi dalla unilaterale lesioni ischemiche, occlusioni dell'arteria cerebrale media e unilaterale deplezione di dopamina striatale [Allred, RP, Adkins, DL, Woodlee, MT, Mariti, LC, Maldonado MA, Kane, JR, Schallert, T. & Jones, TA Il test di Handling Vermicelli: una semplice misura quantitativa della funzione zampe anteriori abile nei ratti.

Protocol

1. Preparazione per l'inizio della sperimentazione

  1. Pezzi di pasta cruda sono tagliati a misura utilizzando una lama di rasoio. Per i ratti, Skinner marchio vermicelli di pasta (1,5 mm di diametro) viene tagliata a 7 lunghezze di cm. Per i topi, DeCecco marchio capellini di pasta (1,0 mm di diametro) è tagliato a 2,6 lunghezza cm (Fig. 1C). Poiché i marchi di pasta varia nella struttura e diametro, che potrebbe influenzare maniera manipolazione, si raccomanda che una singola fonte di pasta utilizzato per la prova ripetuta.
  2. Per superare le risposte neophobic e di stabilire capacità di movimentazione, gli animali sono esposti ai pezzi di pasta a volte a casa loro gabbia diversi nelle settimane prima del test. (In genere, 5-10 giorni di esposizione, circa 4 pezzi ogni volta, è sufficiente.)
  3. Se il test sarà somministrato in una stanza diversa della gabbia casa, o se la gabbia è spostato a casa per i test, l'abitudine a mangiare in un ambiente di test è fornito. (Si richiede in genere 3-5 lezioni fino a quando gli animali sono facilmente mangiando la pasta in questo ambiente.)
  4. Anche dopo che gli animali accettano con entusiasmo la pasta, possono diventare improvvisamente reticente quando una grossa macchina fotografica si sposta vicino alla zona test. E 'utile posizionare la fotocamera di fronte al ambiente di test per una o più delle sessioni di assuefazione.
  5. Poiché la maggior parte degli animali si comportano come se la pasta è molto appetibile, non è essenziale al cibo limitarle prima del test. Tuttavia, l'eliminazione degli alimenti poche ore prima o durante la notte può facilitare mangiare davanti alla telecamera e sperimentatore e garantire che esse non sono sazi, al momento del test.
  6. Spezzare il pezzo di pasta durante mangiare invalida un processo. Abbiamo trovato questa abitudine è in gran parte evitato se gli animali non vengono mai dato pezzi più lunghi rispetto a quelli utilizzati nei test.
  7. Per le sessioni di prova, i pezzi di pasta sono marcati con un marcatore punta ultrafine a intervalli specifici utilizzando un modello cartoncini (1,75 cm su incrementi di vermicelli e 0,86 cm su incrementi fili Capellini). Questo facilita la visualizzazione del movimento del filo di pasta durante mangiare.

2. Test istituire

  1. Gli animali devono essere testati sia nella gabbia di casa o un altro apparecchio con unmarred, pareti chiare, e dovrebbero essere isolati dal loro cagemates durante la sessione di test.
  2. Anche se i ratti possono essere testati in tempo reale da uno sperimentatore praticato (Allred et al., 2008), la quantificazione è facilitato dalla registrazione video in modo che i dati possono essere raccolti durante la riproduzione al rallentatore video. Non abbiamo trovato fattibile quantificare in modo affidabile i movimenti delle zampe anteriori del mouse senza la riproduzione di video in movimento lento a causa delle dimensioni ridotte delle loro zampe e movimenti rapidi.
  3. Una videocamera con un frame rate elevato e lo zoom adeguato viene utilizzato. Noi usiamo una macchina fotografica Canon XL1S con un obiettivo zoom 16X impostato su una velocità dell'otturatore di un minimo di 420 s-1 in condizioni di normale illuminazione della stanza. L'uso di un cavalletto a ruote con una testa panoramica e inclinazione facilita il posizionamento della telecamera.
  4. Ratti tipicamente stare seduto sui talloni di mangiare pasta e le zampe sono più facilmente visualizzate con la fotocamera posizionata a circa il livello della camera pavimento con una leggera angolazione verso l'alto (Fig. 1A). Se il test in una gabbia con trucioli, la rimozione di alcuni trucioli può essere utile per ottimizzare la visione.
  5. I topi tendono a piegarsi in avanti durante mangiare la pasta, tenendo il pezzo in più di un angolo rispetto ai ratti fare. Quindi, una camera di prova con un piano aperto è posto sulla cima di uno specchio. La fotocamera è posta ad un livello leggermente più alto del pavimento, e angolata verso il basso per concentrarsi sulla riflessione delle zampe allo specchio (fig 1B). L'uso di uno specchio prima superficie migliora notevolmente la chiarezza delle zampe per la riproduzione video.
  6. Ogni morso del pezzo pasta è udibile e, quindi, la registrazione audio è utile per verificare mangiare.

3. Somministrazione di prove di movimentazione di pasta

  1. Sessioni di prove consistono in prove sequenziale, con un pezzo di pasta mangiato per prova. Noi di solito registrare i dati provenienti da studi 4-5 per ratto e prove 3-4 per il mouse.
  2. Prima di registrazioni video, un pezzo di pasta viene inserito nella camera di iniziare a mangiare e per spostare l'animale in una visione corretta videocamera.
  3. È necessario che l'animale di fronte alla telecamera e mettere a fuoco e zoom sufficientemente (~ 10-12X) per visualizzare le regolazioni discrete sia con zampe anteriori e tutte le cifre. Le nocche di entrambe le zampe dovrebbe essere visibile. Almeno con questa fotocamera, riteniamo utile per utilizzare le funzioni di autofocus solo prima dell'inizio di prova, a stretto sulla regione di interesse. Abbiamo poi passare alla messa a fuoco manuale.
  4. Non appena l'animale e la macchina fotografica sono in posizione, il primo processo è iniziato. Un pezzo è caduto o pendeva direttamente di fronte l'animale e la registrazione viene avviata prima di mangiare esordio.
  5. Successivamente, le prove sono date in successione immediata. Si consiglia di minimizzare i ritardi tra le prove in modo che gli animali non si allontananodalla posizione di visione ottimale.
  6. Prove in cui vengono visualizzate le zampe a lato o in cui si perde il focus non sono segnati.
  7. Le sessioni di test può essere ripetuto più giorni, per esempio, al documento pre-e post-trattamento schemi temporali (ad esempio, il recupero dopo l'infortunio SNC;. Allred et al, 2008).
  8. Una sfida può essere sempre gli animali a mangiare in posizioni desiderate relative alla fotocamera. Potrebbe essere necessario abituare telecamera timido animali per la presenza della telecamera per pochi minuti prima del test. Gli animali possono spesso essere persuasi nella posizione a cadute o penzolanti la pasta nella regione ideale. Si può richiedere alcuni pezzi per raggiungere questa posizione desiderata, anche se il numero di pezzi dato dovrebbe essere ridotto al minimo per evitare di sazietà.
  9. Per il test sequenziale di alcuni topi, abbiamo trovato conveniente configurare alcune delle loro gabbie in un momento in un cerchio, con la fotocamera su un treppiede ruote nel mezzo. Un pezzo è caduto in una regione ideale di ogni gabbia e la fotocamera poi spostato nel ratto che inizia a mangiare in una posizione appropriata per primo. Questo permette più tempo per il più lento (a mangiare in posizione) a ratti si abituano alla fotocamera e alla presenza sperimentatore e possono anche essere stimolati a mangiare dai suoni morso dei ratti più veloce.

4. Video di analisi quantitativa di regolazioni zampe anteriori e il tempo di mangiare

  1. L'analisi delle regolazioni zampe anteriori mentre si mangia è una semplice misura quantitativa che è sensibile ai disturbi lateralizzato dopo lesione del SNC nei ratti (Allred et al, 2008;. Whishaw & Coles, 1996; Whishaw et al, 1997). All'invecchiamento e modifiche relative nei topi (Tennant et al., 2009).
  2. La porzione quantificata della prova inizia quando il pezzo di pasta è la prima volta immessi nella bocca e termina quando l'ultimo della pasta viene rilasciato dal zampe e scompare in bocca.
  3. La riproduzione video è rallentato (~ 50% del tempo reale), o fotogramma per fotogramma anticipo viene utilizzato, se necessario, per identificare le regolazioni.
  4. Un adeguamento viene contato ogni volta che rilascia zampa e ricontatti il ​​pezzo di pasta, quando c'è riforma della stiva zampa sul pezzo, o quando vi è una estensione-flessione e abduzione-adduzione delle dita (Fig. 2). Ogni regolazione viene registrata separatamente per la zampa destra e sinistra.
  5. Regolazioni non devono essere considerate per la zampa scivoli lungo il pezzo di pasta con nessun movimento delle cifre o riposizionamento della stiva zampa. Movimenti della zampa quando non è in contatto con il pezzo di pasta (cioè i movimenti accanto al pezzo) non sono conteggiati.
  6. Il tempo per mangiare è registrato anche per ogni prova, a partire da mangiare inizio e termina quando scompare la pasta in bocca. Registriamo ora con funzioni video display della riproduzione, ma può anche essere registrati con una cronometro durante la riproduzione velocità normale.
  7. Se l'animale si ferma a mangiare, ma mantiene una stretta sul pezzo, il tempo di pausa viene sottratto dal tempo totale. Una pausa nel mangiare è evidente da uno spostamento del pezzo dalla bocca oppure la cessazione di mordere udibile.
  8. Il processo viene omesso dall'analisi se durante qualsiasi parte del mangiare, la vista delle zampe è oscurata, o se l'animale rompe il pezzo, perché i pezzi più brevi alterare i modelli di gestione.
  9. Alcuni ratti e topi sempre fare più modifiche con una zampa rispetto agli altri. Per unilaterale modelli lesioni del SNC, disturbi lateralizzato sono più sensibile se le lesioni rilevate influenzare la zampa che ha reso più aggiustamenti in fase di pre-infortunio test (Allred et al., 2008).
  10. I topi a volte cadere il pezzo di pasta nel mezzo di mangiare, e, dopo una breve pausa, si pick up e continuare a mangiare. Questo è molto comune nella ultima prova della giornata, forse a causa di sazietà parziale e perdita di messa a fuoco a mangiare. Perché questo è comune anche nei topi intatti, non omettere queste prove. Tuttavia, il tempo che il pezzo è caduto viene sottratto dal tempo totale di mangiare.
  11. Nei ratti intatti, cadere pezzi è atipico e la ripresa nel mangiare è spesso molto ritardata o assente. Tali prove sono omessi dall'analisi di regolazioni e tempo di mangiare.
  12. Regolazioni prima dell'inizio alimentari non sono conteggiati. Pre-trattamento comportamenti alimentari sono colpiti da lesioni del SNC (ad esempio, Whishaw et al, 1992;.. Whishaw et al, 1986), ma non abbiamo ancora esteso i metodi quantitativi per le regolazioni zampe anteriori a questo periodo.
  13. Questi dati possono essere riassunti come: (a) il numero medio di modifiche per zampa per pezzo, (b) il tempo medio di mangiare per pezzo e (c) il tasso di rettifiche (rettifiche / mangiare tempo).

5. Video analisi dei modelli di gestione atipica

  1. Modelli di gestione atipica in grado di distinguere tra diversi tipi di lesione del SNC nei ratti (Allred et al., 2008) e recording questi comportamenti può essere utile come un'analisi supplementare.
  2. Modelli di gestione sono considerati atipici se sono talvolta osservate in animali intatti. Animali intatti tipicamente iniziare a mangiare con una zampa, la "zampa afferrare", posto in basso a pasta, e la "zampa guida" viene quindi posto in prossimità della foce (fig. 3 A, C). La zampa stesso è di solito la zampa cogliere in tutti gli studi. Ratti spesso zampe posizione distanti per tutta la lunghezza della pasta in un primo momento, e spostarli insieme come si accorcia pezzo. I topi tipicamente posizione entrambe le zampe vicino alla bocca, con la presa e arti Guida tenuto vicino l'uno all'altro, anche all'inizio di mangiare. In entrambe le specie, le zampe muovono in posizioni più simmetrica, fianco a fianco o con cifre interposti, quando il pezzo è molto breve (Fig. 3B, D). Entrambe le zampe sono in uso continuo per guidare, la detenzione o avanzare la pasta durante mangiare.
  3. Schemi atipici in posizione zampa in ratti e topi sono: (a.) mettendo le zampe insieme, in una presa simmetrica, quando il pezzo di pasta è lungo (più di metà della lunghezza originale), (b) non aver muovere le zampe in posizione simmetrica prima che il pezzo è completamente consumato e (c) commutazione posizioni della guida e degli arti cogliere in mezzo a mangiare.
  4. Due comportamenti atipici aggiuntivi in ​​ratti e topi sono: (a.) in mancanza di mettersi in contatto con il pezzo di pasta con una zampa per un lungo periodo durante il mangiare ("mancato contatto") e (b) usando la bocca per tirare la pasta attraverso il zampe per riposizionare loro ("bocca tirando").
  5. Due comportamenti sono considerati atipici per i ratti, ma sono tipici per i topi: (a.) postura ingobbita e (b) far cadere il pezzo dopo aver mangiato la pasta comincia. Tuttavia, la frequenza di gocce nei topi potrebbe aumentare dopo un danno nervoso centrale. Quindi, registriamo frequenza calo in entrambe le specie.
  6. Altri comportamenti atipici sono stati visti in un modello unilaterale della dopamina striatale esaurimento ratto: (a.) un "pugno di ferro", dove l'arto presa si trova in un immobile, posizione rigida durante mangiare, (b.) ripetuto movimento della zampa guida intorno alla zampa presa rigida, e (c.) e ribaltamento estrema della testa come la pasta è angolato in bocca (Allred et al, 2008;. vedi anche Whishaw et al 1997)..
  7. Abbiamo osservato che i topi di età compresa spesso le regolazioni che sono inefficaci per spostare la pasta in bocca. Così, aggiustamenti che non comportino un movimento visibile del pezzo di pasta in bocca sono contabilizzati separatamente.
  8. Commutazione la guida e arti afferrare, il mancato contatto, gocce, e la bocca tirando sono registrati per evento, mentre tutti gli altri comportamenti atipici sono registrati una volta per prova.

6. Rappresentante Risultati

I risultati della analisi video deve includere il numero di regolazioni di ogni zampa per ogni prova e il tempo di mangiare ogni pezzo di pasta. I risultati di ratti con lesioni corticali sensomotorio o ischemia cerebrale, indicano che gli animali fanno meno regolazioni con la compromissione (contra-to-lesione) arto, un effetto che perdura per almeno un mese dopo le lesioni. Deplezione di dopamina unilaterale risultati in entrambe una diminuzione delle rettifiche di valore con l'arto controlaterale e un aumento delle rettifiche di valore con l'arto ipsilaterale (Allred et al., 2008). I risultati di topi mostrano che gli animali di età compresa tra impiegano più tempo a mangiare i pezzi di pasta, e rendere più aggiustamenti che non comportino l'avanzamento della pasta in bocca, rispetto a topi adulti giovani (Tennant et al., 2009). L'analisi di questi test possono anche includere le osservazioni dei comportamenti di gestione atipica. Danno striatale e mezzo occlusione dell'arteria cerebrale inoltre portato ad una maggiore frequenza di comportamenti alimentari anormali (Allred et al., 2008).

Figura 1
Figura 1. Movimentazione postura Pasta di (A) e ratti (B) topi. Si noti che i ratti sedersi sui talloni mentre i topi impressione sopra la pasta, che richiede il posizionamento di uno specchio sotto il mouse per visualizzare i movimenti zampa. (C) Esempi di pezzi di pasta preparata per il test.

Figura 2
Figura 2. Un esempio di regolazione zampe anteriori (AC) e un topo (DF) un mouse. Il primo pannello mostra l'animale prima della regolazione, il pannello centrale mostra la regolazione zampe anteriori, con un asterisco che indica la zampa di regolazione (s), e l'ultimo pannello mostra la sostituzione del pezzo di pasta.

Figura 3
Figura 3. Guida e comprendere le posizioni degli arti di ratti e topi, quando la pasta è (A, C) di lunghezza e (B, D) breve.

Discussion

In questo video ci dimostra come i vermicelli e Test Gestione Capellini sono condotti nel ratto e nel topo, rispettivamente. Questi test sono un modo semplice per lo studio quantitativo zampa e la funzione cifra in animali normali, dopo un danno ai sistemi motori del cervello, o durante l'invecchiamento. Slow-motion video analisi della zampa e movimenti cifre utilizzato per gestire piccoli pezzi di pasta cruda permettono al ricercatore di quantificare le modifiche apportate ad ogni zampa, oltre che osservare i comportamenti anomali che possono essere visti seguendo sperimentalmente indotto danni SNC. Sessioni di test può essere fatto più volte in giorni diversi e la maggior parte degli animali completare tutti i processi di una sessione in pochi minuti. Così, il test è adatto per incorporazione in una batteria di test più grande o disegno sperimentale. Il test può essere utilizzato anche in studi di abilità apprendimento motorio (Xu et al., 2009), ma qui vi presentiamo un protocollo a cambiamenti in un saggio di abilità stabilite nel corso del tempo.

Attualmente, raggiungendo qualificati test sono i test più comunemente usati per la funzionalità degli arti anteriori abile nei ratti (ad esempio, Whishaw et al, 1986;. Ballermann et al, 2001;. Montoya et al, 1991.) E topi (Farr & Whishaw, 2002; Tennant & Jones, 2009; Baird et al, 2001).. Prove di raggiungere consentire test isolato di ogni arto, mentre la manipolazione di pasta è un compito bimanuale. Tuttavia, i test sono simili nella loro sensibilità ai disturbi della funzione zampa qualificati e l'acquisizione di abilità per entrambi i test coinvolge plasticità nella rappresentazione arti anteriori della corteccia motoria (Xu et al., 2009). Nella nostra esperienza, i test raggiungono sono più complicate e laboriose a svolgere e, per alcune domande di sperimentazione, i test presente può fornire un'alternativa più efficiente. Tuttavia, a differenza dei test descritti qui, abile test raggiungere sono in uso da decenni (Peterson, 1934) e che ora includono una serie versatile di misure ad alta sensibilità e parametri di test (Ballermann et al, 2001;. Farr & Whishaw, 2002; Montoya et al, 1991;. Whishaw et al, 1992).. Al contrario, i vermicelli e Test Gestione Capellini si estendono da caratterizzazioni relativamente recente del comportamento abile manipolazione degli alimenti di ratti (Whishaw e Coles, 1996). In entrambi amministrazione e analisi, questi test potrebbe senza dubbio essere ulteriormente raffinato ed esteso, ad esempio, per quantificare con maggiore precisione multa schemi di movimento cifra e bimanuale e di quantificare i movimenti coordinati della lingua, della bocca e della mandibola.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare il Dott. DeAnna Adkins, il dottor Marty Woodlee, Mariti Cole, Mónica A. Maldonado, Jackie Kane, e il dottor Tim Schallert per l'assistenza nello sviluppo del Test Handling Vermicelli, e Lu Chou per l'assistenza nello sviluppo del Capellini Test di manipolazione. Supportato anche da finanziamenti del NIH-NINDS (NS05689) e NIA-NIH (1F31AG034032-01).

References

  1. Allred, R. P., Adkins, D. L., Woodlee, M. T., Husbands, L. C., Maldonado, M. A., Kane, J. R., Schallert, T., Jones, T. A. The Vermicelli Handling Test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats. J. Neurosci. Methods. 170, 229-244 (2008).
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Comments

4 Comments

  1. I'm a PhD student in the north of Brazil and I'm trying to build up this experimental set up here. I've already read the PDF file, and now I would like to do a couple of questions. It is possible to use another video camera, without all of this resources? Like a hand camera? or a Cybershot (SONY) camera? If I don´t have the vermicelli pasta at hand, can I use another one to test in rats? Thanks for your attention.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2010 - 11:10 AM
  2. Hi Walther. Thanks for your questions. I recommend using a video camera that allows you to save video files on either dv tapes or a dvd, due to the long videos you'll be taking of the rats eating. It also helps if you have a camera that allows you to change the shutter speed, as most general-use cameras don't capture images at a high enough shutter speed to clearly identify the small adjustments that rats and mice make with the forepaws. If you can't change the shutter speed and are having problems with blur in your videos, it can help to film in a well-lit room or use a small desk lamp to illuminate the animal's paws during filming. I also recommend filming with the camera on a tripod to prevent jostling. Good substitutes for vermicelli are spagettini or thin spagetti. These are slightly thicker than vermicelli, but not as thick as spagetti. If neither of these are available, spagetti will work. Be sure to stay consistent with the brand across experiments, and choose a brand that produces pasta of a consistent thickness. Stay clear of wheat pastas as they seem to be harder for the animals to bite, tend to have a rough texture that may change handling patterns, and satiate the animals more quickly.

    Reply
    Posted by: Kelly T.
    September 20, 2010 - 4:03 PM
  3. Hello, Kelly

    I am an undergraduate student at Saginaw Valley State University in Michigan. I am planning to use the vermicelli handling test in an upcoming senior project, but I am wondering if there is a quicker way to process the pasta pieces. I will have 1²0 rats, which makes for a great deal of vermicelli!

    Thank you for your time

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 9:07 AM
  4. Hi Sarah,
    It helps to cut a little bit of pasta each day rather than preparing all of the pasta at once. I like to build up a good amount at the beginning of an experiment (enough to last me through at least a few days of testing). Then, whenever I have a few minutes of free time, I cut more pasta. Preparing pasta this way will also save you from running out of pasta when you need it.
    Another way to help make pasta preparation easier is to enlist a helper or two. You can either split up the work, each of you making some pasta each day, or you can set up an assembly line for preparing pasta. One person could mark the pasta while another could cut it.
    Good luck on your upcoming senior project! Please don't hesitate to ask if you have any more questions.
    -Kelly

    Reply
    Posted by: Kelly T.
    November 3, 2011 - 11:44 AM

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