Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

Biology
 

Summary

2 gün sonrası fetilization (dpf) akut böbrek hasarı (AKI) ikna etmek için Zebra balığı larvaları aminoglikozid, gentamisin, microinjecting bir teknik açıklar. Ayrıca bütün montaj immünohistokimya için bir yöntem tarif, plastik gömme ve kesit AKI aracılı hasar görselleştirmek Zebra balığı larvalarının.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cianciolo Cosentino, C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp. (42), e2079, doi:10.3791/2079 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu video makalede nephrotoxicant olarak gentamisin kullanarak AKI zebrafish modeli açıklanmaktadır. Tekniği 2 dpf'e zebrafish intravenöz microinjections oluşur. Bu teknik, saatte 15-20 balık enjeksiyon için izin, Zebra balığı larvalarının kana çözünen maddeler sunmak için etkin ve hızlı bir yöntem temsil eder. AKI çalışmaları yanı sıra, bu mikroenjeksiyon tekniği da, anjiyografi gibi deneysel çalışmalar, diğer türleri için kullanılabilir. Biz, azalmış böbrek fonksiyonu görsel önlemler için gerekli ekipman tekniğin ayrıntılı bir protokol sağlar. Buna ek olarak, aynı zamanda bir böbrek tübül marker, plastik gömme ve larva zebrafish kesit fiksasyon, tüm montaj immünohistokimya sürecini göstermektedir. Ödem, proksimal tübüler epitel hücreleri hücre polarite kaybı ve tübül morfolojik bozulması: gentamisin ile enjekte Zebra balığı larvaları tutarlı AKI ile morfolojik özellikleri göstermektedir.

Protocol

Aşağıdaki protokol kısmı (Hentschel ve ark 2005) ve (Weinstein ve ark 1995) hafif değişiklikler rapor yayınlandı yöntemleri dayanmaktadır.

Bölüm 1: Microinjections

Mikroenjeksiyon için önceden ayarlayın

  • Balık, 2 gün sonrası fertilizasyon (DPF) enjekte edilir. Bu nedenle, yetişkin zebrafish planlı bir deney önce 3 gece yetiştirilmektedir. Embriyolar toplayın ve 28.5 E3 su (5mM NaCl, 0.17mM KCL, 0.33mM CaCl 2 0.33mM MgSO 4) ile bir Petri kabındaki ° C Petri kabı başına 80-100 embriyolar vardır, böylece, ilk günün sonunda Petri kabı ve ayrı embriyolar ölü embriyolar kaldırmak.
  • Bir elektrot çektirmesi ile kılcal tüpler (4 inç uzunluğunda, 0,63 / 0,20 OD / ID milimetre (mm) R-6 Özel Cam Boru Drummond bilimsel şirketi, Broomall, PA 9-000-3000) çekerek cam iğneler hazırlayın. Ucu çapı 10-20 mikron olmalıdır. Diseksiyon mikroskobu altında (Leica S6E), kalıcı bir kalem, bir cetvel yardımı ile iğne boyunca yaklaşık 10 1mm çizgiler çizmek ve kil rampaları büyük bir Petri kabındaki iğneler saklamak.
  • Iç çapı kadar bir Bunsen beki alev ince duvarlı borosilikat cam kapiller tüp (152 mm, 1 / 0.75 OD / ID mm TW100-6, Dünya Precision Instruments, Inc.) Yangın lehçe ipucu: holding pipet hazırlayın ucu 0,4-0,5 mm dir. Böyle bir boyut 2 dpf'e Zebra balığı larvalarının yolk kesesi iyi tutuş sağlar. Uzun forseps kullanarak kapiller ve Bunsen beki ile kılcal zıt ucu 1-2 saniye süreyle ısı, alev ışığı mavi iç konisi, sıcak parçası üzerinde dikey yerleştirerek bir cam parçası bir ucundan tutun. bir bile erimeyen elde etmek için haddeleme. Bir sahne mikrometre (Ward 94 W 9910), birkaç kez, sonra mikroskop altında kılcal incelenmesi bu işlemi tekrarlayın. Bu önemli bir adım, larvaları işleme sırasında, birkaç holding pipetler ateş-lehçe ve daha sonra uygun bir boyutu seçmek için gerekli olabilir. Eğer dikkatli bir elinde pipet çoklu mikroenjeksiyon oturumları için sürer.
  • Mineral yağ üreticisi tarafından verilen talimatları izleyerek Manuel mikroenjektör Pompa (MMP, Dünya Precision Instruments, Inc.) Doldurun. Pipet tutucu bir demir plaka (Narishige IP) manyetik bir stand (Narishige, MN 151) ile bağlı bir joystick manipülatör (Narishige, MN-151), eklenir.

Mikroenjeksiyon

  • 20μl enjeksiyon karışımı hazırlayın: 2.4μl gentamisin (salin solüsyonu Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml) ve 10-kDa 17.6μl lucifer sarı dekstran (Invitrogen D1825, (tuzlu çözüm 1mg/ml) kontrol balık gentamisin serum fizyolojik ile değiştirilir. floresan dekstran (birçok farklı renkler kullanılabilir) enjeksiyon doğruluğunu ve larvaları nephrotoxicant enjekte edilmiştir seçmek için yeterli olacaktır.
  • Çözümleri buharlaşmasını önlemek için, altında enjeksiyon karışımı ve kontrol karışımı yerleştirmek için 2ml mineral yağ ile 2 30mm Petri kapları hazırlayın.
  • Anestezi 400 mg tricaine tozu (etil-m-aminobenzoate methanesulfonate SIGMA A-5040) 97.7 ml DD su, 2.1 ml 1M Tris (pH 9): hazırlayın. PH 7 ayarlayın. 4.2 ml hacimde, bu stok solüsyonu dondurucuda saklayın. Tricaine bir anestezik 4.2 ml, 100 ml E3 su (Westerfield 1993) tricaine stok solüsyonu sulandırmak ve oda sıcaklığında bekletin olarak kullanmak için.

Aşağıdaki adımları diseksiyon mikroskop altında yapılmaktadır

  • Elle ince forseps ile kalan herhangi bir chorions çıkartın ve oda sıcaklığında ısınmış tricaine ile bir Petri kabındaki aktardıktan zebrafish uyutmak. Zebra balığı microinjections başlamadan önce en az 15 dakika tricaine maruz olmalıdır.
  • Bir jilet (VWR bilimsel 55.411-050) kullanarak bir iğne ucu açın. Hafif bir açıyla eğim oluşturmak ve yaklaşık 10-20μm çaplı bir ipucu açılış elde etmek gibi ucu kesmek için bıçak tutun.
  • Mikroenjeksiyon cihazları (Dünya hassas aletler Inc, PV820 pnömatik picopump) güç, vakum ve hava kaynağı açın. Iğne, mikromanipülatör ve devirme tabanı (Word Precision Instruments, Inc, Model M3301R, TB-1) üzerine monte iğne tutucu içine yerleştirin.
  • Iğne doldurmak için, mineral yağ (Fisher Kimyasallar, 0121-1) ile dolu 30mm Petri kabındaki enjekte edilecek çözümün bir damlacık (10μl) yerleştirin. Batığın çözüm açılan iğne ucu kadar manuel mikromanipülatör açar picopump ayarlamak ("delik" PV820 vakum eşittir) "çıkmasına" yol geçiş ve çekerek iğne doldurup "havalandırma / tutun." iğne ucu ile çözüm. Çözüm çok hızlı iğne içine alırsa, birkaç dakika sürebilir.ucunun çapı çok büyük olduğu anlamına gelir ve enjeksiyonlar doğru olmayacaktır. Iğne doldurulduktan sonra, ("hold" PV820 enjekte eşittir) "tutmaya" picopump ayarlayın.
  • Iğne kalibre etmek için, "geçitli", menisküs işaretleyerek bir sonraki (1 seyahat etmek için gereken süreyi (saniye) iğne boşaltmak için ayak pedalına basın ve kayıt picopump "geçitli / zamanlı" anahtarı ayarlayın mm toplam mesafe). 3 kez tekrarlayın, ortalama süre (saniye) ve 30 (1 mm lineer mesafe ilgili nanoliters hacim (nl)) değeri bölmek çözüm 1 nl sunmak için gerekli milisaniye sayısını belirlemek için. Aralık dönemi topuzu bu numaraya ayarlayın ve 'zamanlı' "/ zamanlı kapılı" anahtarı taşımak. Şimdi picopump 1nl darbe bir çözüm sunmak için ayarlanır.
  • Mineral yağ çanağı ve pozisyon mikroskop altında larvaları ile Petri kabı çıkarın. Petri kabı ve odak merkezinde balık.
  • Petri kabı ucu önceden ve mikroskop odak düzlemi içine, mikroenjektör karşı tarafında manuel mikroenjektör pompa tutarak pipet (MMP, Dünya hassas aletler) yerleştirin. Holding pipetle çok uç Petri kabı alt dokunarak ve yatay yakın olduğunu, böylece, oldukça sığ bir açı ile bükün. Tepki süresi yavaş ve MMP hassas azalacağı, sistem herhangi bir hava kabarcığı değil emin olun.
  • Mikroskop daha yüksek bir büyütme değiştirin ve holding pipet çok yakın yumurta sarısı ile larva balık dorsal yüzü aşağı pozisyonda kolu (Ted Pella 113) ile ince kirpik kullanmak. Manuel mikroenjektör pompa kontrol mikrometre sürücü saat yönünün tersine çevirerek holding pipet içine yumurta sarısı emerek larva balık tutun. Holding pipet içine çok derin çekti sarısı patlaması gibi, çok uzak mikrometre açmak için özen gösterin. Yumurta sarısı üzerine, sadece periderm altında yatıyor ve çok yüksek bir kan akışı site oluşturarak ortak kardinal ven odaklanın. Enjeksiyon aparatları mikromanipülatör ile, gelişmekte olan ortak kardinal ven içine iğne rehberlik eder. Ortak kardinal ven çok yüzeysel olduğu gibi, genellikle iğne takıldıktan sonra biraz geri çekmek için gerekli. Ayak pedalına basarak çözüm 1nl enjekte edilir, daha sonra holding pipet larvaları serbest ve embriyo su geri. Bu, özellikle kritik bir adım, ilk kez balık konumlandırma ve teçhizat emme ve basınç kontrol uygulama belirli bir miktar gerektirir çünkü. Embriyonun yumurta sarısı düzgün tutarak pipet ile yapılan iğne girerken, rulo değil.
  • Mikroenjeksiyon başarısını doğrulamak için, floresan mikroskop altında zebrafish kalbinde lucifer sarı dekstran varlığı monitör. Nefrotoksik çözüm enjeksiyon 2 saat içinde çok az lucifer sarı dekstran enjeksiyon yerinde kalan göreceksiniz doğru enjekte ise dolaşım sistemi içine gondererek önce yaklaşık 20 dakika süreyle kalp lucifer sarı görünür kalır. Çözüm yolk kesesi, lucifer sarı dekstran bir nokta enjekte ise enjeksiyon yerinde kalacaktır. (Şekil 1). E3 orta balık dönün.
  • İki gün sonrası enjeksiyon, larvaları (Şekil 2) azalmış böbrek fonksiyonu bir sonucu olarak perikardiyal ödem geliştirmek.

Bölüm 2: Fiksasyon ve immünofloresan Na + / K + ATPaz antikor (α-6F)

  • Dpf'e 4, 10 ve 15 larva zebrafish 4ml cam şişeleri (Weathon 225.012) arasında 1ml Dent (80% MeOH% 20 DMSO) RT az 4 saat koymak ve onları düzeltmek.
  • Çözüm pipetleme ve (aynı flakon için yeni bir çözüm ekleyerek, kademeli bir MeOH / PBT (0.5% Tween20 ile PBS) serisi, 75:25 50:50, 25:75,% 100 PBT embriyolar rehidrate başına çözüm 1 ml flakon), her çözümün 20 dakika. Larva havaya maruz asla çözümler değiştirirken larvaları kapsayan küçük bir çözüm bırakın.
  • PBT çıkarın ve bir nutator 4 ° C az 3 saat engelleme solüsyonu (PBS DMSO ile% 1,% 0.5 Tween20,% 10 normal keçi serumu) 1ml yerine.
  • 2ml mikrofuge'ye larva transferi. Serum engelleme çıkarın ve bir nutator 4 ° C'de bir gecelik inkübasyon çözüm 300μl primer antikor (% 1 PBS ile DMSO,% 0.5 'lik Tween20,% 2 Normal keçi serum) ile değiştirin. Biz 1:25 seyreltme monoklonal Na + / K + ATPaz antikor (α-6F, süpernatant, Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, Iowa)
  • Primer antikor çıkartın ve oda sıcaklığında inkübasyon solüsyonu ile 3 x 30 dakika yıkayın.
  • Sekonder antikoru (keçi anti-fare cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003) ile inkübe 2 saat inkübasyon çözüm 1:500 seyreltilmişRT.
  • PBT 3 x 30 dakika yıkayın.

Bölüm 3: JB-4 plastik gömme

  • , Adım başına 10 dakika kademeli etanol serisi (% 75;% 95% 100 x 2% 50) ile doku dehydrate.
  • JB-4 Gömme Çözüm 25 ml (Polysciences 0226A) ve katalizör 0.24g (Polysciences 02.618): infiltrasyon çözüm hazırlayın. Katalizör yaklaşık 20-30 dakika çözmek için bir süre alır. Çözüm 4 saklanabilir ° C 1 aya kadar.
  • % 100 etanol Durusu ve plastik infiltrasyon çözümü ile değiştirin. Rotator şişeleri 4 ° C yerleştirin ve infiltrasyon larvaları lavabo cam flakon altına kadar devam etmek için izin. Bu işlem genellikle yaklaşık 30 dakika sürer.
  • Diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin plastik kalıp fincan tepsisi (Polysciences, Inc. 16643A): protokol gömülmesi. Bardak içine kapsayacak şekilde infiltrasyon çözümü ile birlikte, larva transferi. Plastik gömme medya küçük bir plastik tüp hazırlanır. Biz normalde bir seferde bir balık Her fincan için 4-5 balık gömün. Infiltrasyon çözüm her ml 5-6 ml (1.2 ml Her fincan için çözüm gömme) gömme plastik JB-4 Gömme Çözüm "B" 35 ul (Polysciences Inc. 0226B) ekleyerek hazırlayın. Infiltrasyon çözüm her ml JB-4 Gömme Çözüm "B" (Polysciences A.Ş. 0226B) 35 ul ekleyin. Plastik Pasteur pipeti birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme, iyice karıştırın. Karışık değilse de JB-4 düzgün Polimerize olmaz, çünkü bu önemlidir. Gömme plastik 5ml hazırlandıktan sonra, Pasteur pipeti ile örnek etrafında infiltrasyon plastik çıkarın. Plastik gömme su bardağı doldurun. Örnek blok sahibi iyi eki sağlamak için plastik bardak, dışarı sızmak gerekir. Zebrafish renal tübüller tespit için, enine kesitler iyi. Bu amaçla, balık dikey gömülü, baş aşağı. Kirpik sap veya ince forseps yardımı ile plastik onların konumunu hareket etmiyor o kadar da zor hale gelene kadar, periyodik olarak, dikey balık pozisyon. Yaklaşık 20-30 dakika sürer. Daha sonra, bardak üzerinde EBH-2 Blok Tutucu (Polysciences A.Ş. 15.899) yerleştirin ve 4 tepsi ° C gecede terk. Polimerizasyon eksik, buz küpleri gibi bloklar pop.
  • Birden fazla larva için alternatif gömme protokolü: yarım tam JB-4 kalıpları doldurun ve polimerize izin. 15 mm kare kalıplar için yarım kalıp doldurmak için 700μl JB-4 birimini kullanır. Sonra, önceden polimerize yarı dolu kalıplara sertleştirici ile JB-4 batırılmış larvaları ekleyin. Orient kafa kalıp uzun tarafına doğru baktığından ve larvaları hizalamak larvaları gözbebekleri hattı (bir satır tek bir kalıp içinde 10 balık koyabilirsiniz). Blok polimerize sonra, blok kenarları kesebilir tarafı bıçak bakacak şekilde açın ve mikrotom uygun bir plastik "chuck" superglue. Bu yöntem ile plastik merkezli aynı blok ve kesitleri için hazır larvaların çok sayıda pozisyon olabilir. Bakım her balık eşdeğer bölümleri tek bir bölümü alınır, böylece bıçak bloğu yönlendirme alınacak. Gözüyle kesit ederken bu gerçekleştirilebilir: yani yönlendirmek blok gözleri eşdeğer bölümlerde her bir balık için alınır böylece. Sonuçta tek bir mikroskop lamı üzerine, eş zamanlı olarak pek çok balık analiz edebilirsiniz.

Bölüm 4: Kesit

  • Mikrotom mandren tutucu (biz Shandon Finesse Thermo Electro Corporation mikrotom) numune ayarlayın
  • 45 sıcak slayt ayarlayın ° C
  • Behere DI su dökün ve mikrotom yakın yerde
  • Kesit önce, balık mükemmel enine bölümleri elde etmek için blok gibi odaklı olduğundan emin olun. Yönelim baş ayar kolları bıçak doğru örnek kafa pozisyonu sağlayan döndürülebilir. Kalınlığında kesitler balık kafası ile kesme başlayın. Yönlendirmek blok gözüyle kesit ederken, gözleri eşdeğer bölümleri her balık için alınan böylece. Pronephric tübüller başlattığınızda pektoral yüzgeçler bölümlerde göründüğünde, yani. Bu noktadan itibaren, 4 blok 32 um bölümleri hakkında kesin.
  • Forseps ile bölümleri toplayın ve forseps ile su dokunmadan, onları su ile beher içine bırakalım. Su yüzeyine çarparsa bölüm yakında genişleyecektir, şimdi bir slayt toplayabilirsiniz. 45 ° açıyla suya slayt takın ve sadece bölümün sınırları dokunmadan, kulplu bir kirpik yardım bölümü yaklaşım.
  • Tamamen kuruyana kadar sıcak bir slayt slaytlar inkübe edin.
  • Epifluorescent veya konfokal mikroskopi kullanılarak bölümleri.

Bölüm 5: Temsilcisi Results

Doğru yapıldığında, enjekte balık küçük floresan dekstran, kalp ve dolaşım sistemi görünür (Lucifer Sarı bu durumda), Şekil 1 gibi görünür. Enjeksiyon çok derin ise, enjekte edilen malzeme yolk kesesi konsantre olabilir, ya da kalbin aşırı kanama neden yırtılmış olabilir. Holding pipet doğru yapılırsa, balık rulo veya hareket enjekte edildiğinde, bu daha doğru bir enjeksiyon sağlayacaktır. Ayrıca, tepki süresi yavaş ve sistemi hassas azalacağı, MMP herhangi bir hava kabarcığı değil emin olmak için önemlidir. Genellikle, gentamisin nefrotoksisite bir sonucu olarak, enjekte edilen balığın% 80 perikardiyal ödem (Şekil 2) geliştirmek. Biz belirgin perikardiyal ödem, ancak hafif ve orta eksenin eğriliği ile ciddi ödemli balık, perikardiyal ve gövdede ödem, başkaları değil, fenotipleri gözlemlenebilir orta derecede ödem ile balık fenotip temelli bir sınıflandırma sistemi kullanır. Renal tübül antikor karşı Na + / K + ATPaz (α-6F) denetimleri (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında, hasarlı tübüller hücre polarite ve tübüler bozulma belirgin bir kayıp ile enine bölümlerde hasarlı tübüller oluşturulabiliyor . Bu desen, çok sayıda enine bölümleri ile tutarlıdır. Gömme sırasında balık doğru konumlandırmak için önemlidir renal tübüller mükemmel enine bölümleri elde etmek için. Bölümleri karşılaştırıldığında, göğüs yüzgeçleri ve proksimal dolambaçlı tübüller anatomik belirteç olarak kullanılır.

Şekil 1
Şekil 1 Nephrotoxin mikroenjeksiyon. Lucifer sarı, beyaz ok ortak kardinal ven soluk bir ifade ile konjuge (A) Başarılı bir 10kDa dekstran enjeksiyon,. (B), dolaşım sistemi, kırmızı ok içine dağıtmak değildir lucifer sarı konjuge 10kDa dekstran mevduat yanlış enjeksiyon sonucu.

Şekil 2
Şekil 2 Gentamisin-aracılı ödem. (A) Kontrol larva zebrafish enjekte. Gentamisin ile larva Zebra balığı (B) orta veya şiddetli ödem (C) enjekte edilir. Tüm larvalar, sol anterior 4 dpf'e ve dorsal kadar. Siyah oklar, B ve C perikardiyal ödem

Şekil 3
Şekil 3 AKI immünhistokimya. kontrol Na + / K + ATPaz 48 saat sonrası gentamisin enjeksiyonu (4 dpf larvaları) (A, B) ve gentamisin enjekte (C, D) larvaları için α-6F antikor boyama. A, C bazolateral polarite ve tübül bozulması, beyaz ok, D, A ve C Not kaybı doğru Tübüllerin 3X dijital büyütmelerde B'ye göre 20X büyütme ve B ve D.

Discussion

Bu video makalede AKI bir model için bir intravenöz mikroenjeksiyon tekniği, Zebra balığı larvaları gentamisin aracılı proksimal tübüler hasar oluşturarak gösterdi. Bu hasar, perikardiyal ve / veya ağır ödem oluşumunu sonuçları, su dengesini düzenleyen bir yetersizlik yansıtan. Ayrıca hücre polarite kaybı ve hasarlı böbreklerde proksimal tübül bir bozulma gösteren, farklılaşmış böbrek kanallarında (Majumdar ve ark 2000) işaretleri bir antikor ile bir immünhistokimya deney nitelendirdi. İntravenöz microinjections Zebra balığı larvalarının kana çözünebilir bir madde sağlamak için etkili bir yöntem temsil eder. Bu teknik, çeşitli maddelerin bir tanıtım için mükemmel bir araçtır, floresan işaretleyici üniforma enjeksiyonları yardımı ile tutarlı sonuçlar için izin defalarca tekrar edilebilir.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık (NIH) hibe R01DK069403 ve P30DK079307 Enstitüleri tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α6F mouse monoclonal Developmental Studies Hybridoma Bank
Block Holder EBH-2 Polysciences, Inc. 15899
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments, Inc. TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing Drummond Scientific 9-000-3000
Catalyst Powder Polysciences, Inc. 02618
Cy3 Jackson ImmunoResearch 155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable Molecular Probes, Life Technologies D1825
DMSO Sigma-Aldrich D8418
Eyelash Ted Pella, Inc. 113
Gentamicin sulfate Sigma-Aldrich G8648
Glass vials 4ml Weathon 225012
Iron plate Narishige International IP
JB-4 Embedding Solution A Polysciences, Inc. 0226A
JB-4 Embedding Solution B Polysciences, Inc. 0226B
Joystick micromanipulator Narishige International MN 151
Magnetic stand Narishige International MN-151
Manual microsyringe pump World Precision Instruments, Inc.
Microinjection apparatus World Precision Instruments, Inc. PV820
Micromanipulator World Precision Instruments, Inc. M3301R
Microtome Thermo Fisher Scientific, Inc. Shandon Finesse
Mineral oil, light Fisher Scientific 0121-1
Pipette puller Kopf Instruments 720
Plastic molding cup tray Polysciences, Inc. 16643A
Razor blade VWR international 55411-050
Slide warmer Labline Instruments
Stage micrometer WARD’s Natural Science 94 W 9910
Tilting base World Precision Instruments, Inc. TB 1
Tricaine powder Sigma-Aldrich A-5040
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Microscope Leica Microsystems S6F Dissecting microscope
Microscope Leica Microsystems M205FA Fluorescent microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hentschel, D. M., Park, K. M. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, (5), F923-F929 (2005).
  2. Majumdar, A., Lun, K. Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia. Development. 127, (10), 2089-2098 (2000).
  3. Weinstein, B. M., Stemple, D. L. Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish. Nat Med. 1, (11), 1143-1147 (1995).
  4. Westerfield, M. The Zebrafish Book. University Oregon Press. Oregon. (1993).

Comments

3 Comments

  1. I would like to ask which kind of knife is used for sectioning. I have problems getting good sections and wonder if the knife is the reasson. Thank you in advance, Eric

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 27, 2010 - 6:02 AM
  2. We buy our knives from DKK (Delaware Diamond Knife), the knives we have are:
    Disposable tungsten carbide knives and a 3 knife package costs $5²5
    There is no cat number in their website, however, DKK told us the Cat. Number: NEWDISP3PK

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 2, 2010 - 10:34 AM
  3. We use standard glass knives and a Leica RM²165 microtome for cutting JB-4 plastic blocks. To make the knives you need a glass knife maker, a Leica EM KMR3 or equivalent knife maker. These are the same type of knife used in EM facilities to make thick sections from Epon embedded samples. The knife maker can be $6-10K so if you want to go this route it might be easiest to buy some glass bars and arrange to use a knife maker in a core EM facility. EM supply companies sell useful plastic boxes for storing 10-15 knives after you make them.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 2, 2010 - 11:25 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics