DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات

Neuroscience
 

Summary

نحن لشرح استخدام المسدس لإدخال جينات الأصباغ الفلورية ، مثل الجاذبة ، في الخلايا العصبية في الدماغ شرائح من القوارض والرئيسات غير البشرية من مختلف الأعمار. في هذه الحالة بالذات ، ونحن نستخدم فئران بالغة (3-6 أشهر من العمر) والقرود cynomologus الكبار (9-15 سنة). هذه التقنية ، ووصف في الأصل من قبل المختبر ليختمن الدكتور (غان

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices. J. Vis. Exp. (41), e2081, doi:10.3791/2081 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تلطيخ DiOLISTIC يستخدم المسدس لإدخال جينات الأصباغ الفلورية ، مثل الجاذبة ، في الخلايا العصبية في الدماغ من شرائح (غان وآخرون ، 2009 ؛. اوبراين وLummis ، 2007 ؛ غان وآخرون ، 2000). هنا نقدم وصفا تفصيليا لكل خطوة من الخطوات المطلوبة مع صور مثالية من النتائج الجيدة والسيئة التي من شأنها أن تساعد عند إعداد هذه التقنية. في تجربتنا ، ثبت بضع خطوات حاسمة من أجل التطبيق الناجح للDiOLISTICS. هذه الاعتبارات تشمل نوعية الرصاص الجاذبة المغلفة ، ومدى التعرض تثبيتي ، وتركيز المنظفات المستخدمة في حلول الحضانة. وتقدم النصائح والحلول للمشاكل المشتركة.

هذا هو أسلوب وضع العلامات متعددة الجوانب التي يمكن تطبيقها على الأنواع الحيوانية متعددة في مجموعة واسعة من الأعمار. خلافا لغيرها من تقنيات الوسم الفلورسنت التي تقتصر على الأعمال التحضيرية من الحيوانات الصغيرة أو تقتصر على الفئران لأنها تعتمد على التعبير عن التحوير فلوري ، يمكن تطبيق وضع العلامات DiOLISTIC للحيوانات من جميع الأعمار والأنواع والأنماط الجينية ويمكن استخدامه في تركيبة مع immunostaining لتحديد subpopulation محددة من الخلايا. نحن هنا لشرح استخدام DiOLISTICS إلى الخلايا العصبية في الدماغ التسمية في شرائح من الفئران البالغين والكبار الرئيسات غير البشرية وذلك بهدف قياس تغصن متفرعة ومورفولوجيا شجيري العمود الفقري.

Protocol

1. إعداد الجاذبة / التنغستن نقطي الخرزة : يجب الجاذبة (1 - 1' - Dioctadecyl - 3 ، 3،3 '، 3' - tetramethylindocarbocyanine البركلورات) يعد الرصاص في وقت مبكر من قطع شرائح الدماغ. الإجراء يستغرق حوالي 2-4 ساعات اعتمادا على كيفية العديد من الرصاص على استعداد في نفس الوقت.

  1. إذا بدءا من دفعة جديدة من الخرز التنغستن ، وإعداد aliquots من 300 ملغ لكل منهما. مستعدون Aliquots بتعليق 6 غرامات من التنغستن في 2 مل من كلوريد الميثيلين. ثم ، ماصة 100 ميكرولتر من محلول حبة في أنابيب لإنتاج microfuge aliquots من 300 ملغ الخرز التنغستن aliquots تخزن في درجة حرارة الغرفة (ملاحظة : كلوريد الميثيلين يتبخر بسرعة فائقة الكحول يمكن أن تستخدم أيضا تقليل التبخر.)...
  2. عندما بدءا من aliquots من الخرز ، resuspend كل قسامة (300 حبات التنغستن ملغ) في 300 ميكرولتر من كلوريد الميثيلين والغطاء بسرعة لمنع التبخر. هذه الكمية تكفي لمدة 3 دفعات من الرصاص.
  3. تحضير محلول الصبغة التي تزن 13.5 ملغ من الصبغة الجاذبة محبة للدهون ، وإضافة 450 ميكرولتر من كلوريد الميثيلين (تركيز النهائي = 3mg/100μl).
  4. معطف الخرز مع صباغة. وضع شريحة زجاجية على قطعة من الشمع المغلفة وزن الورق وماصة 100 ميكرولتر من الخرز على الشريحة. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الجاذبة ، مزيج دقيق باستخدام ماصة الحافة ، والهواء الجاف حتى حبات بدوره رمادي فاتح.
  5. استخدام شفرة الحلاقة لكشط قبالة الخرز شريحة زجاجية وحبات الزهر الى مسحوق ناعم (ملاحظة : استخدام شفرة جديدة إذا يفعل أكثر من لون واحد من الرصاص حتى لا تلوث الأصباغ).
  6. الخرز على كشط ووزن الورق والخرز قمع مخروطي في أنبوب 15 مل. أضف 3 مل من الماء ويصوتن في حمام مائي لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ملاحظة : يتم تطبيق التكعيب من المسحوق وصوتنة للحد من تشكيل كتل من الخرز المغلفة التي من شأنها تعطيل العلامات متفرق من الخلايا العصبية الفردية).

2. إعداد بوفيدون (PVP) حل وأنابيب : لتحسين مرفق حبة لأنابيب الرصاص (أنابيب TEZFEL) ، ومعطف مع الحل (PVP) بوفيدون.

  1. تحضير 10 مل من محلول PVP في الماء بتركيز PVP 10 ملغ / مل.
  2. استخدام حقنة 12 مل مع محول أنابيب (أنابيب مرنة بقطر أكبر قليلا) لتمرير الحل PVP من خلال أنابيب الرصاص ومن ثم إخراجها من الطرف الآخر. إعادة حل لأنابيب معطف أكثر الرصاصة إذا كان قد أعد عدة دفعات في وقت واحد. تجاهل PVP حل بعد الاستخدام.
  3. إضافة إلى أنابيب حبات الرصاص ، دوامة حبات لإنتاج حل متجانسة واستخدام حقنة لسحب الحل حبة من خلال الأنبوب حتى يتم توزيعها بالتساوي في جميع أنحاء أن حبات الأنابيب. ((ملاحظة :) في محاولة للتقليل من عدد من فقاعات الهواء في الأنبوب).
  4. تغذية أنابيب عبر المحطة الإعدادية والسماح لتسوية الخرز. استخدام الحقنة بلطف لإزالة الماء بحيث لا تبقى الخرز.
  5. تدور الأنابيب في المحطة الإعدادية والجافة مع غاز النيتروجين حتى قطرات الماء لم تعد مرئية. هذه الخطوة سوف يستغرق حوالي 10-20 دقيقة.
  6. قطع الرصاص مع قطع الأنابيب إلى 13 مم وأطوال مكان في قارورة تحتوي على التلألؤ Drierite أو نوع من كبريتات الكالسيوم اللامائية. التفاف قارورة في احباط للحماية من الضوء.

3. يلطخ الجاذبة : يمكن استخدام هذه التقنية لوضع العلامات وصمة عار الخلايا العصبية في أنسجة المخ من الأنواع المختلفة ، وفي هذه الحالة بالذات ، من الماوس (3-6 أشهر من العمر) والرئيسات غير البشرية (9-15 سنة).

فمن الأفضل أن يتم إعداد شرائح من أنسجة المخ الثابتة التي حصلت عليها من محلول الارواء transcardiac تثبيتي ، لأن الحفاظ على الأنسجة ومن المتوقع أن تكون أفضل تحت هذا الشرط. ومع ذلك ، من خلال تثبيت نضح ليس ممكنا دائما (كما كان الحال مع أنسجة قرد) ، ويمكن وضع العلامات DiOLISTIC تزال تطبق بنجاح في إطار إجراءات مختلفة لإعداد الأنسجة. نحن هنا وصف ثلاثة إجراءات مختلفة لإعداد الأنسجة :

  1. إصلاح الدماغ عن طريق إزالة نضح transcardiac → → POSTFIX الدماغ لمدة 10 دقيقة قطعت → → شريحة وصمة عار
  2. إزالة المخ → خفض كتلة من الأنسجة → → غسل كتلة الإصلاح في شريحة PBS قطع → → صمة عار
  3. إزالة قطع شرائح الدماغ → → → الإصلاح تغسل وصمة عار →

في هذه الدراسة ، تم الحصول على أدمغة القرود من الموضوعات التي كانت perfused transcardially مع السوائل الباردة الجليد الاصطناعي الشوكي الدماغي (ACSF) قبل الحصاد الدماغ وكتلة (4 مم) من الأنسجة التي تحتوي على المذنبة aتم إصلاح الثانية لمدة 60 دقيقة putamen في درجة حرارة الغرفة. لجميع إجراءات حل تثبيتي يحتوي بارافورمالدهيد 4 ٪ والسكروز 4 ٪ في برنامج تلفزيوني (أعدت طازجة أو تستخدم في غضون 15 يوما). ومن المهم أن نلاحظ أن أوقات حاسمة لتثبيت التلوين ناجحة. يمكن أن تؤثر على تلطيخ Overfixation من خلال تعطيل سلامة غشاء البلازما وتسبب في تسرب الصبغة خارج الخلية (انظر مزيد من المعلومات بخصوص النتائج).

  1. لإجراء أ و ب ، يتم قطع شرائح (200μm) من الدماغ كتلة ثابتة أو شرائح الأنسجة وضعت في 24 لوحة جيدا مع برنامج تلفزيوني. ج عن الإجراء ، يتم المقطوفة شرائح الدماغ الحاد (200 ميكرون) مع vibratome في محلول يحتوي على قطع الباردة (مم) 110 - CL الكولين ، 25 NaHCO 3 ، 1.25 ناه 2 ص 4 ، 2.5 بوكل ، 0.5 CaCl 2 ، 7 MgCl 2 ، وضعت 25 الجلوكوز ، 11.6 حمض الأسكوربيك ، حمض البيروفيك 3.1 (310 = الأسمولية mOsmols) ومباشرة بعد الشرائح في 24 لوحات جيدة وثابتة لمدة 30 دقيقة مع الحل تثبيتي في درجة حرارة الغرفة.
  2. تغسل شرائح مع برنامج تلفزيوني ، 3 مرات.
  3. قبل شرائح إطلاق النار ، وإزالة PBS من الآبار ، وباستخدام الفرشاة ، ضع شريحة في وسط البئر.
  4. اطلاق الرصاص الجاذبة من خلال ورقة 3.0 ميكرون تصفية باستخدام مدفع الجينات هيليوس النظام في الضغط 120-180 رطل من غاز الهليوم من خلال وضع المسدس على مسافة 1.5 سم بين العينة ونهاية للبرميل.
    (ملاحظة هامة : سيتم تسمية الخلايا العصبية فقط خلال 50 ملم من السطح شريحة من هذا الأسلوب لذلك من المهم للحفاظ على نفس الجانب من شريحة مواجهة يغسل وخلال لتركيب وبهذه الطريقة ، وسوف تأكد من أن وسوف تكون الخلايا العصبية المسماة مسافة التنسيق عند التصوير مع المجهر مبائر).
  5. تغسل شرائح مع 3 مرات في برنامج تلفزيوني وتخزينها في برنامج تلفزيوني لعدة ساعات للسماح للالجاذبة للانتشار على طول التشعبات.
  6. جبل الشرائح على شريحة زجاجية مع إطالة Antifade الذهب وتغطي مع ساترة NO.1 18X18 ملم. (ملاحظة : للج الداخلي ، فمن الأفضل لتركيب شرائح في اليوم نفسه على سلامة شرائح ليست بحالة جيدة بين عشية وضحاها).
  7. وختم المجففة مع طلاء الأظافر واضحة بعد وسائل الإعلام في تصاعد مستمر.
  8. بدلا من ذلك ، يمكن أن يلطخ الشرائح مع الأضداد قبل التركيب كما هو موضح أدناه.
    (ملاحظة : يمكن استخدام شرائح لا يقل عن 6 أشهر إلى سنة إذا المخزنة في الظلام في 4 درجات مئوية. الجاذبة هو ضوء حساسية والتعرض الطويل للضوء سوف يسبب وصمة عار في التلاشي).

4. يلطخ الأضداد : يجب أن يكون تنفيذ Immunostaining بعد الخطوة 3.4 و قبل التركيب.

  1. Permeabilization : شرائح في احتضان 0.01 ٪ تريتون X - 100 في حل برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (300-500 ميكرولتر لكل بئر).
    ملاحظة : عدم استخدام تركيزات أعلى من المنظفات حيث سيؤدي ذلك إلى حل الجاذبة وخفض كبير في تلطيخ الفلورسنت. في محاولة لتقليل الوقت في صناعة المنظفات وحضانات واسعة النطاق سوف يقلل أيضا من العلامات الجاذبة. إذا مددت حضانات ضرورية ، والحفاظ على شرائح في برنامج تلفزيوني وليس في عرقلة الحل.
  2. حظر : احتضان شرائح في محلول يحتوي على حجب 10 ٪ مصل الماعز ، 0.01 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. الأجسام المضادة الأولية : إضافة الأضداد في التخفيف المطلوب في حل حجب (مثل أرنب المضادة للأجسام المضادة في GFP 1:1000 تمييع). إضافة 300-500 ميكرولتر لكل بئر واحتضان لمدة 1-2 ساعات. (ملاحظة : إذا حضانات ضرورية بين عشية وضحاها ، وإزالة الحجب المنظفات من الحل).
  4. تغسل شرائح مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 -- 15 دقيقة ، 3 مرات.
  5. الأجسام المضادة الثانوية : احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إعداد الثانوية حل الأضداد في التخفيف المطلوب في حل حظر (على سبيل المثال ، اليكسا فلور 488 الضد مترافق في التخفيف 1:1000).
  6. تغسل شرائح مع برنامج تلفزيوني ل15/05 دقيقة ، 4 مرات.
  7. جبل شرائح على الشرائح مع إطالة Antifade الذهب ، وتغطي مع ساترة 18x18 ملم NO.1. وختم المجففة مع طلاء الأظافر وسائل الاعلام بعد التركيب.

5. ممثل النتائج :

  1. التحقق من العلامات الصحيحة : قسم يمكن تصور تحت نطاق الفلورسنت تشريح مجهزة مصباح الزئبق الأحمر المكعب وتصفية الفلورسنت لتأكيد وضع العلامات DiOLISTIC ناجحة. الشكل 1 يبين صورا مثالية للأقسام الدماغ المسمى لطيف الحصول على التكبير منخفضة. اثنين من الخصائص المهمة للبحث عن وجود نمط العلامات متفرق (الشكل 1A) والقدرة على التعرف على مكونات الخلية الفردية (الشكل 1B - C). المشاكل العلامات DiOLISTIC : يبين الشكل 2 أمثلة على المقاطع التي وسم DiOLISTIC عملت بشكل غير صحيح. في تجربتنا ، وهناك ثلاثة أسباب رئيسية فعالة لوضع العلامات :
    • وسم متناثر كثيفة جدا أو : تتم تسمية عدد قليل جدا من الخلايا في المقطع في حالة واحدة أو وصفت العديد من الخلايا تمنع العزلة ودراسة العناصر الخلوية واحد. الحل : ضبط تركيز حبات مغلفة في الحل النهائي تستخدم لطلاء الأنابيب رصاصة TEFZEL (القسم 1.6). نقصان أو زيادة حجم المياه (3 مل القيمة الأولية) المستخدمة في حل حبات من أجل تصحيح لوضع العلامات متفرق جدا أو كثيفة جدا ، على التوالي. بالإضافة ، قد يكون سبب انخفاض كفاءة العلامات بنسبة أقل من ضغط الغاز الأمثل عند اطلاق النار على حبات مغلفة على الأبواب. يمكن أن يكون هذا الاحتمال استبعد من قبل التأكد من أن أنابيب الرصاص TEFZEL أصدرت أكثر من الخرز المغلفة ويبدو واضحا بعد اطلاق النار. خلاف ذلك ، ينبغي زيادة ضغط الغاز لاطلاق النار.
    • تتشكل كتل كبيرة أو مجموعات من الخرز التنغستن صبغ المغلفة أثناء إعداد الرصاص : الرصاص سيئة. وسوف تشبه المقاطع الأمثلة في الشكل 2A - B. الحل : جعل الرصاص جديدة مع إيلاء اهتمام خاص إلى القسم 1.5 و / أو تمديد الوقت صوتنة في القسم 1.6.
    • الإفراط في التثبيت : يتم الاحتفاظ النسيج في محلول بارافورمالدهيد لفترة أطول من الوقت اللازم لتحديد أمثل (30 دقيقة للأقسام 200-300 ميكرون ، 1 ساعة لمدة 4 أبواب ملم). هذه التنازلات على سلامة غشاء البلازما وينتج المسمى المقاطع التي تبدو مثل تلك التي تظهر في الشكل 2C - D في وضع العلامات التي يبدو من التركيز بسبب تشتت صبغة من الخلايا. الحل : تقليل وقت التثبيت.
  2. التصوير مبائر : يتم الحصول على صورة مداخن باستخدام المجهر مبائر (زايس LSM 510 META) مع الهدف 20X للخلية كاملة وموضوعية 63x غمر المياه للقطاعات تغصن. لقد كان امرا مثيرا الجاذبة باستخدام الليزر DPS 561 نانومتر الخط الأخضر ومضان من الأجسام المضادة الثانوية كان متحمس باستخدام الليزر 488 نانومتر الخط. وsectioning الضوئية للعينة المسمى تحقيقه عندما يسمح باستخدام المجهر مبائر مزيد من العزلة واحدة من الخلايا المسمى في العينة. الشكل 3A يظهر شائك المتوسطة مخططي عصبون من مخ الفأر وفروعه تغصن نمط معقد. صور عالية التكبير فروع تغصن هذه الخلايا العصبية من القوارض (الشكل 3B) والرئيسيات غير البشرية (الشكل 3C) تثبت درجة تلوين في العمود الفقري شجيري التشعبات وباستخدام هذه التقنية في كل من الأنواع. التشعبات ونتوءات فيها (العمود الفقري) تبدو واضحة المعالم ، حتى عندما تنظر منذ فترة طويلة والعمود الفقري رؤساء رقيقة وفيرة جدا في الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة.

    عند الجمع بين DiOLISTICS مع immunostaining ، والتصوير مبائر مفيد أيضا في إضفاء الطابع المحلي على نحو لا لبس فيه وصمة عار على الطائرة نفسها ، والتنسيق في الخلية نفسها. ويبين الشكل 4 مثالا colocalization لوضع العلامات والجاذبة للimmunostaining GFP في خلية واحدة. صورة واحدة المكدس (0.7 ميكرومتر Z - قسم) تم الحصول عليها من شريحة من مخططي ماوس وراثيا التعبير عن بروتين فلوري GFP تحت مستقبلات الدوبامين D1 المروج.

الشكل 1
الشكل 1. الجاذبة توسيم الخلايا العصبية في الدماغ من شرائح غير البشرية الرئيسيات. (أ) صورة التكبير قليلة من شريحة الدماغ ملون يحتوي على نواة المذنب من قرد الرباح العلامات التي تظهر متفرق من الخلايا العصبية مع الجاذبة (ق) يمكن عزل الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة التعرف عليها بسهولة باستخدام نطاق الفلورسنت تشريح.

الشكل 2
الشكل 2. العلامات DiOLISTIC الأخطاء وإصلاحها. (أب) من شرائح الملون المخطط الظهري من قرد (A) والفأرة (ب) تظهر كتل كبيرة من صبغة المغلفة الخرز ونتيجة لذلك ، لا يمكن التمييز بين العناصر الفردية الخلوية. (CD) الصور التي تجسد نتيجة تطبيق DiOLISTIC وضع العلامات على المقاطع التي تم الاحتفاظ بها في حل تثبيتي لفترات طويلة من الزمن أو الأنسجة حيث فشل في الحفاظ على قرد (C) والفأر الأنسجة (D).

الشكل 3
الشكل 3. صورة من مخططي متحد البؤر المتوسطة شائك الخلايا العصبية ملطخة الجاذبة. (A) ، كومة صورة خلية بأكملها يسمح للتحليل الصرفي للفروع شجيري. شرائح تغصن (ق) من الماوس (B) والقرد (C) الخلايا العصبية الشوكية المتوسطة تظهر العلامات واضحة للتغصن والعمود الفقري.

الشكل 4
الشكل 4. الجمع بين العلامات DiOLISTIC مع immunostaining. (أ) المسمى الجاذبة (B) Immunostaining استخدام الألغام المضادة للGFP الضد كما وصفها لي من طرق تكييف وآخرون. (2006). الحقل بنفس الصورة (C) ألف مركب من الأحمر والأخضر ومضان يحدد الجاذبة التي تحمل علامات العصبية والخلايا العصبيه GFP إيجابية.

Discussion

وسم DiOLISTIC هي واحدة من أكثر التقنيات المتاحة للخلايا متعددة العلامات fluorescently لأنه لا يمكن تطبيقه على أنسجة من المقاطع الأنواع المختلفة ، على مجموعة واسعة من الأعمار ، والأنسجة التي تم الحصول عليها طازجة أو من تثبيتي - perfused الحيوانات (انظر أيضا غان وآخرون . ، 2009). عملية سريعة نسبيا لأنه يأخذ 1-2 أيام ، ويمكن دمجها مع غيرها من الأساليب الكلاسيكية أكثر العلامات مثل immunostaining (لي وآخرون ، 2006). وينبغي إيلاء اهتمام خاص لتجنب حول تحديد واستخدام تركيزات عالية المنظفات في الحضانة ، لأن هذه الحلول سيضم سلامة غشاء محبة للدهون وتؤدي إلى تسرب الصبغة خارج الخلايا. ويمكن تسهيل اختراق الأجسام المضادة التي تركيزات منخفضة من تريتون X - 100 (لي وآخرون ، 2006) ، فضلا عن ديجيتونين أو سابونين في حل الحضانة (Matsubayashi وآخرون ، 2008). بعض التعديلات التي يمكن تطبيقها على هذه التقنية بما في ذلك استخدام الرصاص مع الأصباغ متعددة كما وصفها آخرون غان (2000) أو تغيير طول ونوع من التعرض للأجسام المضادة (نيلي وآخرون ، 2009).

تقليديا ، استخدمت الجاذبة لتتبع توقعات العصبية في الدماغ. وسم DiOLISTIC توسع تطبيقها من خلال وصف وسيلة مفيدة لدراسة مورفولوجية الخلية. مورفولوجيا الخلايا العصبية هي ذات أهمية كبيرة وذلك بسبب التنوع الكبير الموجود في الدماغ وتكهنات بأن شكل الخلية قد تنعكس على وظيفة تعدد السكان الخلايا العصبية في الجهاز العصبي. أحد الأمثلة على ذلك هو حقيقة أن الخلايا العصبية الكثيرة في الجهاز العصبي لدى الثدييات عرض نتوء صغير يسمى العمود الفقري شجيري التي هي من نقاط الاشتباك العصبي موقع glutamatergic. بهذه الطريقة ، يمكن أن ترتبط كثافة نقاط الاشتباك العصبي glutamatergic على خلية لكثافة الأشواك الجذعية ، والتي يمكن قياسها باستخدام تقنية وضع العلامات الموضحة في هذه الوثيقة. وعلاوة على ذلك ، يمكن كميا المعلمات المورفولوجية الأخرى مثل إجمالي طول تغصن ، ونمط المتفرعة ، شجيري العمود الفقري شكل وكثافة ودراستها.

استخدام العلامات الفلورية لدراسة مورفولوجية العصبية العديد من المزايا بالمقارنة مع التقنيات التقليدية التي تعتمد على الحقل المجهري مشرق (مثل تلطيخ غولجي) لأنه يسمح للتصوير مبائر دقة أعلى. ميزة أخرى لاستخدام الجاذبة بوصفها fluorophore في التجارب التي تهدف إلى قياس كثافة العمود الفقري شجيري ومورفولوجيا وخصائصه محبة للدهون. أقسام الجاذبة في غشاء البلازما ويقدم الخطوط العريضة واضحة المعالم من العمليات العصبية ونتوءات شجيري. نظرا لصغر حجم معظم العمود الفقري شجيري (أقل من 1 فيمتولتر) ، وتلطيخ غشاء هو أكثر كفاءة ويسمح لأفضل تصور نتوءات صغيرة ورقيقة من تلطيخ هيولي.

Disclosures

تم تنفيذ كافة الإجراءات التالية الحيوانية توجيهات من رعاية الحيوان واللجنة استخدم في NIAAA ومركز الأبحاث الوطني ولاية أوريغون الرئيسيات. الكتاب ليس لديهم ما تكشف.

Acknowledgements

نود أن نعترف مايكل فيدر وهولواي تيريل على المساعدة التي قدموها خلال مجموعة أولية تتألف من التقنية والمختبرية الدكتور Fumi اونو ثانية للحصول على المجهر مبائر بهم. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل المعهد الوطني للصحة من خلال برنامج وجماعية من NIAAA NINDS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate (DiI) Invitrogen D-282
Methylene chloride Mallinckrodt Baker Inc. H485-06
Tungsten beads Bio-Rad 165-2269 1.7 μm diameter
Polyvinylpyrrolidone Calbiochem 529504
Tefzel bullet tubing Bio-Rad 165-2441
Tubing cutter Bio-Rad 165-2422
Helios Gene Gun Bio-Rad 165-2431
Isopore membrane filter paper EMD Millipore TSTP02500 3.0 μm pore size
ProLong Gold Antifade Invitrogen P36930
Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 (16% w/v)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOLISTIC" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harb Protoc. pdb.prot5202-pdb.prot5202 (2009).
  3. Grutzendler, J., Tsai, J., Gan, W. B. Rapid labeling of neuronal populations by ballistic delivery of fluorescent dyes. Methods. 30, 79-85 (2003).
  4. Lee, K. W., Kim, Y., Kim, A. M., Helmin, K., Nairn, A. C., Greengard, P. Cocaine-induced dendritic spine formation in D1 and D2 dopamine receptor-containing medium spiny neurons in nucleus accumbens. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 3399-3404 (2006).
  5. Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin. J Neurosci Methods. 174, 71-81 (2008).
  6. Neely, S. tanwood, Deutch, G. D., Y, A. Combination of diOlistic labeling with retrograde tract tracing and immunohistochemistry. J Neurosci Methods. 184, 332-336 (2009).
  7. O'Brien, J. A., Lummis, S. C. Diolistics: incorporating fluorescent dyes into biological samples using a gene gun. Trends Biotechnol. 25, 530-534 (2007).
  8. Shen, H. W., Toda, S., Moussawi, K., Bouknight, A., Zahm, D. S., Kalivas, P. W. Altered dendritic spine plasticity in cocaine- withdrawn rats. J. Neurosci. 29, 2876-2884 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics