В естественных условиях микро-циркуляции Измерение в скелетной мышце путем Intra-жизненно микроскопии

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Новый универсальный метод для наблюдения микроциркуляцию представлена. Считается, подходит для долгосрочного наблюдения, так и для комбинации с pharmacophysiological или молекулярно-биологических вмешательств.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Asai, A., Sahani, N., Ouchi, Y., Martyn, J., Yasuhara, S. In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy. J. Vis. Exp. (4), e210, doi:10.3791/210 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ИСТОРИЯ ВОПРОСА: Регулирующие факторы и подробные физиологии микроциркуляции в естественных условиях остаются окончательно не уточнена после многих различных форм визуализации были изобретены. Хотя многие макроскопических параметров потока крови отражает скорость течения, изменения скорости кровотока и красные кровяные клетки (эритроциты) поток не выполняется линейная зависимость в микроскопических наблюдений. Есть сообщения, расхождения между РБК и РБК скорости потока, РБК потока и потока плазмы объема и пространственной и временной неоднородности регулирование стока в периферических тканях в микроскопических наблюдений, научной основы для требований более детальных исследований в микроциркуляторном регулированию использования прижизненной микроскопии.

Методы: Мы изменили метод Джефф Лихтман о в естественных условиях микроскопических наблюдений мышцы мыши грудино-сосцевидный. Мыши под наркозом, вентилируемые, и вводили PKH26L-флуоресцентно меченых эритроцитов для микроскопического наблюдения.

РЕЗУЛЬТАТ И ВЫВОДЫ: флуоресцентно меченых эритроцитов обнаружены и отличается хорошо широким полем зрения микроскопа. Сокращение мышц вызванные электрической стимуляцией индуцированный рост РБК потока. Количественная оценка других параметров, включая РБК скорости и плотности капилляров было возможно. Мыши хорошо переносится операции, инъекции окрашенные эритроциты, микроскопические наблюдения и электрической стимуляции. Нет мышц или повреждению кровеносных сосудов наблюдается, предполагая, что наш метод является относительно менее инвазивных и подходит для длительных наблюдений.

Protocol

Мембраны эритроцитов окрашивание

  1. Мышь клетки красной крови были исправлены с тем же штаммом мыши с гепаринизация.
  2. Мышь РБК окрашивали PKH26 красителя (551/567 нм, красный флуоресцентный комплект компоновщика клетки, Sigma, США).
  3. РБК промывали в PBS и инкубировали с 2 мкм решение PKH26 красителя в течение 5 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением плазмы (тепло инактивированной в течение 1 часа при температуре 65 ° C заранее) и инкубировали в течение 1 минуты.
  4. Окрашенных РБК промывали 5 раз с PBS.

Мышь Подготовка

  1. От трех до шести месяцев летний мужчина C57BL/10 мышей были использованы в этом исследовании. Мы наркозом мышей при введении препарата в фенобарбиталом (50mg/kgBW).
  2. Мыши были тогда интубированных с 20-Gage полиэтиленовых труб, искусственной вентиляции легких, и нагревают при температуре 37 ° С на обогреватель Kapton лист связан с термопары датчика и обратной связи регулятора температуры системы.
  3. Вентральной стороне шеи был выбрит. Правой и левой грудино-сосцевидный мышцы подвергались. Мышцы были поддержаны из нержавеющей стали и держатель superfused стерильным раствором Кребса Рингера.

Инъекция

  1. Витражи были эритроциты нагревают при 37 ° С, разбавляют Кребса Рингера. 50ul окрашенных эритроцитов (гематокрит 12%) вводили мыши из полового члена вены.

В естественных условиях Микроскопические наблюдения скелетных мышц

Мы следовали Джефф В. Лихтман 'ы метода с модификацией 1:

  1. Животные были помещены на грелку на вершине ручной железо этапе Nikon Eclipse-800 микроскоп. Водо-погружения объективы были использованы для живых эпи-флуоресцентного наблюдения. Мы наблюдали PKH26 окрашенных РБК течет внутри сосудистого под флуоресцентным светом ртутной лампы. Мы определили первичные артериол, среднее артериол, капилляров и вен их эритроциты направления потока и архитектур.
  2. Активизировались SIT камера (Hamamatsu Photonics, C2400, Япония) и видео-захвата кадров были установлены, чтобы захватить низкой интенсивности сигнала на видео в реальном времени скорости (30 кадров в секунду). Изображения были записаны на DVD, видео файлов.

Миостимуляторы

  1. Электрический импульс, создан с помощью стимулятора периферических нервов (Innervator 252, Fisher & Paykel здравоохранения, Новая Зеландия), и доставлен в мышцах поверхность через покрытием из нержавеющей зонда. Минус конец зонда был сделан на проксимальной части мышцы и плюс конце был сделан на дистальной части мышцы. Столбняк стимуляции были даны из расчета 50 Гц в течение 5 секунд. Электрические стимулы не вызывают прямого ущерба myofiber по близости от площади контакта.

РБК потока анализ

  1. Записанные изображения DVD видео были перенесены видео файлы Savant образ с помощью программного обеспечения видеозахвата (Video Savant, США). Видеоизображение, были рассмотрены в установленном скорость, чтобы визуализировать отдельных окрашенных РБК. РБК потока измерялась путем подсчета РБК, который летел через сосредоточены первичные артериол в минуту.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Важно techinical точек таковы: (1) поддержание физиологического состояния животного (вентиляция, рН perfusative решение, температуры тела), (2) объемом впрыска от окрашенных РБК, и (3) условия наблюдения (оптимальный объектив Выбор, интенсивности флуоресценции). Потенциальные будущие приложения являются: (а) вместе с pharmacophysiological и / или молекулярно-биологических мероприятий, (б) долгосрочные наблюдения артерио / arteriolo-склероз и образование новых сосудов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все процедуры, связанные с экспериментов на животных, были рассмотрены и одобрены Подкомитетом по исследованиям животных Уход за Massachusetts General Hospital.

Acknowledgements

Мы благодарим JW Лихтман за его советы в в естественных условиях наблюдения мышц.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PKH26 dye Sigma-Aldrich 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice Animal Three to six month old males
pentobarbital anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).

Comments

1 Comment

  1. How do you adjust for overloading of the circulation since you are increasing the total blood volume of the mouse which I guess would have non-physiological implications?

    Reply
    Posted by: Moji M.
    November 26, 2009 - 12:18 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics