В естественных условиях микро-циркуляции Измерение в скелетной мышце путем Intra-жизненно микроскопии

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Новый универсальный метод для наблюдения микроциркуляцию представлена. Считается, подходит для долгосрочного наблюдения, так и для комбинации с pharmacophysiological или молекулярно-биологических вмешательств.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Asai, A., Sahani, N., Ouchi, Y., Martyn, J., Yasuhara, S. In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy. J. Vis. Exp. (4), e210, doi:10.3791/210 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ИСТОРИЯ ВОПРОСА: Регулирующие факторы и подробные физиологии микроциркуляции в естественных условиях остаются окончательно не уточнена после многих различных форм визуализации были изобретены. Хотя многие макроскопических параметров потока крови отражает скорость течения, изменения скорости кровотока и красные кровяные клетки (эритроциты) поток не выполняется линейная зависимость в микроскопических наблюдений. Есть сообщения, расхождения между РБК и РБК скорости потока, РБК потока и потока плазмы объема и пространственной и временной неоднородности регулирование стока в периферических тканях в микроскопических наблюдений, научной основы для требований более детальных исследований в микроциркуляторном регулированию использования прижизненной микроскопии.

Методы: Мы изменили метод Джефф Лихтман о в естественных условиях микроскопических наблюдений мышцы мыши грудино-сосцевидный. Мыши под наркозом, вентилируемые, и вводили PKH26L-флуоресцентно меченых эритроцитов для микроскопического наблюдения.

РЕЗУЛЬТАТ И ВЫВОДЫ: флуоресцентно меченых эритроцитов обнаружены и отличается хорошо широким полем зрения микроскопа. Сокращение мышц вызванные электрической стимуляцией индуцированный рост РБК потока. Количественная оценка других параметров, включая РБК скорости и плотности капилляров было возможно. Мыши хорошо переносится операции, инъекции окрашенные эритроциты, микроскопические наблюдения и электрической стимуляции. Нет мышц или повреждению кровеносных сосудов наблюдается, предполагая, что наш метод является относительно менее инвазивных и подходит для длительных наблюдений.

Protocol

Мембраны эритроцитов окрашивание

  1. Мышь клетки красной крови были исправлены с тем же штаммом мыши с гепаринизация.
  2. Мышь РБК окрашивали PKH26 красителя (551/567 нм, красный флуоресцентный комплект компоновщика клетки, Sigma, США).
  3. РБК промывали в PBS и инкубировали с 2 мкм решение PKH26 красителя в течение 5 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением плазмы (тепло инактивированной в течение 1 часа при температуре 65 ° C заранее) и инкубировали в течение 1 минуты.
  4. Окрашенных РБК промывали 5 раз с PBS.

Мышь Подготовка

  1. От трех до шести месяцев летний мужчина C57BL/10 мышей были использованы в этом исследовании. Мы наркозом мышей при введении препарата в фенобарбиталом (50mg/kgBW).
  2. Мыши были тогда интубированных с 20-Gage полиэтиленовых труб, искусственной вентиляции легких, и нагревают при температуре 37 ° С на обогреватель Kapton лист связан с термопары датчика и обратной связи регулятора температуры системы.
  3. Вентральной стороне шеи был выбрит. Правой и левой грудино-сосцевидный мышцы подвергались. Мышцы были поддержаны из нержавеющей стали и держатель superfused стерильным раствором Кребса Рингера.

Инъекция

  1. Витражи были эритроциты нагревают при 37 ° С, разбавляют Кребса Рингера. 50ul окрашенных эритроцитов (гематокрит 12%) вводили мыши из полового члена вены.

В естественных условиях Микроскопические наблюдения скелетных мышц

Мы следовали Джефф В. Лихтман 'ы метода с модификацией 1:

  1. Животные были помещены на грелку на вершине ручной железо этапе Nikon Eclipse-800 микроскоп. Водо-погружения объективы были использованы для живых эпи-флуоресцентного наблюдения. Мы наблюдали PKH26 окрашенных РБК течет внутри сосудистого под флуоресцентным светом ртутной лампы. Мы определили первичные артериол, среднее артериол, капилляров и вен их эритроциты направления потока и архитектур.
  2. Активизировались SIT камера (Hamamatsu Photonics, C2400, Япония) и видео-захвата кадров были установлены, чтобы захватить низкой интенсивности сигнала на видео в реальном времени скорости (30 кадров в секунду). Изображения были записаны на DVD, видео файлов.

Миостимуляторы

  1. Электрический импульс, создан с помощью стимулятора периферических нервов (Innervator 252, Fisher & Paykel здравоохранения, Новая Зеландия), и доставлен в мышцах поверхность через покрытием из нержавеющей зонда. Минус конец зонда был сделан на проксимальной части мышцы и плюс конце был сделан на дистальной части мышцы. Столбняк стимуляции были даны из расчета 50 Гц в течение 5 секунд. Электрические стимулы не вызывают прямого ущерба myofiber по близости от площади контакта.

РБК потока анализ

  1. Записанные изображения DVD видео были перенесены видео файлы Savant образ с помощью программного обеспечения видеозахвата (Video Savant, США). Видеоизображение, были рассмотрены в установленном скорость, чтобы визуализировать отдельных окрашенных РБК. РБК потока измерялась путем подсчета РБК, который летел через сосредоточены первичные артериол в минуту.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Важно techinical точек таковы: (1) поддержание физиологического состояния животного (вентиляция, рН perfusative решение, температуры тела), (2) объемом впрыска от окрашенных РБК, и (3) условия наблюдения (оптимальный объектив Выбор, интенсивности флуоресценции). Потенциальные будущие приложения являются: (а) вместе с pharmacophysiological и / или молекулярно-биологических мероприятий, (б) долгосрочные наблюдения артерио / arteriolo-склероз и образование новых сосудов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все процедуры, связанные с экспериментов на животных, были рассмотрены и одобрены Подкомитетом по исследованиям животных Уход за Massachusetts General Hospital.

Acknowledgements

Мы благодарим JW Лихтман за его советы в в естественных условиях наблюдения мышц.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PKH26 dye Sigma-Aldrich 551/567 nm; Red fluorescent cell linker kit
C57BL/10 mice Animal Three to six month old males
pentobarbital anesthetic, 50mg/kgBW, i.p.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lichtman, J. W., Magrassi, L., Purves, D. Visualization of neuromuscular junctions over periods of several months in living mice. J Neurosci. 7, 1215-1222 (1987).

Comments

1 Comment

  1. How do you adjust for overloading of the circulation since you are increasing the total blood volume of the mouse which I guess would have non-physiological implications?

    Reply
    Posted by: Moji M.
    November 26, 2009 - 12:18 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics