نقرا الإسفار في الموقع التهجين في أقسام المخ طازجة

Published 8/14/2010
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

هذا البروتوكول ينطوي على غير المشعة

Cite this Article

Copy Citation

Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L. A., Pinaud, R. Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections. J. Vis. Exp. (42), e2102, doi:10.3791/2102 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نحن هنا تصف نسخة معدلة من مضان مزدوجة

Protocol

وقد تم تطوير هذا البروتوكول وصقلها على أساس معيار المشعة وغير المشعة طرق التهجين في الموقع ، وضعت مسبقا من قبلنا وغيرها للكشف عن الأنواع نص واحد أو اثنين في أنسجة الدماغ 1-7. البروتوكول هو موضح أدناه وبطول إجمالي يبلغ 2 أو 3 أيام ، اعتمادا على عدد من انقطاع الإجرائية التي اختارها المستخدم النهائي. جميع الخطوات المفصلة أدناه هي يجب أن تتم في درجة حرارة الغرفة ، مع استثناء من خطوة riboprobe التهجين ويغسل بعد التهجين. يمكن العثور على حلول والمخازن اللازمة لجميع الخطوات التي ينطوي عليها هذا الأسلوب في نهاية هذا البروتوكول.

1. تحضير الأنسجة وSectioning

  1. قطع رأس والدماغ يخضع لاستخراج بسرعة ، ووضعها في قالب من البلاستيك ذات حجم كاف.
  2. تغطي الدماغ مع الأنسجة تيك المتوسطة التضمين والمكان بسرعة قالب من البلاستيك في حمام dry-ice/alcohol لتجميد السريع. ويمكن تخزين الأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. باستخدام ناظم البرد ، وجمع أجزاء الدماغ 2 أو 3 في الشريحة على Superfrost اتهم بلس الشرائح. وينبغي أن سماكة المقاطع تكون 10-12 ميكرومتر. ويمكن تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. إعداد أعمدة G50 Sephadex لتنقية دقق

"يمكن شراؤها الأعمدة Sephadex من مصادر تجارية ، ومع ذلك ، ونحن نقدم أدناه بديلا منخفض التكلفة لتوليد الأعمدة ، والتي سوف تكون مطلوبة من أجل تنقية التحقيق.

  1. كمية كافية من مسحوق هيدرات G50 Sephadex مع ريبونوكلياز خالية من المياه المعالجة DEPC ، (على سبيل المثال ، 2 غرام من مسحوق في 100 مل من المياه المعالجة DEPC) ، مزيج لفترة وجيزة حل وتخزين في درجة حرارة الغرفة لترسيب Sephadex الزائدة G50.
  2. إزالة طاف (الطبقة العليا من المياه) في أعقاب هطول الأمطار G50 Sephadex.
  3. كرر العملية أكثر من 3 -- 5 مرات.
  4. بعد غسل النهائي ، وإعادة تعليق G50 Sephadex الحل في المخزن TE (نسبة 1:1) ، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  5. مكان تعقيمها الصوف الزجاجي في محقنة معقمة 1 مل وضغط عليه مع المكبس لجعل طبقة المدمجة في الجزء السفلي ، ثم ضع الحقنة في أنبوب 15 مل فالكون.
  6. تخلط جيدا في حل G50 Sephadex في TE. ملء الحقنة / عمود مع هذا الحل.
  7. الطرد المركزي العمود لمدة 30 ثانية عند 1000 دورة في الدقيقة.
  8. كرر هذا الإجراء حتى يتم شغلها بالكامل تقريبا العمود مع حبات G50 Sephadex.
  9. ميكرولتر من 200 تطبيق عازلة عمود إلى عمود الغسيل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 دورة في الدقيقة. التدفق من خلال تجاهل.
  10. ميكرولتر من 200 تطبيق عازلة تمنع العمود إلى العمود وتدور لمدة 2 دقيقة في 1000 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة 4-5 مرات للتوازن العمود. ويمكن تخزين الأعمدة في 4 درجات مئوية حتى مع استخدام إذا أغلقت Parafilm.

3. التوسيم وتنقية Riboprobes

التفاصيل أدناه نحن جيل وتنقيتها من riboprobe واحد. لdFISH ، سيتم إعداد كل مسبار تنطوي على المنهجية نفسها ، إلا أنه سوف يكون المسمى واحدا من التحقيقات مع digoxigenin (DIG) الموسومة UTP في حين أن غيرها من البيوتين الموسومة UTP.

  1. إعداد مركزة (> 150 نانوغرام / ميكرولتر) وتنقيته من حل [كدنا] خطي الفائدة إما لتوليد شعور (مراقبة) أو riboprobes العقاقير.
  2. في أنبوب 1.5 مل microfuge ، إضافة 0،5-1 ميكروغرام من المنقى قالب [كدنا] ، 2 ميكرولتر من 5X التحقيق العازلة العلامات ، 1 ميكرولتر من 10X DIG (أو البيوتين) وضع العلامات المزيج ، 0.5 ميكرولتر من RNasin و 1 ميكرولتر من بوليميريز RNA المناسبة ، وجلب الحجم النهائي من الحل إلى 10 ميكرولتر مع ريبونوكلياز خالية (DEPC المعالجة) للمياه.
  3. احتضان الحل في حمام الماء عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  4. إضافة 1 ميكرولتر من الحمض الريبي النووي النقال (الأسهم ، و 20 ميكروغرام / ميكرولتر) ، و 39 ميكرولتر من العمود حظر العازلة إلى الحل.
  5. إعداد G50 Sephadex العمود لتنقية التحقيق. تحقيقا لهذه الغاية ، إضافة 50 ميكرولتر العازلة حظر على العمود وتدور لمدة 10 ثانية عند 1000 دورة في الدقيقة.
    كرر هذه الخطوة 2-3 مرات للتوازن العمود (يتم استرداد أي الكامل 50 ميكرولتر تطبيقها على العمود بعد دورة الطرد المركزي).
  6. تطبيق حل التحقيق الى موقف G50 Sephadex ، العمود أنبوب microfuge جديدة في الجزء السفلي من العمود ، وتدور لمدة 3 دقائق في 1000 دورة في الدقيقة للحصول على تنقية 50 ميكرولتر من محلول riboprobe.
  7. تقييم جودة وإنتاجية riboprobe المسمى باستخدام معيار الفورمالديهايد - RNA agarose هلام ، أو معمل ملف.

4. بعد التثبيت ، وتهجين أستلة

  1. إزالة أجزاء من الفريزر -80 درجة مئوية ، والسماح لدرجة حرارة الغرفة لكي تتوازن. لاحقا ، احتضان المقاطع في البرد ، طازجة من صنع حل بارافورمالدهيد 3 ٪ لمدة 5 دقائق.
  2. شطف لفترة وجيزة في المقاطع عhosphate مخزنة المالحة (PBS) مرتين.
  3. يذوى المقاطع الكحول من خلال سلسلة قياسية (70 ، 95 ، و 100 ٪ ، 2 دقيقة لكل منهما) ، والسماح لهم الجو الجاف.
  4. احتضان المقاطع في حل أستلة لمدة 10 دقيقة.
  5. شطف المقاطع 3 مرات في SSPE 2X.
  6. يذوى المقاطع مرة أخرى من خلال سلسلة الكحول القياسية المذكورة أعلاه ، والسماح لهم الجو الجاف.
  7. يعد حجم كاف من حل التهجين وإضافة كل riboprobes إلى الحل (تركيز التحقيق : 1 نغ / لكل ميكرولتر التحقيق). يتم تحديد الحجم الكلي للتهجين الحل استنادا إلى عدد من الفروع لتكون المهجنة (16 ميكرولتر من محلول التهجين في المقطع).
  8. تطبيق حجم كاف من الحل التهجين إلى شرائح الأنسجة وساترة ضمان عدم تراكب فقاعات الهواء الأنسجة.
  9. مكان الشرائح في حامل الشرائح المعدنية. حامل تزج في حمام الزيت المعدنية التي وضعت في 65 درجة مئوية خلال الليل. ضمان coverslips تواجه التصاعدي (أي الجانب الوحشي من صاحب الشريحة يجب أن تكون على اتصال مع الجزء السفلي من الحاويات المعدنية النفط).

5. بعد التهجين الغسلات

  1. في اليوم التالي ، وإزالة بعناية حامل الشرائح المعدنية من حمام الزيت وشطف لفترة وجيزة في الكلوروفورم لإزالة فائض المعروض النفطي من الشرائح.
  2. مكان الشرائح في إيجاد حل لSSPE 2X 5-10 دقيقة. ينبغي Coverslips فصل من الشرائح في حين حل.
  3. نقل الشرائح إلى حل جديد SSPE 2X ، والاحتفاظ بها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. نقل المقاطع في محلول يحتوي على 2X SSPE formamide زائد 50 ٪. وينبغي أن درجة حرارة هذا الحل يتطابق مع درجة الحرارة المستخدمة في إجراء التهجين بين عشية وضحاها. تبقي الشرائح في هذا الحل لمدة 1.5 ساعة.
  5. نقل المقاطع إلى حل SSPE 0.1X قبل تحسنت إلى درجة الحرارة نفسها من الخطوة التهجين. المقاطع في احتضان هذا الحل لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة ل30 دقيقة إضافية.

6. كشف والتخيل من Riboprobes

  1. نقل الشرائح إلى TNT العازلة التي تمت إضافة 0.3 ٪ بيروكسيد الهيدروجين ، لمدة 10 دقيقة.
  2. المقاطع في غسل العازلة TNT ، و 3 مرات (10 دقيقة لكل منهما).
  3. باستخدام قلم داكو ، رسم جيدا في جميع أنحاء المنطقة التي تحتوي على أقسام الدماغ. الأهم من ذلك ، ينبغي توخي الحذر لضمان أن المقاطع لا تجف.
  4. ميكرولتر من 150 تطبيق عازلة TNB إلى كل الشرائح ، واحتضان المقاطع في هذا الحل لمدة 30 دقيقة ، في غرفة رطبة.
  5. إزالة الزائدة حل TNB الشرائح التي تميل.
  6. تطبيق 150 ميكرولتر من محلول يحتوي على TNB البيروكسيداز - DIG مترافق المضادة للأجسام المضادة ، والشرائح تخزينها في غرفة رطبة لمدة 2 ساعة. وينبغي تحديد تركيز الأجسام المضادة بشكل فردي لكل نص الفائدة قبل القيام dFISH.
  7. المقاطع في غسل العازلة TNT ؛ 3 مرات ، 10 دقيقة لكل منهما.
  8. ميكرولتر من 150 تطبيق اليكسا 594 - مترافق tyramide تعمل على حل كل شريحة ، وتخزينها في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة. وينبغي إعداد هذا الحل وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة.
  9. المقاطع في غسل العازلة TNT ؛ 3 مرات ، 10 دقيقة لكل منهما.
  10. المقاطع في احتضان TNT العازلة التي تمت إضافة 0.3 ٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10 -- 30 دقيقة.
  11. المقاطع في غسل العازلة TNT ؛ 3 مرات ، 10 دقيقة لكل منهما.
  12. ميكرولتر من 150 تطبيق عازلة TNB لكل شريحة ، والاحتفاظ بها في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة.
  13. إزالة الزائدة حل TNB الشرائح التي تميل.
  14. إضافة 150 ميكرولتر من محلول يحتوي على TNB البيروكسيداز - مترافق المضادة للأجسام المضادة البيوتين ، والشرائح تخزينها في غرفة رطبة لمدة 2 ساعة.
  15. المقاطع في غسل العازلة TNT ؛ 3 مرات ، 10 دقيقة لكل منهما.
  16. تطبيق 150 ميكرولتر من اليكسا 488 - مترافق حل tyramide العمل إلى شرائح وقطاعات احتضان لمدة 1 ساعة. وينبغي إعداد هذا الحل وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
  17. المقاطع في غسل العازلة TNT ؛ 3 مرات ، 10 دقيقة لكل منهما.
  18. إضافة 150 ميكرولتر من محلول هويشت (1:1000 العازلة في مادة تي ان تي) إلى أقسام والاحتفاظ بها في غرفة رطبة لمدة 2 دقيقة.
  19. غسل المقاطع في المخزن TNT ؛ 3 مرات ، 5 دقائق لكل منهما.
  20. أقسام ساترة مع مضان المتوسطة المتوافقة مع تركيب (على سبيل المثال ، أو إطالة Vectashield antifade).

7. ممثل النتائج

الشكل 1
الشكل 1 ، ونحن هنا تظهر النتائج التي تم الحصول عليها dFISH ممثل في الدماغ فينش حمار وحشي. وأظهرت photomicrographs الحصول عليها من nidopallium caudomedial (NCM) ، والتماثلية الطائر المغرد من القشرة السمعية الثدييات. والمهجنة أقسام الدماغ مع riboprobe biotinylated الموجهة ضد parvalbumin (A) ، وهو علامة لسكان شبه الخلايا العصبية المثبطة ، والتي تحمل علامات DIG ريبوالمسبار الموجهة ضد zenk نشاط الجينات التي تعتمد على (B) ، وهي علامة موثوق بها لأغنية يحركها الخلايا العصبية. C) تراكب من (أ) و (ب) يبين عدد السكان من الخلايا العصبية المثبطة التي يتم تفعيلها من خلال التجربة السمعية. السهام والنصال تشير الخلايا المسمى حصرا مع كل من riboprobes اثنين ، وتظهر الخلايا العصبية النجمية ممثل شارك في التعبير عن كل من المحاضر في المصالح. مقياس بار = 25 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدمنا هذا البروتوكول لدراسة كيفية تنظيم neurochemically وظيفيا في المخ الفقاريات ، وتحديد كيفية تأثير سلوكيا ذات الصلة المحفزات الحسية من آلات الجيني للخلايا العصبية في الدماغ البالغ 80-10. وقد استخدمنا هذا الأسلوب بنجاح في أنسجة المخ من الجرذان والفئران والطيور المغردة ، ولكن نتوقع أن هذا البروتوكول سوف تكون قابلة للتكيف بسهولة إلى أجزاء الدماغ التي تم الحصول عليها من مجموعة واسعة من الأنواع الفقارية ، وربما غير الأنسجة العصبية. وقد وردت تفاصيل الضوابط الرئيسية المطلوبة للحصول على نتائج موثوقة والأمثل إشارة نطاق واسع في أماكن أخرى في مجموعتنا 11 ، 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

العمل بدعم من المنح من المعاهد الوطنية للصحة / NIDCD ومؤسسة شميت لRP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DEPC VWR international IC15090225 toxic substance
PCR purification kit Qiagen 28104
Formaldehyde VWR international BDH0506-4LP toxic substance
T3 RNA polymerase Roche Group 11031163001
T7 RNA polymerase Roche Group 10881767001
Tris-HCl (1 M, pH 7.5) VWR international IC816124
MgCl2 (1 M) Sigma-Aldrich 449172
Spermidine (1 M) Sigma-Aldrich S0266
DIG RNA labeling mix Roche Group NC9380805
Biotin RNA labeling mix Roche Group NC9440104
RNasin Promega Corp. N2111
BSA Sigma-Aldrich 05491
DTT Sigma-Aldrich D5545
Sephadex G50 VWR international 95016-772
EDTA VWR international 101384-758
SDS Sigma-Aldrich L4390
Transfer (t)RNA Invitrogen 15401011
10X MOPS VWR international 14221-398 toxic substance
Paraformaldehyde VWR international AAAL04737-36 toxic substance
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S3139
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S3264
NaOH VWR international SX0600-1
Triethanolamine VWR international IC15216391
Acetic anhydride VWR international MK242002 toxic substance
SSPE VWR international 82021-488
Formamide VWR international JT4028-1 toxic substance
Poly A Invitrogen POLYA.GF
Mineral oil VWR international IC15169491
Chloroform VWR international BDH1109 organic solvent
Deionized formamide Sigma-Aldrich F9037 toxic substance
Hydrogen peroxide VWR international VW36901 toxic substance
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Triton X-100 JT Baker X198-05
Anti-DIG HRP Roche Group 11093274910
Anti-biotin peroxidase Vector Laboratories SP3010
TSA Alexa Fluor 594 Invitrogen T20935
TSA Alexa Fluor 488 Invitrogen T20932
H–chst VWR international 200025-538
Vectashield Vector Laboratories H-1000
embedding mold VWR international 15160-157
cryostat Leica Microsystems CM 1850
Superfrost plus slide VWR international 89033-052

Solutions

  1. Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
  2. Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
  3. TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
  4. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
  5. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
  6. Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
  7. Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jin, L., Lloyd, R. V. In situ hybridization: methods and applications. J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).
  2. Stoler, M. H. In situ hybridization. Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).
  3. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).
  4. Kessler, C. The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system. Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).
  5. Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts. Biotechniques. 18, 300-307 (1995).
  6. Qian, X., Lloyd, R. V. Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization. Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).
  7. Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds. Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).
  8. Pinaud, R. GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation. Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).
  9. Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. Co-induction of activity-dependent genes in songbirds. Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).
  10. Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression. J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).
  11. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
  12. Pinaud, R., Jeong, J. K. Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol. 611, 115-129 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats