成像蛋白质 - 蛋白质相互作用在体内

Biology
 

Summary

本协议描述了如何形象蛋白质相互作用使用基于FRET的接近检测。

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Seegar, T., Barton, W. Imaging Protein-protein Interactions in vivo. J. Vis. Exp. (44), e2149, doi:10.3791/2149 (2010).

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Abstract

蛋白质 - 蛋白质相互作用,是所有重要的细胞过程的一个标志。然而,许多这些互动是短暂的,或大力弱,防止他们的身份,并通过分析传统的生物化学方法,如免疫共沉淀。在这方面,已经彻底改变了基因encodable的荧光蛋白(GFP,RFP等)及其相关荧光光谱重叠,我们有能力监测在体内的弱相互作用,使用福斯特共振能量转移 ( FRET)1-3。在这里,我们详细介绍我们使用一个基于FRET的接近检测,监测上的内皮细胞表面的受体受体相互作用。

Protocol

该协议包括三个主要步骤。第一,一步一个哺乳动物表达载体的氨基端的CFP资格和/或YFP的单体版本将只简要地讨论你感兴趣的基因的克隆。第二和第三个步骤;载体DNA转成EA.hy926内皮细胞,并与FRET的共焦成像,在下文作更深入的概述。

1。 CFP和YFP嵌合受体的建设

感兴趣的受体被克隆氨基酸末端CFP和YFP单体的增强版本。 FRET的测定是经验性的,是严重依赖后,连接器之间的长度的跨膜跨越区域,并开始荧光 1 。因此,几个不同长度的连接器,必须探索新的受体对每个正在调查。

  1. 进入的pcDNA3.1吸湿R或含有单体C或YFP的(这可以从我们的实验室获得的矢量) ř载体,NheI / EcoRI位点克隆到您感兴趣的受体。 *注意:如果有必要,NheI包括SpeI和XbaI其他兼容的几个酶。
  2. 连接反应转换成适当的endA1 recA基因主管细胞系(我们经常使用MACH1)。其次DNA测序验证突变的情况下插入存在的屏幕殖民地。
  3. 取得成功的分子克隆构象后,准备在无菌水或使用Qiagen公司,或类似,DNA的试剂盒TE转染级的载体DNA。评估浓度和纯度,采用紫外光谱。典型的DNA产量应在100-200微克,这是常规稀释到1μg/μL的工作股票的范围。

2。 EA.hy 926细胞的转染

  1. 拆分成MatTek盖玻片(0号)2毫升培养基的35 mm培养皿EA.hy 926细胞,生长在完全DMEM培养液(DMEM培养液10%小牛血清+ Pen. /链球菌。) 。保守,你可以得到融合菜从15厘米〜15道菜(〜90%融合翌日)。准备一盘,以评估每一个人的受体的表达,以及一盘每个受体对。
  2. 允许细胞在5%的CO 2气氛孵育过夜在37 ° C 。翌日,文化应约70-90%汇合。
  3. 转天,准备nucleolipid络合物8μL的Fugene6预热OptiMEM 200μL混合嵌合受体的载体DNA(2μL),2微克。对于受体对,染(见下面的讨论),每个受体共2微克,1微克。
  4. 轻轻颠倒混合。
  5. 继续在室温下孵育30分钟。
  6. 在发病潜伏期间,准备转染的细胞。吸新鲜的媒体和每盘用温PBS冲洗,并简要地前增加2毫升不含抗生素的预热完全DMEM培养液(DMEM培养基+胎牛血清)。重要的是避免青霉素和链霉素的存在,因为它们与Fugene6治疗期间,相当多的细胞毒性。
  7. 添加复杂的细胞明智的下降和一个额外的20-24小时内孵化,在37 °彗星 5%的CO 2的气氛。
  8. 24小时后,小心吸媒体从细胞和吸管用抗生素新鲜完整的DMEM培养液。转染后,细胞存活率应保持比较高的,即应观察几乎无漂浮细胞。
  9. 基因表达是一个额外的转染后48-60小时后通常最大。然而,成像通常是可行的,在短短24小时。应为最佳的基因表达的时间当然实验。

3。共聚焦成像,FRET技术分析

活细胞成像的Leica TCS SP2 AOBS共聚焦激光扫描配备蓝色二极管(405纳米),氩气(458,476,488,514纳米)显微镜。氦氖绿(543纳米),橙色氦氖(594纳米),和红色的氦氖(633 nm)的激光器,一个HCX PI阿婆63x/1.3 NA甘油浸入式物镜,机动XY阶段(Märzhäuser),和环境控制(温度,湿度和CO 2)的阶段,孵化器(PeCon)。实验控制是至关重要的,以消除荧光基团之间的排放渠道,以及评估的表达问题和非特异性荧光基团的多聚串扰。因此,单个荧光团的转染是利用设立每一个形象会话。负的FR​​ET控制(使用已知的无相互作用的受体)将需要被执行,以确定背景的FRET的发生是由于过度表达。

  1. 为了消除CFP和YFP的排放渠道之间的串扰,将进入阶段孵化器的CFP的表达调控。使用白色的光,调整的Z板将重点放在细胞。
  2. SP设置窗口设置CFP排放检测到465-505 nm和YFP的525-600纳米。
  3. 同时监控的排放渠道,激发CFP的458纳米。 AOTF的使用,设置激光功率超过CFP YFP排放通道,以消除明显出血。保存该设置。
  4. 通过调整电源的激发下,在514 nm处表示只YFP的细胞执行在CFP通道YFP的串扰(使用YFP的表达调控)相同的控制。保存该设置。
  5. 未来的地方细胞共表达CFP和YFP进入阶段孵化器。使用徕卡共聚焦软件的序列设置,找到适当的膜定位表达CFP和YFP的水平相似。
  6. 使用徕卡软件受体光漂白程序,设置的供体和受体设置保存CFP和YFP设置,可敬。
  7. 放大到细胞,突出一个YFP的照片毁灭是发生在细胞膜,并开始计划的ROI(感兴趣区域)。
  8. 承兑人的照片销毁,调整的AOTF在514纳米至100%,并允许继续下去,直到YFP的排放量的70%已所剩无几的激光漂白。为了加快漂白,投资回报率通常选择在光栅的激光轴(X轴)。
  9. 在光漂白过程中,监测细胞的运动,并拒绝在XY平面明显运动中获得的测量,这些测量报告虚假的FRET效率。
  10. 前和后的漂白图像记录捐助国(CFP)和受体(YFP),FRET的效率计算公式为:FRET的效率 =(D - D 后前 )/ D转换 ,所有D后> ð前, 其中 D前和D 是漂白后分别捐助力度。
  11. JMP软件(SAS)是用来确定实验变异程度。

4。代表性的成果

转染效率通常在30至40%之间。尽管以前的研究结果被别人,我们还没有看到一个载体转染和表达,有利于其他。事实上,我们经常观察一个嵌合体荧光基团或其他专属的表达。典型的FRET受体系统的效率之间的不同。对于领带的受体系统,典型值是20-28%和19-23%的内皮细胞上皮细胞。对于阴性对照,典型的效率都低于2-3%。有经验的变异程度将大大降低。

图1
图1。转EA.hy 926细胞的代表图像 。)EA.hy 926细胞单层DIC的形象。二)(一)显示细胞的荧光图像。 c)覆盖(A)和(二)展示〜20%至30%的转染效率。

图2
图2。代表承兑人的照片漂白FRET CFP和YFP发生在EA.hy926细胞的分析。CFP排放通道(顶部面板)和YFP的发射通道(上下两板)分别进行了监测前,后受体漂白。漂白实验受到限制,和FRET技术的绿色方框内的区域,计算值。 FRET的效率是一个绝对的范围从高(红色- 1.0)低(紫色- 0.0)上一个CFP / YFP的放大叠加显示,合并方向的目的形象。

Discussion

有几个步骤是成功的关键。其中最突出的是两者之间的嵌合受体表达的相对水平。为了规避这个问题,可能使稳定的细胞系,表达利益蛋白,或确定载体DNA的最佳比例,允许相当于表达。同样,由于非均匀转跨菜,蛋白水平,很少会相当于细胞间。因此,一定要注意,“低”,以区别于“高”expressors。 ,显示“平均”的蛋白质含量通常会产生可靠和可重复性的FRET效率。我们的实验室一直奉行以减轻这个问题的方法之一是使用腺和lenti病毒“甚至是”基因的表达。此外,一个替代的方法来确定受体照片漂白FRET效率是致敏的排放。虽然,尽管敏排放实时监测单细胞的潜力,我们已经发现受体光漂白更敏感和更可靠。

最后,利用FRET技术来监测蛋白相互作用,可以是具有挑战性的的,需要谨慎选择的膜结合受体的链接长度。此外,除了C / YFP往往大大影响内质网和高尔基体蛋白表达水平的聚集和结果。然而,短暂的,不稳定的,互动的,FRET是理想的方法利用。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

我们要感谢共聚焦显微镜的帮助下,斯科特亨德森博士。这项研究是从美国国立卫生1RO1CA127501研究院的资助,以WAB的目标,以及来自梅西癌症中心和医学院(VCU),WAB的显微镜,在VCU - DEPT试点项目的资金支持。神经生物学及显微解剖设施,支持,从NIHNINDS中心核心授予5P30NS047463资金中的一部分,。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11960-069
Penicillin- Streptomycin Invitrogen 15070-063
Fetal Bovine Serum Hyclone N/A
Opti-MEM Invitrogen 11058-021
FUGENE 6 Roche Group 11814443001
Coverslip Dishes MatTek Corp. P35G014C
pcDNA3.1(+) Invitrogen V790‐20
Mach 1 Competent Cells Invitrogen C862003

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References

  1. Kim, M., Carman, C. V., Springer, T. A. Bidirectional transmembrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins. Science. 301, 1720-1725 (2003).
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  3. Seegar, T. C. M., Eller, B., Tzvetkova-Robev, D., Kolev, M., Henderson, S. C., Nikolov, D. B., Barton, W. A. Tie1-Tie2 interactions mediate functional differences between angiopoietin ligands. Molecular Cell. 37, (5), 643-655 (2010).
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