免疫不全マウスにおける髄芽腫細胞の頭蓋内同所Allografting

Neuroscience

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Summary

このプロトコルは、二次髄芽腫を開始するために、マウスの髄芽腫の組織の分離と解離を説明し、免疫不全レシピエントマウスに腫瘍細胞のallograftingそれに続く。

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Huang, X., Sarangi, A., Ketova, T., Litingtung, Y., Cooper, M. K., Chiang, C. Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice. J. Vis. Exp. (44), e2153, doi:10.3791/2153 (2010).

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Abstract

髄芽腫は神経系の最も一般的な小児腫瘍です。動物実験の大きな体は、髄芽腫1-4の細胞の起源としての小脳顆粒神経前駆細胞(CGNPs)に焦点を当てている。しかし、ヒトの患者(、結節性線維形成性、古典的および大細胞/未分化)の髄芽腫のサブタイプの多様な臨床症状、および髄芽腫はCGNPマーカー5のない異所性発現と人間の患者のサブセットで発見されているという事実は、ことを示唆している髄芽腫の細胞および分子の起源は、より複雑で、はるかに完全に解読されているからです。したがって、それはどの細胞型に特異的な治療法を開発することができますに基づいて、別の髄芽腫の腫瘍細胞の起源があるかどうかを判断するために不可欠です。この目的のために、受信者の二次腫瘍の開発のその後の分析に続いて遺伝的にマークされた腫瘍細胞のタイプのallografting頭蓋内同所では、腫瘍開始細胞の細胞起源を決定することができるようになります。ここでは、頭蓋内原発腫瘍組織に由来する髄芽腫細胞のallografting同所性、および、この手順のための実験プロトコルを記述するも、確立された細胞株からの細胞を移植するために使用することができます。

Protocol

1。担癌小脳および腫瘍組織の解離の顕微解剖

  1. 腫瘍組織の検索
    1. 髄芽腫をもつ病気のマウスは、しばしばrunted、および水頭症と後部麻痺と覆さときに姿勢を取り戻すために、障害を含む典型的な神経症状を、表示されています。腫瘍組織を取得するには、二酸化炭素の吸入によりマウスを安楽死させる。それは頚椎脱臼、後頭骨に圧力を発生し、腫瘍組織の整合性が損なわれる可能性が手順を実行しないようimporantです。
    2. 断頭は、頭蓋骨の良い可視化のために髪と筋肉組織を可能な限り除去し、はさみを使って死の直後に実行されます。 95%エタノールを浸したキムワイプで頭蓋骨の表面を清掃してください。
    3. 頭蓋骨の正中線に沿って開口部を切断し、その時点で腫瘍のある小脳を含めた脳全体が露出している、細かいピンセットを使って頭蓋骨の組織を除去するために微細なハサミを使用してください。
    4. 健康な成人の小脳は、明確に定義された半球と虫部を表示しながら、担癌マウスの小脳では、多​​くの場合、滑らかな表面と顕著な血管を持つアモルファス拡大です。無菌技術を用いて、緩衝生理食塩水氷冷リン酸塩でピンセットと場所を使用して、小脳の腫瘍を取り出す(PBS)のMg 2なし+及びCa 2 +。

注:すべての測定器は使用前にオートクレーブ処理95%エタノールと水蒸気で消毒されています。

  1. 腫瘍組織の解離
    1. PBSから腫瘍組織の約4倍の体積が50%のAccutase(PBSで希釈)に腫瘍組織を転送、37℃でインキュベーションに続いて、室温で3分間細かいハサミで組織をミンチ℃で4分間、そのあと組織は、さらに3分間1 mLのPipetmanで反復的なペッティングを受ける。このメソッドは、単一細胞と小さな細胞の集合体の混合物を生成する必要があります。
    2. PBSと1000xgでペレットに5分間遠心し、細胞と細胞懸濁液3倍に希釈する。 (上記の手順は、Joveのはマスコミで、"髄芽腫の幹細胞の分離、濃縮とメンテナンス"に記載されている)

グルタミン、ペニシリン - ストレプトマイシン、N2、B27、ヒトEGF(25 ng / ml)および塩基性FGF(25 ng / mL)をしてNeurobasal媒質で構成される作りたての神経幹細胞の培地中で細胞ペレットを再懸濁します。ソリューションの細胞密度を計算すると1つの滅菌ベベル先端10μLシリンジに、解離の腫瘍細胞の適切な数、例えば5 × 5と溶液4μLをロードできるように追加の神経幹細胞の培地に適切な更なる希釈を行う。接種する細胞の正確な数は、特定の実験的な要件に応じて研究者によって決定されるべきである。氷の上にミニ200μLマイクロ遠心チューブ(PCRチューブ)の細胞溶液を保管してください。

2。レシピエントマウスのための麻酔の手順

外科手術の場合は、齧歯類の手術専用の消毒領域はプロシージャの実行中に必要です。理想的には、動物の準備、営業分野と動物の回復のため、独立しているが、隣接地域で長いベンチを設定。手術用手袋ではなく、試験の手袋は、手術のために必要とされています。無菌操作は、腰の上に手袋をはめた手を保持することにより維持し、乾燥した無菌面から無菌オブジェクトを処理するためにのみ使用されます。

  1. ケタミン(マウスの体重1kg当たり100mgのケタミン)とキシラジン(マウスの体重1kg当たり10mgのキシラジン)の混合物を麻酔に使用されます。麻酔薬の腹腔内に投与する。
  2. それは一般的に麻酔薬が完全に有効にするために、3〜5分かかります。マウスがつま先/テールピンチで完全に麻酔があるかどうか判別します。マウスの眼に眼軟膏の少量を置きます。常にマウスが正常に呼吸していることを確認する監視、動作領域に完全に麻酔マウスをもたらす。

3。腫瘍細胞のグラフト頭蓋内

  1. 中脳と小脳の上に後部頭蓋骨を明らかにするために、バリカンを使用して、マウスの背側後部頭部を剃る。
  2. アルコールパッドで拭いてその後に綿の先端のアプリケーターを、使用して公開頭皮上Betadineソリューションを適用します。これら二つの殺菌のステップを2回繰り返します。
  3. 滅菌メスを用いて後方頭皮の4分の1インチの切開を加えます。右〜0.5mm穿頭孔2mmと滅菌歯科用ドリルを使用してラムダに後方2 mmのドリル。
  4. フレームのホールドにその歯をフックすることで定位のフレームの上にマウスを置きます。慎重に下るとバリ穴への腫瘍細胞の溶液4μLをロードベベル先端が10μLシリンジを置きます。 syriのベベル一度ゲイン誤差の針は、頭蓋骨の表面の下にある、別の3 mmの下降と、0.5 mmの登る。ゆっくりと受信者の小脳に、30秒のタイムフレームで安定した力で、腫瘍細胞の所望量を注入する。追加の2分間の注入が完了した後にその場所に針を残す。その後、注射針とシリンジを取り外します。 autoclipを使用して傷をクリップ。
  5. その体温を維持するために手術後の温暖化の毛布の上にマウスをおいてください。モビリティと呼吸パターンが連続して観察される。マウスは、麻酔から回復すれば、滅菌住宅のケージに戻して置きます。食料と水の摂取量、行動、毛づくろい、そして目の赤の染色のために毎日監視する。切開部位での感染の兆候を検査する。 7日後の手術でオートクリップを取り外します。
    2-6ヶ月の平均のためのマウスを維持し、さらなる研究のために典型的な髄芽腫の症状を表示し、それらを生け贄に捧げる。

4。代表的な結果

レシピエントマウスで開発された二次髄芽腫は、非常に原発性腫瘍のそれと類似していた。全体のマウントとして見たとき、二次腫瘍を有する小脳は、しばしば明白な異所性血管によるアモルファス、拡大された。二次腫瘍組織の免疫組織化学的解析は、腫瘍細胞は、発現する強力なSmoM2 - YFPなどMath1のとPax6などの小脳顆粒神経前駆細胞のマーカー非常に増殖していることを明らかにした。解離と報告された方法を("髄芽腫の幹細胞の分離、濃縮とメンテナンス"、印刷中のJove)を使用して培養、二次髄芽腫の腫瘍細胞が急速に拡大することができるときは、速達、複数の幹細胞マーカー、クローン原性であり、さらに、腫瘍形成を開始することができます。追加の免疫不全レシピエントに移植。

図1
図1。典型的なホールマウントおよび二次髄芽腫の組織の断面
二次髄芽腫の組織の典型的な例は、5 × 10 5プライマリ腫瘍細胞の注射後26日間に開発。ヘマトキシリン​​染色は、高い核/細胞質比および核の多型を含む、髄芽腫の典型的な細胞形態を、明らかに。 Ki67の発現によって示されるようにこれらの二次性腫瘍細胞は高度に増殖され、彼らはまた、確実にSmoM2 - YFP膜発現する。

図2
図2。二次髄芽腫の細胞を培養し、 試験管内で展開することができる
初代マウス髄芽腫細胞("分離、濃縮と髄芽腫の幹細胞の維持"、印刷中のJove)のために記述されたプロトコルを使用して、これらの二次髄芽腫の細胞を培養し、複数の通路を拡張することができます。写真は4日と14日で培養同じ代表の腫瘍のコロニーを示しています。培養腫瘍細胞は、わずかな細胞質と細胞の集合体の高密度コアから頻繁に放射すると伸長バイポーラ、です。彼らは成長の接触阻害を示さない。小さな丸い細胞が赤血球です。

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Discussion

その収量二次腫瘍の形成をallografting成功した髄芽腫の細胞を確保するためにいくつかの重要な要因は以下の通りである:まず、組織解離のためのわずか50%のAccutaseを使用し、長時間の酵素処理は細胞の生存率の大幅な削減につながるとして、組織を過剰に消化しないでください。小さなヒントでも解離細胞への物理的な損傷を生成することができるとしても、わずか1 mLサイズのPipetmanを使用してください。それはallograftingのための単一細胞や小さな凝集体の混合物を持ってするのは良いことです。第二に、ハミルトンシリンジをロードする前に混合し、腫瘍細胞溶液を毎回平衡化します。大きなボリュームが多すぎる頭蓋内圧と抵抗を生成するように各注射のために以上の4μLを使用しないでください。最後に、注入溶液が各注入後の小脳組織に放散させるために追加の2分間を待つことが重要です。

手順は、腫瘍を開始し、伝播することができる遺伝的にマークされたセルのタイプ(S)の測定を可能にするここで説明する。このプロトコルはまた、注入する細胞は原発腫瘍組織から直接派生していない状況に適用されますが、確立された培養細胞株から。一つは、酵素消化および/または反復的なピペッティングのいずれかの方法で適切な数の細胞を準備し、本プロトコールのステップ2から始めることができます。したがって、我々はまた、候補遺伝子の機能及びin vivoでの腫瘍成長の読み出しある化合物の阻害効果をテストすることができます。

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Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgments

この研究は、ヴァンダービルト - イングラムがんセンターサポート助成金(P30 CA068485)、小児脳腫瘍財団と米国立衛生研究所(NS042205)からの補助金によって支えられている。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal medium Invitrogen 21103049
hEGF Invitrogen PHG0311 25ng/ml
bFGF Invitrogen PHG0023 25ng/ml
N2 Invitrogen 17502048 1X
B27(-RA) Invitrogen 12587010 1X
Accutase Invitrogen A1110501 50%
Glutamine Invitrogen 25030081 2mM
Stereotaxic instrument Stoelting Co. 51730
Foredom flexible shaft drill, hang-up style Stoelting Co. 58650
Large probe holder Stoelting Co. 51633
10 μL syringe, 26 ga., bevel tip Stoelting Co. 51105
Drill bit .75mm Stoelting Co. 51455-3

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References

  1. Schuller, U. Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma. Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).
  2. Yang, Z. J. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
  3. Kessler, J. D. N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma. Genes Dev. 23, 157-170 (2009).
  4. Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
  5. Salsano, E. Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1. Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).

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