Immunocompromised चूहे में intracranial medulloblastoma कक्ष के Orthotopic Allografting

Neuroscience

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Summary

इस प्रोटोकॉल अलगाव और माउस medulloblastoma ऊतक के पृथक्करण का वर्णन है, और immunocompromised प्राप्तकर्ता चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के बाद allografting क्रम में माध्यमिक medulloblastoma आरंभ.

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Huang, X., Sarangi, A., Ketova, T., Litingtung, Y., Cooper, M. K., Chiang, C. Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice. J. Vis. Exp. (44), e2153, doi:10.3791/2153 (2010).

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Abstract

Medulloblastoma तंत्रिका तंत्र की सबसे आम बाल चिकित्सा ट्यूमर है. जानवरों के अध्ययन का एक बड़ा शरीर 1-4 medulloblastoma के लिए सेल के मूल के रूप में अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन व्यापारियों (CGNPs) पर ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि, मानव (गांठदार, desmoplastic, शास्त्रीय और बड़े / सेल anaplastic) रोगियों, और तथ्य यह है कि medulloblastoma CGNP 5 मार्कर का कोई अस्थानिक अभिव्यक्ति के साथ मानव रोगियों के एक सबसेट में पाया जाता है, में medulloblastoma subtypes के विविध नैदानिक ​​प्रस्तुतियों सुझाव है कि medulloblastoma के सेलुलर और आणविक मूल और अधिक जटिल और पूरी तरह से deciphered किया जा रहा से दूर कर रहे हैं. इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक है कि क्या वहाँ एक वैकल्पिक medulloblastoma ट्यूमर कोशिका के मूल सेल प्रकार जो विशिष्ट उपचारात्मक साधन विकसित किया जा सकता है आधारित है. यह अंत करने के लिए, आनुवंशिक चिह्नित ट्यूमर कोशिका प्रकार प्राप्तकर्ताओं में माध्यमिक ट्यूमर के विकास के बाद के विश्लेषण के द्वारा पीछा किया intracranial allografting orthotopic ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं के सेलुलर मूल के निर्धारण की अनुमति देगा. यहाँ हम intracranial medulloblastoma प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों से निकाली गई कोशिकाओं के allografting orthotopic के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और इस प्रक्रिया को भी स्थापित सेल लाइनों से कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

1. ट्यूमर असर सेरिबैलम और ट्यूमर ऊतक के पृथक्करण के लघु विच्छेदन

  1. ट्यूमर ऊतक के रिट्रीवल
    1. बीमार medulloblastoma असर चूहों अक्सर runted हैं और hydrocephaly और पीछे पक्षाघात और जब पलट मुद्रा हासिल विफलता सहित विशिष्ट स्नायविक लक्षण, प्रदर्शन. ट्यूमर ऊतक पुनः प्राप्त करने के लिए, कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना द्वारा चूहों euthanize. यह imporant ग्रीवा अव्यवस्था, एक प्रक्रिया है कि पीछे खोपड़ी के लिए दबाव उत्पन्न करता है और ट्यूमर के ऊतक की अखंडता समझौता कर सकते हैं प्रदर्शन नहीं है.
    2. शिरच्छेद कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर मौत के बाद तुरंत किया जाता है, अच्छा दृश्य के लिए खोपड़ी के बाल और मांसपेशियों के ऊतकों जितना संभव को हटाने. 95% इथेनॉल के साथ भिगो Kimwipe साथ खोपड़ी की सतह को साफ करें.
    3. ठीक कैंची का उपयोग करने के लिए खोपड़ी के midline साथ एक खोलने में कटौती, और खोपड़ी ठीक चिमटी का उपयोग कर, जो बिंदु पर ट्यूमर असर सेरिबैलम सहित पूरे दिमाग उजागर ऊतक निकालने.
    4. जबकि स्वस्थ वयस्कों के cerebella अच्छी तरह से परिभाषित गोलार्द्धों और vermis प्रदर्शन, ट्यूमर असर चूहों के cerebella अक्सर बढ़े, एक चिकनी सतह और विशिष्ट रक्त वाहिकाओं के साथ आकारहीन. बाँझ तकनीकों का प्रयोग, अनुमस्तिष्क ट्यूमर ठंडा फॉस्फेट में चिमटी और जगह का उपयोग पुनर्प्राप्त 2 मिलीग्राम बिना buffered खारा (पीबीएस) + और ​​सीए 2 +.

नोट: सभी उपकरणों को 95% इथेनॉल और भाप का उपयोग करने से पहले autoclaved में विसंक्रमित कर रहे हैं.

  1. ट्यूमर ऊतक की हदबंदी
    1. पीबीएस से 50% (पीबीएस में पतला) Accutase कि ट्यूमर ऊतक की मात्रा के बारे में 4 बार है ट्यूमर ऊतक स्थानांतरण, 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए ठीक कैंची, 37 पर ऊष्मायन द्वारा पीछा ° C के साथ ऊतक कीमा , जिसके बाद ऊतक के साथ एक 1-एमएल Pipetman एक अतिरिक्त 3 मिनट के लिए दोहरावदार pipeting आए. इस विधि एकल कक्षों और छोटे सेलुलर समुच्चय का एक मिश्रण की उपज चाहिए.
    2. सेलुलर पीबीएस और 1000xg पर गोली कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के साथ 3 गुना निलंबन पतला. (ऊपर प्रक्रियाओं "अलगाव, और medulloblastoma स्टेम कोशिकाओं के संवर्धन और रखरखाव" में वर्णित किया गया है, प्रेस में जौव )

हौसले से तैयार तंत्रिका स्टेम सेल glutamine, पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन, N2, B27, मानव EGF (25 एनजी / एमएल) और बुनियादी FGF (25 एनजी / एमएल) के साथ Neurobasal माध्यम से मिलकर मध्यम में सेल गोली Resuspend. समाधान का सेल घनत्व की गणना और अतिरिक्त तंत्रिका स्टेम सेल जैसे कि एक अलग ट्यूमर कोशिकाओं के एक उचित संख्या, 5x10 5 जैसे के साथ एक बाँझ बेवल इत्तला दे दी 10μL सिरिंज में समाधान के 4 μL लोड कर सकते हैं मध्यम के साथ उचित आगे dilutions. कक्षों की सही संख्या inoculated होना विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार अनुसंधानकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए. एक मिनी 200μL microcentrifuge ट्यूब में सेल समाधान (पीसीआर ट्यूब) बर्फ पर रखें.

2. प्राप्तकर्ता चूहे के लिए संवेदनाहारी प्रक्रियाएं

शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के लिए है, एक कीटाणुरहित कृंतक सर्जरी के लिए समर्पित क्षेत्र प्रक्रिया की अवधि के लिए की जरूरत है. आदर्श रूप में, पशु तैयारी, ऑपरेटिंग क्षेत्र और जानवरों की वसूली के लिए अलग - अलग, लेकिन आसपास के क्षेत्रों के साथ एक लंबी बेंच की स्थापना. सर्जिकल दस्ताने, दस्ताने परीक्षा नहीं, शल्य चिकित्सा के लिए आवश्यक हैं. सड़न रोकनेवाला तकनीक कमर से ऊपर gloved हाथों पकड़े द्वारा बनाए रखा है और केवल इस्तेमाल करने के लिए एक सूखी बाँझ सतह से बाँझ वस्तुओं को संभाल.

  1. (माउस के वजन के 1 किलोग्राम प्रति 100 मिलीग्राम ketamine) ketamine और xylazine (माउस के वजन के 1 किलोग्राम प्रति 10 मिलीग्राम xylazine) का एक मिश्रण संज्ञाहरण के लिए प्रयोग किया जाता है. Anesthetics intraperitoneally प्रशासन.
  2. यह आम तौर पर anesthetics के लिए 3-5 मिनट लगते हैं करने के लिए पूरा प्रभाव ले. निर्धारित करें कि क्या एक चूहे पूरी तरह से पैर की अंगुली / पूंछ चुटकी द्वारा anesthetized है. माउस की आँखों पर एक नेत्र मरहम की एक छोटी राशि प्लेस. ऑपरेटिंग क्षेत्र में पूरी तरह से anesthetized माउस ले आओ, लगातार यकीन है कि माउस सामान्य रूप से साँस ले रहा है बनाने की निगरानी.

3. Intracranial ट्यूमर कोशिकाओं की कलम बांधने का काम

  1. पृष्ठीय माउस के पीछे सिर क्षेत्र, एक बाल क्लिपर का उपयोग midbrain और सेरिबैलम ऊपर पीछे खोपड़ी प्रकट दाढ़ी.
  2. उजागर एक कपास टिप applicator, एक शराब पैड के साथ पोंछते द्वारा पीछा का उपयोग खोपड़ी पर Betadine समाधान लागू. इन दो स्टरलाइज़ कदम दो बार दोहराएँ.
  3. पीछे एक निष्फल स्केलपेल का उपयोग खोपड़ी में एक चौथाई इंच चीरा बनाओ. ड्रिल एक 0.5 मिमी गड़गड़ाहट छेद सही करने के लिए 2 मिमी और 2 मिमी लैम्ब्डा एक बाँझ दंत ड्रिल का उपयोग करने के लिए पीछे.
  4. एक stereotactic फ्रेम पर फ्रेम पकड़ पर अपना incisors hooking द्वारा माउस रखें. ध्यान से उतर और बेवेल इत्तला दे दी 10 μL गड़गड़ाहट छेद में ट्यूमर सेल समाधान के 4 μL के साथ भरी हुई सिरिंज स्थिति. एक बार Syri के बेवलnge सुई खोपड़ी की सतह के नीचे है, एक और 3 मिमी के लिए उतरना और फिर 0.5 मिमी के लिए चढ़ना. धीरे धीरे ट्यूमर कोशिकाओं के वांछित राशि इंजेक्षन करने के लिए, एक 30 सेकंड समय सीमा में एक स्थिर शक्ति के साथ, प्राप्तकर्ता के सेरिबैलम में. अपनी जगह में एक अतिरिक्त दो मिनट के लिए इंजेक्शन के पूरा होने के बाद सुई छोड़ दें. तब सुई और सिरिंज को हटा दें. एक घाव का उपयोग autoclip क्लिप.
  5. सर्जरी के बाद एक वार्मिंग कंबल पर माउस रखें अपने शरीर का तापमान बनाए रखने में मदद. गतिशीलता और श्वसन पैटर्न लगातार मनाया जाएगा. एक बार माउस संज्ञाहरण से ठीक है, यह एक बाँझ आवास पिंजरे में वापस जगह है. दैनिक भोजन और पानी का सेवन, व्यवहार, सौंदर्य, और आंखों का लाल धुंधला के लिए मॉनिटर. चीरा साइट पर संक्रमण के लक्षण के लिए निरीक्षण. दिन 7 के बाद सर्जरी पर autoclips निकालें.
    2-6 महीने की एक औसत के लिए चूहों को बनाए रखें और आगे के अध्ययन के लिए ठेठ medulloblastoma के लक्षण प्रदर्शित लोगों के बलिदान.

4. प्रतिनिधि परिणाम

माध्यमिक प्राप्तकर्ता चूहों में विकसित medulloblastomas उच्च प्राथमिक ट्यूमर के उन जैसे लगते थे. माध्यमिक ट्यूमर असर cerebella अक्सर बढ़े, अस्थानिक रक्त वाहिकाओं स्पष्ट के साथ अनाकार थे जब पूरे आरोह के रूप में देखा. माध्यमिक ट्यूमर ऊतक के immunohistochemical विश्लेषण से पता चला कि ट्यूमर कोशिकाओं को अत्यधिक proliferative हैं, व्यक्त मजबूत SmoM2 YFP और Math1 और Pax6 जैसे अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन व्यापारियों के मार्करों. जब dissociated और सुसंस्कृत का उपयोग कर रिपोर्ट तरीकों ("अलगाव, संवर्धन, और medulloblastoma स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव", प्रेस में जौव), माध्यमिक medulloblastoma ट्यूमर कोशिकाओं तेजी से विस्तार किया जा सकता है, व्यक्त एकाधिक स्टेम सेल मार्कर, clonogenic कर रहे हैं और आगे ट्यूमर गठन आरंभ कर सकते हैं जब अतिरिक्त immunocompromised प्राप्तकर्ताओं में प्रतिरोपित.

चित्रा 1
चित्रा 1. ठेठ पूरे माउंट और एक माध्यमिक medulloblastoma ऊतक के अनुभागीय दृश्य
माध्यमिक medulloblastoma ऊतक के एक विशिष्ट उदाहरण के 26 दिनों 5x10 5 प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद विकसित की है . Hematoxylin धुंधला medulloblastoma की विशिष्ट सेलुलर आकारिकी पता चलता है उच्च / परमाणु cytoplasmic अनुपात और परमाणु बहुरूपता सहित. इन माध्यमिक ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में अत्यधिक proliferative हैं Ki67 अभिव्यक्ति ने संकेत दिया है और वे भी robustly झिल्लीदार SmoM2-YFP व्यक्त.

चित्रा 2
चित्रा 2. माध्यमिक medulloblastoma कोशिकाओं और संवर्धित किया जा सकता है इन विट्रो में विस्तार
प्राथमिक माउस medulloblastoma कोशिकाओं ("अलगाव, संवर्धन, और medulloblastoma स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव", प्रेस में जौव) के लिए में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, इन माध्यमिक medulloblastoma कोशिकाओं और सुसंस्कृत हो सकता है कई मार्ग के लिए विस्तार. चित्र 4 दिन और 14 दिन में एक ही प्रतिनिधि ट्यूमर सुसंस्कृत कॉलोनी से पता चलता है. सभ्य ट्यूमर कोशिकाओं द्विध्रुवी, अल्प और सेलुलर कुल एक घने कोर से अक्सर विकीर्ण cytoplasm के साथ लम्बी हैं. वे वृद्धि संपर्क निषेध प्रदर्शन नहीं करते हैं. छोटे गोल कोशिकाओं लाल रक्त कोशिकाओं रहे हैं.

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Discussion

कई महत्वपूर्ण कारकों सफल medulloblastoma सेल allografting है कि पैदावार माध्यमिक ट्यूमर गठन निम्नानुसार हैं सुनिश्चित: पहले, ऊतक हदबंदी के लिए केवल 50% Accutase का उपयोग करें और ऊतकों से अधिक को पचाने के रूप में लंबे समय तक एंजाइम उपचार सेल व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण कमी की ओर जाता है है नहीं है. इसके अलावा केवल 1 एमएल आकार Pipetman का उपयोग छोटे सुझावों के रूप में भी अलग कोशिकाओं को शारीरिक क्षति उत्पन्न कर सकते हैं. यह ठीक है allografting के लिए एकल और कोशिकाओं छोटे समुच्चय का एक मिश्रण है. दूसरा मिश्रण है, और हैमिल्टन सिरिंज को लोड करने से पहले ट्यूमर कोशिका समाधान हर बार संतुलित. प्रत्येक इंजेक्शन के लिए अधिक से अधिक 4 μL उपयोग के रूप में एक बड़ी मात्रा बहुत ज्यादा intracranial दबाव और प्रतिरोध उत्पन्न होता मत करो. अंतिम, यह महत्वपूर्ण है के लिए एक अतिरिक्त 2 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए इंजेक्शन समाधान प्रत्येक इंजेक्शन के बाद अनुमस्तिष्क ऊतक में फैलने.

यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं आनुवंशिक चिह्नित सेल प्रकार (ओं) के दृढ़ संकल्प है कि शुरू करने और ट्यूमर का प्रचार कर सकते हैं के लिए अनुमति देते हैं. इस प्रोटोकॉल स्थितियों जहां इंजेक्शन जा कोशिकाओं प्राथमिक ट्यूमर ऊतक से सीधे प्राप्त नहीं कर रहे हैं के लिए भी लागू होता है, लेकिन स्थापित सभ्य सेल लाइनों से. एक कक्षों की उपयुक्त संख्या या तो एंजाइम पाचन और / या दोहराव pipetting द्वारा तैयार कर सकते हैं, और इस प्रोटोकॉल के चरण 2 से शुरू करते हैं. इसलिए, हम भी उम्मीदवार जीनों के कार्यों और vivo में readout ट्यूमर विकास में एक के साथ रासायनिक यौगिकों के निरोधात्मक प्रभाव का परीक्षण कर सकते हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस अध्ययन Vanderbilt-Ingram कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (CA068485 p30), बचपन ब्रेन ट्यूमर फाउंडेशन और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NS042205) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal medium Invitrogen 21103049
hEGF Invitrogen PHG0311 25ng/ml
bFGF Invitrogen PHG0023 25ng/ml
N2 Invitrogen 17502048 1X
B27(-RA) Invitrogen 12587010 1X
Accutase Invitrogen A1110501 50%
Glutamine Invitrogen 25030081 2mM
Stereotaxic instrument Stoelting Co. 51730
Foredom flexible shaft drill, hang-up style Stoelting Co. 58650
Large probe holder Stoelting Co. 51633
10 μL syringe, 26 ga., bevel tip Stoelting Co. 51105
Drill bit .75mm Stoelting Co. 51455-3

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References

  1. Schuller, U. Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma. Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).
  2. Yang, Z. J. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
  3. Kessler, J. D. N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma. Genes Dev. 23, 157-170 (2009).
  4. Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
  5. Salsano, E. Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1. Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).

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