Синий Родные электрофореза в полиакриламидном геле (BN-PAGE) для анализа Multiprotein Комплексы из ячеистого Лизаты

* These authors contributed equally
Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

В этом видео мы описываем характеристики multiprotein комплексов (ПДК) синим родной электрофореза в полиакриламидном геле (БН-PAGE). В первом измерении, диализовали сотовой лизатов разделены БН-PAGE для идентификации отдельных ПДК. В втором измерении SDS-PAGE, ПДК интерес в свою очередь подразделяются для анализа своих избирателей с помощью метода иммуноблоттинга.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multiprotein комплексов (ПДК) играют важную роль в клеточной сигнализации, так как большинство белков может быть найден в функциональном или нормативных комплексов с другими белками (Сали, Glaeser и соавт. 2003). Таким образом, исследования белок-белковых взаимодействий сетей требует детальной характеристики ПДК, чтобы получить понимание интегративной функции белка и регулирования. Для идентификации и анализа, ПДК должны быть разделены по родной условиях. В этом видео мы описываем анализ ПДК синим родной электрофореза в полиакриламидном геле (БН-PAGE). БН-страница представляет собой метод, который позволяет разделение ПДК в нативной конформации с высоким разрешением, чем предлагаемые гель-фильтрации или центрифугирования плотности сахарозы, и поэтому полезен для определения ПДК размер, состав и относительное изобилие (Schägger и фон Jagow 1991) ; (Schägger, Крамер и др., 1994.). С помощью этого метода, белки разделяются в зависимости от их гидродинамические размеры и форму в полиакриламидном матрицы. Здесь мы демонстрируем анализ ПДК от общего числа сотовых лизатов, указывая, что лизат диализ решающий шаг, чтобы сделать БН-СТРАНИЦА, применимых к этим биологическим образцам. Используя комбинацию первого измерения БН-и второе измерение SDS-PAGE, мы покажем, что ПДК, разделенных БН-страница может быть далее подразделены на их отдельных компонентов на SDS-PAGE. Визуализация компонентов ПДК на гель разделение осуществляется стандартным иммуноблоттинга. В качестве примера для MPC анализа БН-страницу, мы выбрали хорошо известных эукариотических 19S, 20S, 26S и протеасом.

Protocol

** Это видео протокол основан на связанный публикации 1: Голубые Родные электрофореза в полиакриламидном геле (BN-PAGE) для идентификации и анализа Multiprotein комплексов. Махима Свами, Габриэль М. Siegers, Susana Minguet, Бернд Wollscheid и Вольфганг WA Schamel. STKE Науки 2006 (345): pl2 25 июля 2006 года [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть эту публикацию .

1. Подготовка диализу лизат ячейки

  1. Урожай 10х10 6 клеток и гранул центрифугированием при 350g в течение 5 мин при 4 ° C.
  2. Промыть осадок клеток в три раза с 1 мл ледяной PBS (рецепт 1), центрифуги, как в пункте 1.1.
  3. Ресуспендируют осадок в 250 мкл ледяной БН-лизирующего буфера (рецепт 2) и инкубировать на льду в течение 15 мин.
  4. Центрифуга при 13000 г в течение 15 мин при 4 ° С для удаления нерастворимого материала.
  5. Растопить отверстие в крышке 1,5-мл микроцентрифужных трубки использованием подогревом большой стороны диаметр пипетки Пастера, затем поместите трубку на лед для охлаждения до 4 ° C.
  6. Передача супернатант с шага в 1,4 охлажденной трубки с отверстием в крышке.
  7. Место диализных мембран (молекулярная масса отсечки 10 кДа) щипцами сверху открыл трубу, закройте крышку, и отсек избыток мембран диализа, что торчит.
  8. Уплотнение крышки на стороне тщательно парафильмом.
  9. Обратить труб и центрифуги вверх дном на минимальной скорости возможно в 50-мл конические пробирки в центрифугу культуре клеток в течение 10 сек при 4 ° C. Удалить перевернутая трубка из центрифуги с помощью пинцета, чтобы избежать превращения стороне трубки право.
  10. Подготовка 100-мл стакан с холодной диализа БН-буфера (рецепт 3) и мешалки. Используйте как минимум 10 мл БН-диализа Буфер на 100-мкл образца.
  11. Прикрепите трубку с лентой вверх-вниз внутри стакана, и удалить пузырьки воздуха из отверстия под крышкой использованием изогнутых пипетки Пастера.
  12. Место стакан поверх магнит мешалки, включите мешалку и оставить на 6 часов или на ночь в холодной комнате. Проверьте иногда, чтобы обеспечить перемешивание не создавая воздушных пузырей на диализе мембраны.
  13. Сбор диализу лизат ячейки в новой охлажденной трубки микроцентрифужных.

2. Заливка БН-гели

  1. Градиент заливки геля происходит при комнатной температуре с градиентом смесителя. Перчатки необходимо надевать, потому полиакриламидном очень нейротоксическое. Избегайте контактов с SDS.
  2. Место градиент миксером на мешалки и приложите его к кусок гибкого шланга. Закрыть канал с помощью клапана и закройте трубки с зажимом. Место магнитной мешалкой 15% в "высокий" цилиндр связан с трубкой.
  3. Тема гибкий шланг в peristalitic насоса и присоединить иглу шприца до конца. Затем поместите иглу между двумя стеклянными пластинами гель аппарата.
  4. Подготовка 4% (рецепт 5) и 15% (рецепт 6) разделения гель решения, добавив, APS и TEMED непосредственно перед употреблением. Комбинированный объемов должен быть равен объему разделения гель.
  5. Залить этим гелем решения в соответствующие цилиндры градиент микшера (4% в "низкий" и 15% в "высокий" цилиндр).
  6. Откройте клапан и вытеснить пузырьки воздуха внутри канала, соединяющего два водохранилища гель, нажав на левую цилиндр с большим пальцем.
  7. Включите магнитной мешалкой, снимите зажим, и включить насос peristalitic по 5 мл в минуту. Разрешить гель медленно потока между стеклянными пластинами. Убедитесь, что игла всегда выше жидкости.
  8. Разрешить все жидкости ввести гель аппарата, а затем наложение осторожно изопропанола. Разрешить гель для полимеризации, по крайней мере 30 мин при комнатной температуре.
  9. Чистая проливным аппарата сразу с дН 2 O (не используйте моющие средства).
  10. Удалить изопропанол, промыть дН 2 O, и удалить дН 2 O с ватмане.
  11. Подготовка 3,2% концентрирующий гель (рецепт 7), добавив, APS и TEMED непосредственно перед употреблением.
  12. Налейте концентрирующий гель на вершине разделения гель и ввести гребень между стеклянными пластинами, избегая пузырей. После укладки гель полимеризуется, прохладный гель до 4 ° C.
  13. Непосредственно перед загрузкой образца, удалите гребень медленно, потянув ее под углом к ​​плоскости геля. Это позволяет воздуху поступать в карманы быстро, что улучшает качество скважин.

3. Разделение диализу лизат ячейки БН-СТРАНИЦА

  1. Нагрузка от 1 до 40 мкл лизата диализу и от 10 до 20 мкл Маркер Mix (рецепт 10) в сухих скважин при температуре 4 ° C. Наложение образцов в каждую лунку с холодным катодом буфера (рецепт 8).
  2. Заполните внутренней камеры с холодной Cathode буфера и наружный / нижняя палата с холодной буфера Анодные (рецепт 9).
  3. Применить от 100 В до 150 В или minigel в значительной гель, пока образцы ввели разделение геля. Выполнить гель при температуре 4 ° C.
  4. Повышение напряжения до 180 В (minigel) или 400 В (большие гель) и продлится до красителя перед достигает конца геля. Запустить занимает от 3 до 4 часов для мини-и от 18 до 24 часов для большого геля.

4. Второе измерение SDS-PAGE

  1. Подготовка стандартных 10% SDS-гель (рецепты 12-15) с одной большой полосы для первого измерения БН-PAGE переулок, одну очередную полосу движения для маркер молекулярного веса, и одну очередную полосу движения для Аликвоту диализовали лизат, которая смешивают с SDS образца буфера (рецепт 11) и кипятят в течение 5 мин при 95 ° C. Используйте прокладки, толщина которых была увеличена на два слоя скотча для упрощения загрузки БН-ПААГ геля на SDS гель.
  2. Удалить БН-PAGE гель в плиты из аппарата электрофореза и аккуратно приподнимите одну пластину.
  3. Удалить концентрирующий гель и вырезать полосу БН-PAGE гель, содержащий белки, представляющих интерес.
  4. Место БН-ПААГ геля в 2 раза SDS буфера выборки и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
  5. Отварите БН-PAGE геля кратко (не более 20 сек) в микроволновой печи.
  6. Инкубируйте БН-PAGE геля в горячей Пример SDS буфера в течение еще 15 минут при комнатной температуре.
  7. Нагрузка БН-ПААГ геля в больших свыше укладки гель SDS-PAGE гель избегая пузырьков воздуха, и наложения ломтик буфером Пример SDS. Нагрузка маркер и лизат контроля.
  8. Выполните электрофореза в соответствии со стандартными протоколами.

5. Обнаружение подразделения ПДК иммуноблоттинга

  1. Для передачи, подготовить шесть Ватман бумаг и мембраны PVDF установки на размер SDS-гель.
  2. Инкубируйте мембраны PVDF в 100% метаноле в течение 30 с и понежиться Ватман статей в буфер передачи (рецепт 16).
  3. Поместите три ватмана бумаг, мембраны PVDF, SDS-гель (снять концентрирующий гель), и снова три ватмана статей в сэндвич-подобные структуры в полусухого переноса.
  4. Применяют 20 В в течение 25 мин.
  5. Обнаружение белков в соответствии со стандартными протоколами иммуноблоттинга.

6. Представитель Результаты

Мы представляем анализ эукариотической 19S, 20S, 26S и протеасом в качестве примера для характеристики ПДК в 2D-BN / SDS-PAGE (рис. 1А). НЕК293 лизировали с буфером, содержащим 0,1% Тритон Х-100, как моющее средство сорвать мембран и растворить комплексов мембранных белков. Эти лизаты диализу против БН-диализа буфера для удаления солей и малых метаболитов. Затем, ПДК были разделены 4-15% градиент БН-PAGE затем второе измерение SDS-PAGE. Белки были визуализированы с помощью метода иммуноблоттинга с антителами против субъединиц β2 и Mcp21 из 20S протеасомы.

Рисунок 1
Рисунок 1. Двумерных BN-PAGE/SDS-PAGE подход с использованием сотовой лизатов. () Принципиальная схема 2D подход BN-PAGE/SDS-PAGE из ячеистого лизатов. (В) Схема схема 2D BN-PAGE/SDS-PAGE. Белки и ПДК разделены под родной условий БН-PAGE в первом измерении. Для второго измерения, белков и / или ПДК денатурированного с помощью ДСН в геле полоса после отделения БН-PAGE и затем подвергают SDS-PAGE. Мономерные белки будут мигрировать в гиперболической диагональные связи с градиентом геля в первом и линейного геля во втором измерении. Компоненты одного конкретного MPC будет найден ниже диагонали, расположенные на вертикальной линии.

Было показано, что сочетание первого измерения БН-и второе измерение SDS-PAGE, мономерные белки мигрировать в гиперболической диагональные связи с градиентом геля в первом и линейного геля во втором измерении ((Камачо Карвахаль, Wollscheid и др. др. 2004);. рис. 1b). Компоненты ПДК расположены ниже этой диагонали. Белки, которые представляют подразделения одного и того же MPC можно найти в одной вертикальной линии во втором измерении, в то время нескольких местах одного и того же белка в горизонтальной линии указывает на наличие белка в нескольких различных ПДК. Рисунок 2 показывает, что в нашем эксперименте иммуноблоттинга против β2 и Mcp21 показал наличие специфических белковых комплексов, содержащих эти протеасомной субъединицы. Оба белка были обнаружены в виде отдельных пятен, расположенных в горизонтальной линией, указывая, что β2 и Mcp21 представляют компоненты нескольких различных ПДК. Эти ПДК можно четко определить как 26S протеасом (20S 19S плюс крышка), 20S протеасомы вместе с регуляторной субъединицы PA28 и 20S протеасом только на основании их размера и состава. Взятые вместе, эти resuLTS продемонстрировать, что эндогенные ПДК могут быть идентифицированы и характеризуется двумерным BN-PAGE/SDS-PAGE подход с использованием сотовой лизат. Этот метод применим для определения размера, состава и относительного содержания ПДК.

Рисунок 2
Рисунок 2. Обнаружение различных форм эукариот протеасом путем иммуноблоттинга после двумерного BN-PAGE/SDS-PAGE. Для выявления и анализа эукариот протеасом, HEK293 лизировали с 0,1% Тритон Х-100. Сотовая лизаты диализуют и затем подвергают БН-PAGE (4-15%), чтобы отделить ПДК. Впоследствии, второе измерение SDS-PAGE (10%) был запущен на размер разделения отдельных компонентов. Иммуноблоттинг была выполнена со специфическими антителами признании Mcp21 и β2 субъединицы комплекса ядро ​​20С, а регуляторная субъединица PA28.

I. Таблица специфических реагентов (в алфавитном порядке):

Реагент Компания Комментарии
6-aminohexanoic кислоты
(Ε-аминокапроновая кислота)
Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия Это химическое вещество раздражающего и должны быть обработаны с перчатками.
Акриламид-bisacrylamide решение (40%), Mix 32:1 AppliChem, Дармштадт, Германия Это решение является нейротоксическое и должны быть обработаны с перчатками.
Бис-трис Рот, Карлсруэ, Герма-Нью-Йорк
Бридж 96 Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия
Кумасси синий G250 Служанка, Гейдельберг, Германия многих Не заменять другими видами Кумасси красителей, таких как Кумасси синий R250 или коллоидной Ку-Масси блюз.
Дигитонин Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия Дигитонин является токсичным. Перчатки должны быть надеты при обработке буферов или образцов, содержащих это моющим средством.
Dodecylmaltoside AppliChem, Дармштадт, Германия
Тритон Х-100 Рот, Карлсруэ, Герма-Нью-Йорк Тритон Х-100 является токсичным. Перчатки должны быть надеты при обработке буферов или образцов, содержащих это моющее средство.

II. Таблица конкретных материалов и оборудования:

Оборудование Компания
Диализ мембраны (молекулярный вес отсечки 10 до 50 кДа) Рот, Карлсруэ, Германия
Система Гель-электрофорез Например, из Bio-Rad, Мюнхен, Германия
Градиент смесителя Самодельные или коммерчески доступны от Bio-Rad, Мюнхен, Германия
Перистальтический насос Amersham Pharmacia Biotech, Фрайбург, Германия
Поливинилиденфторид дифторида (PVDF) мембраны Immobilon-P, Millipore, Эшборн, Германия
Полусухой передачи оборудования Например, из Bio-Rad, Мюнхен, Германия
Силиконовая трубка (от 3 до 5 мм в диаметре, 1 м длины) NeoLab, Гейдельберг, Германия

III. Таблица рецептов:

Нет. Буферы и решения Содержание Комментарии
1 Фосфатно-солевом буфере (PBS) Na 2 HPO 4 8,1 mMKH 2
PO 4 1,5 мМ
NaCl 138 мм
2,7 мМ KCl
Решение должно быть рН 7,4, если подготовлено должным образом.
2 БН-лизирующего буфера База буфер
Бис-20 мМ трис
ε-аминокапроновой кислоты 500 мМ
NaCl 20 мМ
ЭДТА, рН 8,0, 2 мМ
Глицерин 10%

Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью соляной кислоты. Хранить при температуре 4 ° С.

Моющее средство
Дигитонин 0,5 до 1,0%
или Brij 96 от 0,1 до 0,5%
или Тритон Х-100 от 0,1 до 0,5%
или Dodecylmaltoside 0,1 до 0,5%

Протеаз и ингибиторов фосфатазы
Апротинин 10 мкг / мл
Leupeptin 10 мкг / мл
PMSF 1 мМ
Фторид натрия 0,5 мМ
Натрий ортованадата 0,5 мМ
Соответствующих моющих средств должны быть определены эмпирически и должна быть такой же, что и в других рецептов буфера для лизиса.

Дигитонин должны быть добавлены непосредственно перед употреблением из 2% маточного раствора в дН 2 O (магазин в 5-мл аликвоты при -20 ° С).

Протеазы и phophatase ингибируют-ORS следует добавить непосредственно перед употреблением.

При добавлении натрия orthova-nadate, буфер станет желтоватого цвета.
3 БН-диализа буфера База буфер
Бис-20 мМ трис
ε-аминокапроновой кислоты 500 мМ
NaCl 20 мМ
ЭДТА, рН 8,0, 2 мМ
Глицерин 10%

Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью соляной кислоты. Хранить при температуре 4 ° С.

Моющее средство
Дигитонин 0,3 до 0,5%
или Тритон Х-100 0,1%
или Brij 96 0,1%
или Dodecylmaltoside 0,1%

Протеаз и ингибиторов фосфатазы
PMSF 1 мМ
Натрий ортованадата 0,5 мМ
Соответствующих моющих средств должны быть определены эмпирически и должна быть такой же, что и в других буферах лизис, но в указанных ниже концентрациях.

Моющие средства должны быть добавлены, чтобы предотвратить агрегирование на шаг укладки гель-электрофореза.

Протеазы и phophatase ингибируют-ORS следует добавить непосредственно перед употреблением.
4 3x БН-гель буфера Бис-150 мМ трис
ε-аминокапроновой кислоты 200 мМ

Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью соляной кислоты. Хранить при температуре 4 ° С.
5 4% Разделение Гель 3x БН-гель буфера (рецепт 4) 5,00 мл
Акриламид / Bisacrylamide 1,50 мл
дН 2 O 8,50 мл
APS, 10% в дН 2 O 54 мкл
TEMED 5,4 мкл
Добавить APS и TEMED immedia-tely перед заливкой геля, так как эти реагенты способствующих полимеризации.

Этот рецепт достаточно, чтобы бросить 30-мл геля. Отрегулируйте объемы количество и размер гели льется.
6 15% Разделение Гель 3x БН-гель буфера (рецепт 4) 5,00 мл
Акриламид / Bisacrylamide 5,63 мл
Глицерин 70% 4,38 мл
APS, 10% в дН 2 O 42 мкл
TEMED 4,2 мкл
Добавить APS и TEMED immedia-tely перед заливкой геля, так как эти реагенты способствующих полимеризации.

Этот рецепт достаточно, чтобы бросить 30-мл геля. Отрегулируйте объемы количество и размер гели льется.

Концентрация акриламида bisacrylamide также может быть изменена по мере необходимости с 10 до 18%.
7 3,2% Укладка Гель 3x БН-гель буфера (рецепт 4) 3,00 мл
Акриламид / Bisacrylamide 0,72 мл
дН 2 O 5,28 мл
APS, 10% в дН 2 O 120 мкл
TEMED 12 мкл
Добавить APS и TEMED immedia-tely перед заливкой геля, так как эти реагенты способствующих полимеризации.

Этот рецепт достаточно, чтобы бросить 30-мл геля. Отрегулируйте объемы количество и размер гели льется.
8 Катод буфера Бис-15 мМ трис
Tricine 50 мМ
Кумасси синий G250 0,02%

Подготовка 1 литр, как 10-кратный запас, отрегулировать рН до 7,0 с помощью соляной кислоты, и хранить при температуре 4 ° C.
Развести 1:10 с дН 2 O перед использованием.
Не заменять другими видами Кумасси красителей, таких как Кумасси синий R250 или коллоидной блюз Кумасси.
9 Анодный буфер Бис-50 мМ трис

Подготовка 1 литр, как 10-кратный запас, отрегулировать рН до 7,0 с помощью соляной кислоты, и хранить при температуре 4 ° C.
Развести 1:10 с дН 2 O перед использованием.
10 Маркер Mix Альдолазы (158 кДа) 10 мг / мл
Каталазы (232 кДа) 10 мг / мл
Ферритин (440 и 880 кДа) 10 мг / мл
Тиреоглобулина (670 кДа) 10 мг / мл
BSA (66 и 132 кДа) 10 мг / мл
Бис-20 мМ трис
NaCl 20 мМ
Глицерин 10%

Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью соляной кислоты. Хранить при температуре 4 ° С.
Молекулярные маркеры вес также коммерчески доступны из нескольких источников, в том числе Инвитро поколения или Pharmacia.
11 SDS Пример буфера Трис 12,5 мм
SDS 4%
Глицерин 20%
Бромфенола синий 0,02%

Отрегулируйте рН до 6,8. Чтобы уменьшить дисульфидных связей, добавить 9 мл β-меркаптоэтанола.
SDS в виде порошка и β-Мер-captoethanol являются токсичными. Поэтому используйте перчатки и работать под капотом.
12 4x нижнего буфера 1,5 М Трис
SDS 0,4%

Отрегулируйте рН до 8,8.
SDS в виде порошка является токсичным. Поэтому используйте перчатки и работать под капотом.
13 4-кратный верхний буфер Трис 0,5 M
SDS 0,4%

Отрегулируйте рН до 6,8.
SDS в виде порошка является токсичным. Поэтому используйте перчатки и работать под капотом.
14 10% Разделение Гель Акриламид (30%) 2,0 мл
4x ниже 1,5 мл буфера
дН 2 O 2,454 мл
APS, 10% в дН 2 O 40 мкл
TEMED 6 мкл
Добавить APS и TEMED immedia-tely перед заливкой геля, так как эти реагенты способствующих полимеризации.

Этот рецепт достаточно, чтобы бросить 30-мл геля. Отрегулируйте объемы количество и размер гели льется.
15 4,8% Укладка Гель Acylamide (30%) 320 мкл
4-кратный верхний буфером 500 мкл
дН 2 O 1,16 мл
APS, 10% в дН 2 O 20 мкл
TEMED 2 мкл
Добавить APS и TEMED immedia-tely перед заливкой геля, так как эти реагенты способствующих полимеризации.

Этот рецепт достаточно, чтобы бросить 30-мл геля. Отрегулируйте объемы количество и размер гели льется.
16 Полусухое передача буфера Трис 48 мМ
Глицин 39 мм
Метанол 20%
SDS 0,1%

Регулировка громкости до 1 литра дН 2 O. Хранить при комнатной температуре.
SDS в виде порошка и метанола являются токсичными. Поэтому используйте перчатки и работать под капотом.

Discussion

В этом исследовании мы опишем анализ ПДК по БН-PAGE. 2D подход используется для первого отдельного ПДК в нативных условиях, а затем в дальнейшем разделить их на отдельные компоненты, второе измерение SDS-PAGE.

Образцы готовят из клеточных лизатов. Для растворения многих ПДК, соответствующих моющих средств необходимо, который сохраняет структуру белковых комплексов. Здесь мы используем 0,1% Тритон Х-100. Однако, оптимальное моющее средство и его подходящей концентрации должны быть определены эмпирически для каждого ПДК. В случае Тритон Х-100, например, было сообщено, что низкие концентрации моющего средства позволяют выявлять димерных форм F 1 F 0-АТФазы комплекса (Арнольд, Пфайфер и соавт. 1998). Высшее Тритон Х-100 концентрациях, однако, привести к диссоциации димера и соответствующее увеличение мономерных F 1 F 0-АТФазы комплекса. Это согласуется с одним из наших бывших исследования, были мы покажем, что поливалентные Т-клеточного рецептора комплекса (TCR) сохраняется после извлечения с низкой концентрацией Brij 96, в то время как использование более высокой концентрации или другого моющего средства называются дигитонин результаты в извлечение мономерных TCR (Schamel, Аречаги и соавт. 2005). Часто используемые моющие средства, которые могут быть проверены включают дигитонин (от 0,5 до 1%), Тритон Х-100 (от 0,1 до 0,5%), Бридж 96 (от 0,1 до 0,5%), или dodecylmaltoside (от 0,1 до 0,5%). Эти реагенты неионогенные моющие средства, которые имеют тенденцию быть лучше для стабильности ПДК. Имейте в виду, что контакт с СДС и другие сильные моющие средства следует избегать (Камачо Карвахаль, Wollscheid и соавт. 2004).

Диализ лизатов является необходимой для достижения ПДК разделения в БН-гель (Камачо Карвахаль, Wollscheid и др. 2004 год.); (Хайс, Junkes и др. 2005).. Кажется, что корректировка концентрации соли или удаления низкомолекулярных примесей вес имеет решающее значение для высокого разрешения. Стоит отметить, что также мембранные препараты и ПДК, которые были immunopurified а позже вымывают из антител, пригодных для БН-PAGE (Свами, Siegers и соавт. 2006). В обоих случаях образцы не должны быть диализу для БН-PAGE разделения, если лизис мембраны или элюирования осуществляется в БН-лизис буфера.

Для разделения белков по БН-PAGE, краситель синий Кумасси необходима, который связывается с белками неспецифичным и покрывает их с отрицательными зарядами. Таким образом, Кумасси синим позволяет электрофоретической подвижности белков к катоду при нейтральном рН (Schägger и фон Jagow 1991); (Schägger, Крамер и др., 1994.). Кроме того, Кумасси синий препятствует агрегации белков в концентрирующий гель во время электрофореза. Для БН-PAGE, Кумасси G250 должен быть использован вместо Кумасси синий R250 или коллоидной блюз Кумасси.

Перед запуском БН-гель, необходимо, чтобы процент гель подходит для ожидаемого размера ПДК интерес. Сборный БН-гели с различными градиентами и подходящих буферов являются коммерчески доступными из Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Гель System). Но БН-гели могут быть также получены с использованием градиента смеситель вместе с persistaltic насоса. Чтобы гарантировать нетронутыми градиент, жидкость должна поступать постоянно при разливке и пузыри следует избегать. Мы рекомендуем загрузку различных разведений образца на гель потому что перегрузка может привести к осаждения белка во время электрофореза процесса. Кроме того, БН-гели должны быть запущены при 4 ° С для предотвращения деградации белка и держать ПДК нетронутыми.

После БН-PAGE, визуализация ПДК может быть достигнуто путем Кумасси бриллиантовый синий окрашивания, окрашивания серебром или иммуноблоттинга. Белки полосы визуализировали окрашиванием Кумасси или серебро являются подходящими для дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии (Камачо Карвахаль, Wollscheid и соавт. 2004). В случае иммуноблоттинга, оптимальные условия для передачи ПДК интереса должны быть определены опытным путем. Помните, что Кумасси синий также передается во время блоттинга БН-гель. Таким образом, гель будет бесцветным после успешной передачи, в то время как мембрана будет оказывать синего цвета. Кроме того, важно отметить, что не каждое первичное антитело, которое работает для обнаружения после SDS-PAGE, применимо к иммуноблоттинга на БН-PAGE. Это может случиться, что антитела не признают ПДК интерес, потому что их эпитопа скрыт в родной конформации белков. Чтобы преодолеть эту проблему, можно для денатурации белков в БН-гель до передачи в кипящей геля в скором времени в 1х буфере образец SDS.

В нашем примере, мы не предмет БН-гель непосредственно на обнаружение белка полосы. Вместо этого, мы разделены БН-PAGE разделенных лизат вторым dimensiна SDS-PAGE. Во втором измерении SDS-гель, мономерные белки мигрировать в гиперболической диагональные связи с градиентом геля в первом и линейного геля во втором измерении (Камачо Карвахаль, Wollscheid и соавт. 2004). Это позволяет легко идентифицировать ПДК, так как они локализованы ниже этой гиперболической диагонали. Подкомпоненты одно определенное MPC разделяются в вертикальную линию во втором измерении SDS-PAGE. Компоненты, которые входят в состав нескольких ПДК dinstinct может быть идентифицирован по горизонтальной линии в соответствии с размером ПДК. Тем не менее, он должен учитывать, что несколько мест белков, входящих в одной вертикальной линии может также быть частью отдельных комплексов, которые мигрируют на той же позиции в БН-PAGE. Окончательное доказательство того, что они находятся в том же MPC может быть получена на основе антител методом сдвига геля. В данном анализе сотовой лизат инкубировали с антителами против белка представлен одним из выявленных пятна до БН-PAGE. Это приводит к сдвигу всех ПДК, которые содержат этот белок в направлении более высокой молекулярной массы в первом измерении. Другие белки, которые также являются частью этих ПДК будет проходить этот комплекс конкретных сдвига и, следовательно, легко определить, во втором измерении SDS-гель.

Не только состав ПДК могут быть проанализированы БН-страницы, но также определение их стехиометрии можно (и Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Свами, Minguet и др. 2007 год.). Для этого анализа Namos (родной основе антител мобильности сдвига анализ) может быть выполнена. Как и в основе антител методом сдвига геля, сотовые лизатов инкубировали с моноклональными субъединицы-специфических антител. Это приводит к индукции электрофоретического immunoshifts в БН-гели, которые позволяют вывод из степени переложить на стехиометрии ПДК

В conlusion, БН-страница предназначена для определения ПДК и определение их размера, состава, а также относительное изобилие. Исполняется как анализ Namos, он также предлагает возможность определения стехиометрии определенных ПДК. С учетом его общего применения, этот метод является очень полезным инструментом для характеристики ПДК (Деккер, Мюллер и др., 1996.); (Виттиг и Schagger 2008); (Вагнер, Rehling и др. 2009 год.); (Виттиг и Schägger 2009) .

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим Майкла Reth, Герман Schägger, и Маргарита Камачо Карвахаль для научной поддержки. Эта работа финансировалась из FORSYS Bundesministerium Fuer Bildung и Forschung (BMBF), по БИОСС из Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), а также при частичной поддержке совершенства Инициатива немецкого федерального правительства и правительств (ГСК-4, Спеманн Высшая школа ).

References

  1. Arnold, I., Pfeiffer, K. Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits. EMBO J. 17, (24), 7170-7178 (1998).
  2. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 3, (2), 176-182 (2004).
  3. Heiss, K., Junkes, C. Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells. Proteomics. 5, (14), 3614-3622 (2005).
  4. Sali, A., Glaeser, R. From words to literature in structural proteomics. Nature. 422, 216-225 (2003).
  5. Schägger, H., Cramer, W. A. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217, (2), 220-230 (1994).
  6. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem. 199, (2), 223-231 (1991).
  7. Schamel, W. W. Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE. J Immunol Methods. 252, (1-2), 171-174 (2001).
  8. Schamel, W. W., Arechaga, I. Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response. J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).
  9. Schamel, W. W., Reth, M. Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor. Immunity. 13, (1), 5-14 (2000).
  10. Swamy, M., Minguet, S. A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes. J Immunol Methods. 324, (1-2), 74-83 (2007).
  11. Swamy, M., Siegers, G. M. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci STKE. 2006, (345), 4-4 (2006).
  12. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).

Comments

12 Comments

  1. Dear All,

    I found this article quite interesting and useful. Thanks for the providing the information in such a wonderful way.

    Regards,
    GAnesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2011 - 5:12 PM
  2. Why can not I see the video...? please help me..

    Regards,
    Jalal

    Reply
    Posted by: JALAL A.
    July 10, 2011 - 1:39 AM
  3. Please email us at support@jove.com and we will be glad to help you out. Please make sure that you have the latest version of Flash installed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 12:03 PM
  4. Hi Britta, you guys did a wonderful job in explaining something rather elaborate. Hiowever, I would like to ask some questions:
    1. the 30 ml gel referred in the Swamy, M.,et al ²006 paper is the large or small gel? Which by the way is another good and clear paper way better than that protocol from Nature protocols Wittig et al, ²006.
    ². Yesterday I poured a 30 ml gel and got the samples in at 100 volts (with 0.01 A) howerver it only run a third of the gel and current went down to 0.00 and it stopped there (gel: 11 cm x 16 cm x 1.5 mm). Why is this and how can I fix it? Rosa Bermudez from Molecular Biology Department (MeXICO).

    Reply
    Posted by: Rosa B.
    October 5, 2011 - 6:26 PM
  5. I think the buffer of upper chamber was leaked down into the down chamber, hence the current was stopped. You can fix it by using a pomade. Also you can pour the extra buffer in upper chamber by using a syringe.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2011 - 4:40 AM
  6. Your service is awesome! thank you very much, i really apreaciate this!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 3, 2012 - 10:27 AM
  7. I have ² very VERY important comments that literally 5 minutes ago ruined my extracted samples. I think the video/paper needs to more STRONGLY point to them:
    1. DRY DRY DRY DRY the wells VERY VERY VERY well!!! If you have even the tiniest amount of liquid the sample will LEAK into the next well AND THE NEXT!!! Basically initially i had semi-dry well and from Well 1 leaked up to WELL 4. everything was contaminated. THEN I got a new gel and dried them with an aspirator SUPER WELL....guess what in 3 minutes well 1 was already slowly creeping into well ² and 3. SOOOOO I would suggest to follow the FILL-WELLS-WITH-CATHODE Buffer (no coomassie version)-METHOD. Otherwise it will leak everywhere. I have no idea how this did not happen in this video or they simply brushed over it soooo quickly and u cannot see it.
    ². Secondly, when you put the Cathode buffer everything is VERY BLUE!!!! I have no idea how are they able to say "when the samples have entered the gel". this is very hard to see. maybe their room is very well lit with but my cold room is not that great and everything looks dark blue and nothing I can see. U have to keep this in mind to maybe bring a light.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 6:21 PM
  8. Dear K
    thanks for your interest in our protocol and your comments.
    Regarding your comments:
    1. Loading your samples dry into empty wells should not cause them to leak into neighbouring wells. This might only happen in case your wells were filled with liquid (as the BN buffer, in contrast to SDS sample buffer, dŒs not cause the sample to sink into the well). As shown in the video in our lab we remove the comb and load directly into the empty lanes without washing them or anything. I suggest you to check whether the wells themselves are fine after removing the comb. Additionally you should make sure to fill same volumes into every single well, use BN-lysis buffer for wells without sample.
    ². It is true that everything seems to be very blue after addition of blue cathode buffer into the inner chamber. Still, with some practice you will be able to identifiy the running front of your gel without any problems. Focus on the left and right side of the gel, where the glass plate of the gel is pressed onto the rubber of the running chamber. There you can easily see the staight line of the running front as the background is of the coulour of the rubber and not blue due to the buffer. You could also carefully remove the blue cathode buffer from the inner chamber using a pipette.
    Good luck for your next Blue Native!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 24, 2012 - 8:47 AM
  9. Thank you for the great reply. It is true that a blue front can be seen but veeeeeeeery slightly. Also eventually there are ² fronts. FIRST: between the transparent gel and the dark blue and SECONDLY: between the dark blue and the lighter blue buffer. Many papers say "stop eletrophoresis when the front reaches the bottom" I guess I assume this to be when the gel is completely BLUE. So I should ignore the second front?

    In addition, I am very curious about performing a Western directly after the Blue NATIVE. The procedure described here is after the ²D SDS which is different I think. I tried to find protocol for Western immediately after BN-Native but nothing online seems too clear. There are several differenced that I am trying to figure out. For example: the PVDF is completely stained, so how exactly do I destain it (I dont want to use too much acid etc.). Also, somewhere I read that NO BSA blocking step is necessary when doing BN-Native + PVDF membrane. Those are just a few questions that I have.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 31, 2012 - 3:32 PM
  10. For performing Western directly after 1st dimension BN-PAGE I recommend you to use the semidry system and normal transfer buffer. Of course your gel will be blue, but depending on what you do afterwards that is not a problem (e.g. immunodetection). To have a lighter blue gel you could also exchange blue cathode buffer with colorless cathode buffer during gel run as soon as your samples entered the separating gel.
    Blocking is still necessary! After transfer the membrane should be handeled normally. Please see also Swamy et al. ²006.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 3:31 AM
  11. Actually, you don't need to be worried about when to stop the run. According to the original paper [please find Anal. Biochem. ²17(²), ²²0-²30 (1994)], the pore-size distribution determines the individual migration ends of proteins. You could just run until the current stop (your power supply may show an error signal). Everything that could be separated in your gel will be stay at their own sites.

    Reply
    Posted by: Yeh-Lin L.
    February 3, 2012 - 2:58 AM
  12. Thank you so much for your replies. I still have some strange results.
    1. I noticed that in the Swamy et al ²006 paper you suggested to me and also the video here, your samples are TRANSPARENT, however the original Wittig and other papers have their sample with Coomassie Blue prior to loading. resulting in very very blue samples. I do not know if this is an issue.
    ². However when I run the sample they definitely remain as very very thick blue spots on my gel.
    3. Also, I run gel 1h then increase to 150-170V for another ²+ hours, the dark blue front reaches the bottom SORT OF (look at image), the thick BLUE spots are very visible, and also the upper half of the gel is lighter because of the second lighter cathode buffer. But I never get such a CLEAR and perfect line like yours. My DARK blue part of the gel remains there and as you see underneath the big blue spots there is nothing.
    PLEASE look at the image: http://tinypic.com/view.php?pic=110kcxh&s=5 (look at lanes 3-4-5)

    I am just confused, do I have too much sample. Why do I have such enormous blue spots very clearly visible. My proteins are transmembrane proteins that are very very highly over-expressed. Maybe I should load less? They should be sizes 60kDa, 90kDa at 150kDa. I am using the Bio-rad pre-casted Tris-HCl gels 4-15%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 10:19 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics