ג'ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

* These authors contributed equally
Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

בסרטון זה, אנו מתארים את האפיון של מתחמי multiprotein (MPCs) על ידי כחול אלקטרופורזה בג'ל יליד polyacrylamide (BN-PAGE). במימד ראשון, lysates הסלולר dialyzed מופרדים על ידי-BN לזהות MPCs בודדים. במימד השני SDS-PAGE, MPCs עניין מחולקים נוספת לנתח בוחריהם ידי immunoblotting.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מתחמי multiprotein (MPCs) לשחק תפקיד מכריע האיתות בתא, מכיוון שרוב החלבונים ניתן למצוא מתחמי תפקודית או רגולטוריות עם חלבונים אחרים (סאלי, Glaeser et al. 2003). לכן, המחקר של חלבונים רשתות אינטראקציה מחייב אפיון מפורט של MPCs כדי להשיג הבנה אינטגרטיבית של תפקוד חלבונים תקנה. לצורך זיהוי וניתוח, MPCs יש להפריד בתנאים המקומיים. בסרטון זה, אנו מתארים את ניתוח MPCs ידי כחול ג'ל אלקטרופורזה יליד polyacrylamide (BN-PAGE). BN-PAGE היא טכניקה המאפשרת הפרדה של MPCs ב קונפורמציה יליד עם רזולוציה גבוהה יותר המוצעים על ידי סינון ג'ל או צפיפות ultracentrifugation סוכרוז, ולכן הוא שימושי כדי לקבוע את גודל MPC, קומפוזיציה, ואת השפע היחסי (Schägger ו פון יגוב 1991) ; (Schägger, קריימר et al 1994).. לפי שיטה זו, חלבונים מופרדים לפי גודל הידרודינמית שלהם ואת הצורה במטריצה ​​polyacrylamide. הנה, אנחנו מדגימים את ניתוח MPCs של lysates הסלולר הכולל, וציין כי דיאליזה lysate היא צעד חיוני כדי להפוך BN-PAGE החלים אלה דגימות ביולוגיות. באמצעות שילוב של PAGE-SDS BN-first ו המימד השני ממד, אנו מראים כי MPCs מופרדים על ידי-BN אפשר לחלק עוד יותר על ידי SDS-PAGE לתוך מרכיבי האישיות שלהם. ויזואליזציה של מרכיבי MPC על הפרדה בג'ל מתבצע על ידי immunoblotting סטנדרטי. כדוגמה לניתוח MPC על ידי-BN, בחרנו 19S אוקריוטים היטב מאופיין, בשנות ה -20, ו proteasomes 26S.

Protocol

** וידאו פרוטוקול זה מבוסס על פרסום משויך 1: ג'ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) לצורך זיהוי וניתוח של מתחמי multiprotein. Mahima סוואמי, גבריאל מ Siegers, סוזנה Minguet, ברנד Wollscheid, וולפגנג WA Schamel. STKE המדע של 2006 (345): pl2, 25 ביולי 2006, [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. אנא לחץ כאן כדי לראות פרסום זה .

1. הכנת lysate תא dialyzed

  1. 10x10 קציר 6 תאים גלולה ידי צנטריפוגה ב 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  2. שטפו את תא גלולה שלוש פעמים עם 1 מ"ל של קר כקרח PBS (מתכון 1), כמו צנטריפוגה בשלב 1.1.
  3. Resuspend גלולה ב μL 250 של קר כקרח הצפת BN-תמוגה (מתכון 2) ו לדגור על קרח למשך 15 דקות.
  4. צנטריפוגה ב g 13,000 עבור 15 דקות ב 4 ° C כדי להסיר חומר מסיס.
  5. ממיסים חור במכסה של צינור 1.5-מ"ל microcentrifuge באמצעות צד מחוממות בקוטר גדול של פיפטה פסטר, ואז למקם את הצינור על הקרח להתקרר עד 4 ° C.
  6. העברת supernatant משלב 1.4 לתוך הצינור צונן עם החור בכובע.
  7. המקום קרום דיאליזה (משקל מולקולרי חתך של 10 KD) עם מלקחיים על גבי הצינור נפתח, לסגור את המכסה, ולנתק את קרום דיאליזה עודף זה בולט.
  8. חותם את הכובע בצד בזהירות עם Parafilm.
  9. היפוך צינורות צנטריפוגה הפוכה במהירות הנמוכה ביותר האפשרית, תוך 50 מ"ל צינורות חרוטי בצנטריפוגה תרבית תאים עבור 10 שניות ב 4 ° C. הוצא את הצינור מתוך צנטריפוגה הפוכה באמצעות פינצטה כדי למנוע הפיכת צד ימין למעלה צינור.
  10. הכן כוס של 100 מ"ל עם הצפת BN-דיאליזה קר (מתכון 3) וצלחת ומערבבים. השתמש לפחות 10 מ"ל של הצפת BN-דיאליזה לכל מדגם 100-μL.
  11. להדביק את הצינורית עם הקלטת הפוך בתוך כוס, ולהסיר בועות אוויר מחור תחת כובע בעזרת פיפטה פסטר כפופות.
  12. כוס מקום על גבי stirrer מגנט, לעבור על stirrer ולהשאיר אותה במשך 6 שעות או למשך הלילה בחדר קר. בדוק מדי פעם כדי להבטיח ערבוב אינו יצירת בועות אוויר על קרום דיאליזה.
  13. אסוף את lysate תא dialyzed בצינור microcentrifuge חדש צונן.

2. שפיכת של BN-ג'לים

  1. ג'ל צבע נשפך מתבצע בטמפרטורת החדר עם מערבל שיפוע. יש ללבוש כפפות כי הוא polyacrylamide neurotoxic מאוד. הימנע מכל מגע עם SDS.
  2. מניחים את מערבל צבע על צלחת ומערבבים וצרף אותו לצינור גמיש. סגור את הערוץ באמצעות שסתום ולסגור את צינורות עם מלחציים. מניחים stirrer מגנטי 15% לתוך צילינדר "גבוה", מחוברת בצינור.
  3. נושא בצינור גמיש לתוך משאבה peristalitic ולצרף מחט המזרק עד סופו. ואז, במקום מחט בין שני לוחות זכוכית של המנגנון ג'ל.
  4. הכן 4% (מתכון 5) ו - 15% (מתכון 6) הפרדת פתרונות ג'ל, והוסיף APS ו TEMED מיד לפני השימוש. הכרכים יחד צריכה להיות שווה לנפח של ג'ל המפריד.
  5. יוצקים את הפתרונות הללו הג'ל לתוך צילינדרים המקביל מערבל צבע (4% אל "נמוכה" ו -15% בתוך צילינדר "גבוה").
  6. פתח את השסתום כוח החוצה בועת האוויר בתוך הערוץ המחבר בין שני מאגרים ג'ל על ידי לחיצה על גליל שמאל עם האגודל.
  7. הפעל את stirrer המגנטי, להסיר את מהדק, ולעבור על המשאבה peristalitic כדי 5 מ"ל לדקה. אפשר הג'ל לאט לזרום בין לוחות הזכוכית. ודא כי המחט הוא תמיד מעל הנוזל.
  8. אפשר נוזל כל להזין את מנגנון ג'ל, ולאחר מכן כיסוי בעדינות עם isopropanol. אפשר ג'ל כדי לפלמר דקות לפחות 30 בטמפרטורת החדר.
  9. נקו את מנגנון לשפוך מיד עם DH 2 O (אין להשתמש בחומרי ניקוי).
  10. הסר את isopropanol, לשטוף עם DH 2 O, ולהסיר את 2 DH O עם נייר Whatman.
  11. הכן ג'ל 3.2% לערום (מתכון 7), והוסיף APS ו TEMED מיד לפני השימוש.
  12. יוצקים את הג'ל לערום על גבי ג'ל המפריד ולהציג את המסרק בין לוחות הזכוכית, הימנעות בועות. לאחר ג'ל הערמה יש polymerized, לקרר את ג'ל עד 4 ° C.
  13. מיד לפני טעינת המדגם, להסיר את המסרק לאט, מושך אותו החוצה בזווית למישור של הג'ל. זה מאפשר לאוויר להיכנס במהירות כיסים, אשר משפרת את איכות בארות.

3. הפרדת lysate תא dialyzed ידי-BN

  1. טען 1-40 μL של lysate dialyzed ו 10-20 μl של מיקס מרקר (מתכון 10) בבארות יבש 4 ° C. כיסוי דגימות היטב כל אחד עם הצפת קטודה קר (מתכון 8).
  2. מלאו את תא פנימי עם חתול קרhode הצפת ואת תא חיצוני / נמוך עם הצפת האנודה קר (מתכון 9).
  3. החלת 100 V כדי minigel או 150V ל ג'ל גדול, עד הדגימות נכנסו ג'ל הפרדה. הרץ את הג'ל על 4 ° C.
  4. הגדלת מתח 180 V (minigel) או 400 V (ג'ל גדול) ולהפעיל עד הכניסה לצבוע מגיע לסוף הג'ל. לרוץ לוקח 3 עד 4 שעות עבור מיני, ו -18 עד 24 שעות עבור ג'ל גדול.

4. הממד השני SDS-PAGE

  1. הכנת תקן 10% SDS ג'ל (מתכונים 12-15) עם נתיב אחד גדול עבור הנתיב הראשון מימד BN-PAGE, נתיב אחד קבוע סמן משקל מולקולרי, ואחד במסלול קבוע aliquot של lysate dialyzed כי יש היה מעורב עם חיץ מדגם SDS (מתכון 11) ו מבושלים 5 דקות בשעה 95 ° C. השתמש מפרידי אשר עובי הוגדל על ידי שתי שכבות של נייר דבק כדי לפשט את הטעינה של פרוסת BN-PAGE את הג'ל על גבי ג'ל SDS.
  2. הסר את הג'ל BN-עמוד הצלחות מן המנגנון אלקטרופורזה בעדינות לחלץ את אחד צלחת.
  3. הסר את הג'ל לערום לחתוך את הנתיב של ג'ל BN-הדף המכיל את החלבונים של עניין.
  4. מניחים את נתח BN-PAGE ג'ל SDS הצפת לדוגמא 2x ו דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מרתיחים את BN-PAGE פרוסה ג'ל בקצרה (לא יותר מ 20 שניות) במיקרוגל.
  6. דגירה הפרוסה BN-PAGE ג'ל למאגר SDS חם לדוגמא במשך 15 דקות אחר בטמפרטורת החדר.
  7. טען את פרוסת BN-PAGE ג'ל גדול מעל הג'ל הערמה של SDS-PAGE הימנעות ג'ל בועות אוויר, וכן כיסוי עם הצפת הפרוסה לדוגמא SDS. טען סמן ושליטה lysate.
  8. בצעו אלקטרופורזה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.

5. זיהוי של יחידות משנה MPC ידי immunoblotting

  1. עבור העברה, להכין שישה עיתונים Whatman ואת קרום PVDF מתאים לגודל של SDS ג'ל.
  2. דגירה הממברנה PVDF ב 100% מתנול 30 s ולספוג את הניירות Whatman במאגר ההעברה (מתכון 16).
  3. המקום three Whatman ניירות, הממברנה PVDF, SDS ג'ל (להסיר לערום ג'ל), ושוב שלושה מאמרים Whatman במבנה דמוי כריך לתא להעביר semidry.
  4. החל V 20 דקות 25.
  5. זיהוי חלבונים על פי פרוטוקולים immunoblotting סטנדרטי.

6. נציג תוצאות

אנו מציגים את ניתוח 19S, ה -20 אוקריוטים, ו 26S proteasomes כדוגמא לאפיון MPC ידי BN 2D / SDS-PAGE (איור 1A). HEK293 התאים היו lysed עם חיץ המכיל 0.1% Triton X-100 כמו חומר ניקוי לשבש את ממברנות solubilize חלבון מתחמי ממברנה. Lysates אלה היו dialyzed חוצץ נגד BN-דיאליזה להסיר מלחים מטבוליטים קטן. ואז, MPCs הופרדו על ידי 4-15% PAGE BN-שיפוע ואחריו הממד השני SDS-PAGE. חלבונים הם דמיינו ידי immunoblotting עם נוגדנים נגד יחידות משנה β2 ו Mcp21 של שנות ה -20 הפרוטאזום.

איור 1
באיור 1. דו מימדי BN-PAGE/SDS-PAGE גישה lysates באמצעות הסלולר. (א) תרשים זרימה של גישה BN-PAGE/SDS-PAGE 2D מ lysates הסלולר. (ב) תכנית סכמטית של BN-PAGE/SDS-PAGE 2D. חלבונים MPCs מופרדות בתנאים יליד ידי-BN במימד הראשון. עבור הממד השני, חלבונים ו / או MPCs הם מפוגל ידי SDS ברצועת הג'ל לאחר ההפרדה על ידי-BN והועברו לאחר מכן SDS-PAGE. חלבונים monomeric יעברו בתוך בשל אלכסוני היפרבולי כדי ג'ל שיפוע של הראשון ג'ל ליניארי בממד השני. רכיבי בטון של אחד MPC יימצא מתחת אלכסוני, הממוקם על קו אנכי.

הוכח כי על ידי שילוב של הראשון BN-ו המימד השני מימד SDS-PAGE, חלבונים monomeric נודדים בתוך אלכסוני היפרבולי בשל הג'ל הדרגתי במחצית הראשונה ואת ג'ל ליניארי בממד השני ((קמאצ'ו-קארוואחאל, Wollscheid et אל 2004);. 1B איור). רכיבי MPCs ממוקמים מתחת זה באלכסון. חלבונים המייצגים יחידות משנה של MPC אותו ניתן למצוא קו אחד אנכי במימד השני, בעוד מספר הנקודות של אותו חלבון בקו אופקי להעיד על נוכחות של חלבון ב MPCs ברורים מספר. איור 2 מראה כי בניסוי שלנו immunoblotting נגד β2 ו Mcp21 חשף את נוכחותם של קומפלקסים חלבונים ספציפיים אלה המכיל יחידות משנה proteasomal. שניהם היו לזיהוי חלבונים כמו כתמים בודדים המסודרים בקו אופקי, המציין כי β2 ו Mcp21 לייצג מרכיבי MPCs ברורים מספר. MPCs אלה ניתן היה לזהות בבירור הפרוטאזום 26S (ה -20 פלוס 19S כובע), ה -20 הפרוטאזום יחד עם למקטע הרגולציה PA28, ואת ה -20 proteasomes לבד, על סמך גודלם ועל הרכב. יחדיו, אלה resuLTS להוכיח כי MPCs אנדוגני ניתן לזהות מאופיינת בגישה דו מימדי BN-PAGE/SDS-PAGE lysate באמצעות הסלולר. שיטה זו ישימה לקביעת גודל הרכב, והשפע היחסי של MPCs.

איור 2
איור 2. זיהוי של צורות שונות של הפרוטאזום אוקריוטים ידי immunoblotting לאחר BN-PAGE/SDS-PAGE דו מימדי. לצורך זיהוי וניתוח של proteasomes האיקריוטים, התאים היו HEK293 lysed עם טריטון 0.1% X-100. Lysates נייד היו dialyzed והועברו לאחר מכן PAGE-BN (4-15%) כדי MPCs נפרד. לאחר מכן, הממד השני SDS-PAGE (10%) היה לרוץ ההפרדה בגודל של המשנה בודדים. Immunoblotting בוצעה עם נוגדנים ספציפיים הכרה Mcp21 ו β2 למקטע של המתחם הליבה ה -20, ואת הרגולציה למקטע PA28.

י טבלה של חומרים כימיים מסוימים (לפי סדר אלפביתי):

מגיב חברה תגובות
6-aminohexanoic חומצה
(Ε-aminocaproic חומצה)
סיגמא אולדריץ, Taufkirchen, גרמניה כימי זה מגרה את העור יש לטפל עם כפפות.
Acrylamide-bisacrylamide פתרון (40%), מערבבים 32:1 Applichem, דרמשטט, גרמניה פתרון זה neurotoxic וצריכים להיות מטופלים עם כפפות.
Bis-טריס רוט, קרלסרוהה, Germa-NY
Brij 96 סיגמא אולדריץ, Taufkirchen, גרמניה
Coomassie כחול G250 Serva, היידלברג, גור לרבים אין תחליף סוגים אחרים של Coomassie לצבוע כמו Coomassie כחול R250 או colloidal-COO מאסי בלוז.
Digitonin סיגמא אולדריץ, Taufkirchen, גרמניה Digitonin רעיל. יש ללבוש כפפות בעת טיפול או דוגמאות מאגרים המכילים להרתיע-ג'נטלמן.
Dodecylmaltoside Applichem, דרמשטט, גרמניה
טריטון X-100 רוט, קרלסרוהה, Germa-NY טריטון X-100 הוא רעיל. יש ללבוש כפפות בעת טיפול או דוגמאות מאגרים המכילים חומר ניקוי.

השנייה. טבלה של החומר ציוד ספציפי:

ציוד חברה
דיאליזה ממברנות (משקל מולקולרי חתוכים 10-50 KD) רוט, קרלסרוהה, גרמניה
ג'ל אלקטרופורזה מערכת לדוגמה מ - Bio-Rad, מינכן, גרמניה
מערבל צבע מתוצרת עצמית או זמינים מסחרית של Bio-Rad, מינכן, גרמניה
Peristaltic משאבה Amersham Pharmacia ביוטק, פרייבורג, גרמניה
Difluoride polyvinylidene (PVDF) קרום Immobilon-P, Millipore, Eschborn, גרמניה
חצי יבש העברת ציוד לדוגמה מ - Bio-Rad, מינכן, גרמניה
צינורות הסיליקון (3-5 מ"מ קוטר, 1 מ 'אורך) NeoLab, היידלברג, גרמניה

ג. טבלה של מתכונים:

לא. Buffers ופתרונות תוכן תגובות
1 פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) Na 2 HPO 4 8.1 mMKH 2
ת.ד. 4 1.5 מ"מ
138 mM NaCl
KCl mM 2.7
הפתרון צריך להיות pH 7.4, אם מראש pared כראוי.
2 BN-תמוגה הצפת מאגר חיץ
Bis-טריס 20 מ"מ
ε-aminocaproic חומצה 500 מ"מ
NaCl 20 מ"מ
EDTA, pH 8.0 2 מ"מ
גליצרול 10%

התאם ל-pH 7.0 עם HCl. חנות ב 4 ° C.

דטרגנט
Digitonin 0.5-1.0%
או Brij 96 0.1-0.5%
או טריטון X-100 0.1-0.5%
או Dodecylmaltoside 0.1-0.5%

מעכבי פרוטאז ו phosphatase
Aprotinin 10 מיקרוגרם / מ"ל
Leupeptin 10 מיקרוגרם / מ"ל
PMSF 1 mM
נתרן פלואוריד 0.5 מ"מ
נתרן orthovanadate 0.5 מ"מ
דטרגנט המתאים צריכה להיקבע באופן אמפירי צריך להיות זהה לזה המשמש את המתכונים חוצץ אחרים תמוגה.

Digitonin יש להוסיף רק לפני השימוש מפתרון המניה 2% ב DH 2 O (חנות 5-ml aliquots ב -20 ° C).

פרוטאז ו phophatase לעכב-ORS יש להוסיף מיד לפני השימוש.

עם תוספת של נתרן orthova-nadate, המאגר יהפוך בצבע צהבהב.
3 BN-דיאליזה הצפת מאגר חיץ
Bis-טריס 20 מ"מ
ε-aminocaproic חומצה 500 מ"מ
NaCl 20 מ"מ
EDTA, pH 8.0 2 מ"מ
גליצרול 10%

התאם ל-pH 7.0 עם HCl. חנות ב 4 ° C.

דטרגנט
Digitonin 0.3-0.5%
או טריטון X-100 0.1%
או Brij 96 0.1%
או Dodecylmaltoside 0.1%

מעכבי פרוטאז ו phosphatase
PMSF 1 mM
נתרן orthovanadate 0.5 מ"מ
דטרגנט המתאים צריכה להיקבע באופן אמפירי צריך להיות זהה לזה ששימש מאגרים תמוגה אחרים, אבל המצוין נמוך הריכוז tions.

דטרגנט יש להוסיף צבירה טרום פורקן בשלב הערימה של ג'ל אלקטרופורזה.

פרוטאז ו phophatase לעכב-ORS יש להוסיף מיד לפני השימוש.
4 מאגר 3x BN-Gel Bis-טריס 150 מ"מ
ε-aminocaproic חומצה 200 מ"מ

התאם ל-pH 7.0 עם HCl. חנות ב 4 ° C.
5 4% הפרדת הג'ל מאגר 3x BN-Gel (מתכון 4) 5.00 מ"ל
Acrylamide / Bisacrylamide 1.50 מ"ל
DH 2 O 8.50 מ"ל
APS, 10% μL DH 2 54 O
TEMED 5.4 μL
הוסף APS ו-TEMED immedia tely לפני שמזג ג'ל, כמו ריאגנטים אלה לקדם פילמור.

מתכון זה מספיק כדי להפיל ג'ל 30 מ"ל. התאם כרכים של מספר וגודל של ג'לים נמזג.
6 15% הפרדת הג'ל מאגר 3x BN-Gel (מתכון 4) 5.00 מ"ל
Acrylamide / Bisacrylamide 5.63 מ"ל
גליצרול 70% 4.38 מ"ל
APS, 10% μL DH 2 42 O
TEMED 4.2 μL
הוסף APS ו-TEMED immedia tely לפני שמזג ג'ל, כמו ריאגנטים אלה לקדם פילמור.

מתכון זה מספיק כדי להפיל ג'ל 30 מ"ל. התאם כרכים של מספר וגודל של ג'לים נמזג.

ריכוז של bisacrylamide-acrylamide יכול להיות גם מגוונים לפי הצורך של 10% עד 18.
7 3.2% הערמה ג'ל מאגר 3x BN-ג'ל (מתכון 4) 3.00 מ"ל
Acrylamide / Bisacrylamide 0.72 מ"ל
DH 2 O 5.28 מ"ל
APS, 10% μL DH 2 120 O
TEMED 12 μL
הוסף APS ו-TEMED immedia tely לפני שמזג ג'ל, כמו ריאגנטים אלה לקדם פילמור.

מתכון זה מספיק כדי להפיל ג'ל 30 מ"ל. התאם כרכים של מספר וגודל של ג'לים נמזג.
8 קטודה הצפת Bis-טריס 15 מ"מ
Tricine 50 מ"מ
Coomassie כחול G250 0.02%

הכן 1 ליטר כמו מניה 10x, כדי להתאים את pH 7.0 עם HCl, ולאחסן ב 4 ° C.
לדלל 1:10 עם DH 2 O לפני השימוש.
אין תחליף סוגים אחרים של Coomassie לצבוע כמו Coomassie כחול R250 או colloidal בלוז Coomassie.
9 האנודה הצפת Bis-טריס 50 מ"מ

הכן 1 ליטר כמו מניה 10x, כדי להתאים את pH 7.0 עם HCl, ולאחסן ב 4 ° C.
לדלל 1:10 עם DH 2 O לפני השימוש.
10 דה מרקר Mix Aldolase (158 KD) 10 מ"ג / מ"ל
Catalase (232 KD) 10 מ"ג / מ"ל
פריטין (440 ו - 880 KD) 10 מ"ג / מ"ל
Thyroglobulin (670 KD) 10 מ"ג / מ"ל
ארגון ה-BSA (66 ו 132 KD) 10 מ"ג / מ"ל
Bis-טריס 20 מ"מ
NaCl 20 מ"מ
גליצרול 10%

התאם ל-pH 7.0 עם HCl. חנות ב 4 ° C.
סמנים משקל מולקולרי הם גם זמינים מסחרית ממספר מקורות, כולל מבחנה-gen או Pharmacia.
11 SDS מאגר דוגמאות טריס 12.5 מ"מ
SDS 4%
גליצרול 20%
כחול Bromophenol 0.02%

התאם ל-pH 6.8. כדי להפחית את חוב דיסולפיד, להוסיף 9 מ"ל β-mercaptoethanol.
SDS כאבקה ו-β-mer captoethanol רעילים. לכן, להשתמש בכפפות ולעבוד מתחת למכסה המנוע.
12 המאגר התחתון 4x טריס 1.5 M
SDS 0.4%

התאם ל-pH 8.8.
SDS כאבקה רעיל. לכן, להשתמש בכפפות ולעבוד מתחת למכסה המנוע.
13 המאגר העליון 4x טריס 0.5 M
SDS 0.4%

התאם ל-pH 6.8.
SDS כאבקה רעיל. לכן, להשתמש בכפפות ולעבוד מתחת למכסה המנוע.
14 10% הפרדת הג'ל Acrylamide (30%) 2.0 מ"ל
4x נמוך 1.5 חיץ מ"ל
DH 2 O 2.454 מ"ל
APS, 10% μL DH 2 40 O
TEMED 6 μL
הוסף APS ו-TEMED immedia tely לפני שמזג ג'ל, כמו ריאגנטים אלה לקדם פילמור.

מתכון זה מספיק כדי להפיל ג'ל 30 מ"ל. התאם כרכים של מספר וגודל של ג'לים נמזג.
15 4.8% הערמה ג'ל Acylamide (30%) 320 μL
4x למאגר העליון 500 μL
DH 2 O 1.16 מ"ל
APS, 10% ב DH 2 O 20 μL
TEMED 2 μL
הוסף APS ו-TEMED immedia tely לפני שמזג ג'ל, כמו ריאגנטים אלה לקדם פילמור.

מתכון זה מספיק כדי להפיל ג'ל 30 מ"ל. התאם כרכים של מספר וגודל של ג'לים נמזג.
16 Semidry העברת הצפת טריס 48 mM
גליצין 39 mM
מתנול 20%
SDS 0.1%

התאם את נפח 1 ליטר עם DH 2 O. אחסן בטמפרטורת החדר.
SDS כאבקה, מתנול רעילים. לכן, להשתמש בכפפות ולעבוד מתחת למכסה המנוע.

Discussion

במחקר זה, אנו מתארים את הניתוח של MPCs ידי-BN. גישה 2D משמש MPCs נפרד הראשון תחת תנאים מקומיים, ולאחר מכן להמשיך לסעף אותם רכיבים בודדים שלהם מימד שנייה SDS-PAGE.

דוגמאות מוכנים lysates מן התא. עבור solubilization של MPCs רבים, חומרי ניקוי מתאים נדרש, אשר שומרת על המבנה של קומפלקסים חלבונים. כאן, אנו משתמשים טריטון 0.1% X-100. עם זאת, חומר ניקוי אופטימלי ריכוז מתאים שלה צריך להיקבע באופן אמפירי לכל MPC. במקרה של טריטון X-100, למשל, זה כבר דווח כי ריכוזים נמוכים אבקת לאפשר זיהוי של צורה dimeric של F 1 F 0-ATPase מורכבות (ארנולד, פייפר et al. 1998). גבוהה טריטון X-100 ריכוזים, לעומת זאת, להוביל ניתוק של dimer ועל גידול מקביל של monomeric ה-F 1 F 0-ATPase מורכבים. זו עולה בקנה אחד עם המחקרים הקודמים שלנו, היינו מראים כי מורכבות multivalent T-cell receptor (TCR) נשמר בעת חילוץ עם ריכוזים נמוכים של Brij 96, ואילו את השימוש של ריכוז גבוה של חומר ניקוי או אחרת בשם התוצאות digitonin ב מיצוי של monomeric TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). דטרגנטים בשימוש נפוץ שניתן לבדוק כוללים digitonin (0.5-1%), טריטון X-100 (0.1-0.5%), Brij 96 (0.1-0.5%), או dodecylmaltoside (0.1-0.5%). ריאגנטים אלה הם חומרי ניקוי nonionic, אשר נוטים להיות הטוב ביותר עבור יציבות MPC. להיות מודעים לכך קשר עם SDS וחומרי ניקוי חזקים אחרים יש להימנע (קמאצ'ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004).

דיאליזה של lysates נדרש כדי להשיג הפרדה MPC בתוך הג'ל-BN (קמאצ'ו-קארוואחאל, Wollscheid et al 2004).; (Heiss, Junkes et al 2005).. נראה כי התאמה של ריכוז מלח או הסרת זיהומים נמוך משקל מולקולרי הוא קריטי עבור ברזולוציה גבוהה. ראוי לציין כי גם ההכנות הממברנה MPCs, אשר היו immunopurified ו eluted מאוחר יותר מן הנוגדן, מתאימים PAGE-BN (סוואמי, Siegers et al. 2006). בשני המקרים, הדגימות לא צריך להיות dialyzed להפרדה BN-PAGE, אם תמוגה קרום או elution מתבצעת חיץ BN-תמוגה.

עבור הפרדה חלבון על ידי-BN, Coomassie את הצבע הכחול יש צורך, אשר נקשר לחלבונים unspecifically ומכסה אותם עם מטענים שליליים. ובכך, Coomassie כחול מאפשרת ניידות electrophoretic של חלבונים לכיוון הקתודה ב-pH נייטרלי (Schägger ו פון יגוב 1991); (Schägger, קריימר et al 1994).. יתר על כן, Coomassie כחול מונע הצטברות חלבון הג'ל לערום במהלך אלקטרופורזה. עבור PAGE-BN, Coomassie G250 יש להשתמש במקום Coomassie כחול R250 או colloidal בלוז Coomassie.

לפני הפעלת BN-ג'ל, זה הכרחי על מנת להבטיח כי אחוז הג'ל מתאים לגודל הצפוי של MPC של עניין. Precast BN-ג'לים עם מילויים שונים מאגרים מתאימים זמינים מסחרית מן Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-טריס מערכת ג'ל). אבל BN-ג'לים יכול גם להיות מוכנים באמצעות מערבל צבע יחד עם משאבה persistaltic. כדי להבטיח שיפוע תקין, הנוזל צריך לזרום ללא הרף במהלך לשפוך ובועות יש להימנע. אנו ממליצים על הטעינה של דילולים מדגם שונה על הג'ל מפני עומס יתר יכול להוביל משקעים חלבון בתהליך אלקטרופורזה. בנוסף, BN-ג'לים יש לרוץ 4 ° C כדי למנוע פירוק חלבונים ולשמור MPCs ללא פגע.

לאחר BN-PAGE, ויזואליזציה של MPCs ניתן להשיג על ידי מכתים Coomassie כחול מבריק, כסוף או מכתים immunoblotting. להקות חלבון דמיינו ידי מכתים Coomassie או כסף מתאימים לניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה (קמאצ'ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004). במקרה של immunoblotting, תנאי ההעברה האופטימלי עבור MPCs העניין צריך להיקבע באופן אמפירי. שים לב Coomassie כחול מועבר גם במהלך סופג של ג'ל-BN. לכן, ג'ל יהיה חסר צבע לאחר העברת מוצלח, ואילו הממברנה יפעילו צבע כחול. יתר על כן, חשוב לציין כי לא כל נוגדן ראשוני, הפועלת לאיתור לאחר SDS-PAGE, הוא ישים immunoblotting על PAGE-BN. זה יכול לקרות כי הנוגדנים אינם מכירים MPC עניין כי epitope שלהם טמון קונפורמציה הילידים של החלבונים. כדי להתגבר על בעיה זו, אפשר לפגל את החלבונים בתוך הג'ל-BN לפני ההעברה על ידי הרתחת ג'ל בקרוב חיץ מדגם SDS 1x.

בדוגמה שלנו, אנו לא הנושא BN-ג'ל ישירות זיהוי של להקות חלבון. במקום זאת, אנו עוד חילקו את BN-PAGE מופרד lysate ידי dimensi secondעל SDS-PAGE. במימד השני SDS ג'ל, חלבונים monomeric נודדים בתוך אלכסוני היפרבולי בשל הג'ל הדרגתי במחצית הראשונה ואת ג'ל ליניארי בממד השני (קמאצ'ו-קארוואחאל, Wollscheid et al. 2004). זה מאפשר זיהוי קל של MPCs, שכן הם נקודתיים מתחת זה אלכסונית היפרבולי. המשנה ברורה של אחד MPC מופרדים בקו אנכי בממד השני SDS-PAGE. רכיבי כי הם המרכיבים של MPCs dinstinct כמה ניתן לזהות על קו אופקי בהתאם לגודל של MPC. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי מספר המקומות חלבון המופיע בשורה אחת אנכי יכול להיות גם חלק מתחמי נפרד להעביר בעמדה זהה PAGE-BN. ההוכחה הסופית שהם נמצאים MPC אותו ניתן להשיג על ידי נוגדן מבוססי assay משמרת ג'ל. ב assay זה, lysate הסלולר הוא מודגרות עם נוגדן כנגד חלבון מיוצג על ידי אחד המקומות המזוהים לפני PAGE-BN. התוצאה היא שינוי של כל MPCs המכילים חלבון זה כלפי מסה מולקולרית גבוהה בממד הראשון. חלבונים אחרים הם גם חלק MPCs אלה יעברו שינוי זה מורכב ספציפיים ולכן הם קל לזהות בממד השני SDS ג'ל.

לא רק בהרכב MPCs ניתן לנתח על ידי-BN, אלא גם את הנחישות של stoichiometry שלהם הוא אפשרי (Schamel ו Reth 2000); (Schamel 2001), (סוואמי, Minguet et al 2007).. לענין זה, assay NAMOS (יליד נוגדן מבוססי assay ניידות במשמרת) יכולה להתבצע. כמו נוגדן מבוססי assay משמרת ג'ל, lysates הסלולר מודגרת עם ספציפי למקטע נוגדנים חד שבטיים. זה מוביל אינדוקציה של immunoshifts electrophoretic ב BN-ג'לים, המאפשרים היקש מן מידת השינוי על stoichiometry של MPCs

ב conlusion, BN-PAGE מתאים לזיהוי MPCs וקביעת הרכב שלהם, הגודל, כמו גם השפע היחסי. בביצוע כמו assay NAMOS, היא מציעה גם את האפשרות לקבוע את stoichiometry של MPC מסוימים. לאור תחולתה הכללית שלה, טכניקה זו היא כלי מאוד שימושי לאפיון של MPCs (דקר, מולר ואח' 1996.); (Wittig ו Schagger 2008); (וגנר, Rehling et al 2009).; (Wittig ו Schägger 2009) .

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

אנו מודים מיכאל Reth, הרמן Schägger, ומרגריטה קמאצ'ו-קארוואחאל תמיכה מדעית. עבודה זו מומנה על ידי FORSYS מן fuer Bundesministerium Bildung ו Forschung (BMBF), על ידי BIOSS מן Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), ו נתמך בחלקו על ידי יוזמת מצוינות של ממשלות פדרליות ואת המדינה הגרמנית (GSC-4, Spemann בית הספר למוסמכים ).

References

  1. Arnold, I., Pfeiffer, K. Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits. EMBO J. 17, (24), 7170-7178 (1998).
  2. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 3, (2), 176-182 (2004).
  3. Heiss, K., Junkes, C. Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells. Proteomics. 5, (14), 3614-3622 (2005).
  4. Sali, A., Glaeser, R. From words to literature in structural proteomics. Nature. 422, 216-225 (2003).
  5. Schägger, H., Cramer, W. A. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217, (2), 220-230 (1994).
  6. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem. 199, (2), 223-231 (1991).
  7. Schamel, W. W. Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE. J Immunol Methods. 252, (1-2), 171-174 (2001).
  8. Schamel, W. W., Arechaga, I. Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response. J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).
  9. Schamel, W. W., Reth, M. Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor. Immunity. 13, (1), 5-14 (2000).
  10. Swamy, M., Minguet, S. A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes. J Immunol Methods. 324, (1-2), 74-83 (2007).
  11. Swamy, M., Siegers, G. M. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci STKE. 2006, (345), 4-4 (2006).
  12. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).

Comments

12 Comments

  1. Dear All,

    I found this article quite interesting and useful. Thanks for the providing the information in such a wonderful way.

    Regards,
    GAnesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2011 - 5:12 PM
  2. Why can not I see the video...? please help me..

    Regards,
    Jalal

    Reply
    Posted by: JALAL A.
    July 10, 2011 - 1:39 AM
  3. Please email us at support@jove.com and we will be glad to help you out. Please make sure that you have the latest version of Flash installed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 12:03 PM
  4. Hi Britta, you guys did a wonderful job in explaining something rather elaborate. Hiowever, I would like to ask some questions:
    1. the 30 ml gel referred in the Swamy, M.,et al ²006 paper is the large or small gel? Which by the way is another good and clear paper way better than that protocol from Nature protocols Wittig et al, ²006.
    ². Yesterday I poured a 30 ml gel and got the samples in at 100 volts (with 0.01 A) howerver it only run a third of the gel and current went down to 0.00 and it stopped there (gel: 11 cm x 16 cm x 1.5 mm). Why is this and how can I fix it? Rosa Bermudez from Molecular Biology Department (MeXICO).

    Reply
    Posted by: Rosa B.
    October 5, 2011 - 6:26 PM
  5. I think the buffer of upper chamber was leaked down into the down chamber, hence the current was stopped. You can fix it by using a pomade. Also you can pour the extra buffer in upper chamber by using a syringe.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2011 - 4:40 AM
  6. Your service is awesome! thank you very much, i really apreaciate this!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 3, 2012 - 10:27 AM
  7. I have ² very VERY important comments that literally 5 minutes ago ruined my extracted samples. I think the video/paper needs to more STRONGLY point to them:
    1. DRY DRY DRY DRY the wells VERY VERY VERY well!!! If you have even the tiniest amount of liquid the sample will LEAK into the next well AND THE NEXT!!! Basically initially i had semi-dry well and from Well 1 leaked up to WELL 4. everything was contaminated. THEN I got a new gel and dried them with an aspirator SUPER WELL....guess what in 3 minutes well 1 was already slowly creeping into well ² and 3. SOOOOO I would suggest to follow the FILL-WELLS-WITH-CATHODE Buffer (no coomassie version)-METHOD. Otherwise it will leak everywhere. I have no idea how this did not happen in this video or they simply brushed over it soooo quickly and u cannot see it.
    ². Secondly, when you put the Cathode buffer everything is VERY BLUE!!!! I have no idea how are they able to say "when the samples have entered the gel". this is very hard to see. maybe their room is very well lit with but my cold room is not that great and everything looks dark blue and nothing I can see. U have to keep this in mind to maybe bring a light.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 6:21 PM
  8. Dear K
    thanks for your interest in our protocol and your comments.
    Regarding your comments:
    1. Loading your samples dry into empty wells should not cause them to leak into neighbouring wells. This might only happen in case your wells were filled with liquid (as the BN buffer, in contrast to SDS sample buffer, dŒs not cause the sample to sink into the well). As shown in the video in our lab we remove the comb and load directly into the empty lanes without washing them or anything. I suggest you to check whether the wells themselves are fine after removing the comb. Additionally you should make sure to fill same volumes into every single well, use BN-lysis buffer for wells without sample.
    ². It is true that everything seems to be very blue after addition of blue cathode buffer into the inner chamber. Still, with some practice you will be able to identifiy the running front of your gel without any problems. Focus on the left and right side of the gel, where the glass plate of the gel is pressed onto the rubber of the running chamber. There you can easily see the staight line of the running front as the background is of the coulour of the rubber and not blue due to the buffer. You could also carefully remove the blue cathode buffer from the inner chamber using a pipette.
    Good luck for your next Blue Native!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 24, 2012 - 8:47 AM
  9. Thank you for the great reply. It is true that a blue front can be seen but veeeeeeeery slightly. Also eventually there are ² fronts. FIRST: between the transparent gel and the dark blue and SECONDLY: between the dark blue and the lighter blue buffer. Many papers say "stop eletrophoresis when the front reaches the bottom" I guess I assume this to be when the gel is completely BLUE. So I should ignore the second front?

    In addition, I am very curious about performing a Western directly after the Blue NATIVE. The procedure described here is after the ²D SDS which is different I think. I tried to find protocol for Western immediately after BN-Native but nothing online seems too clear. There are several differenced that I am trying to figure out. For example: the PVDF is completely stained, so how exactly do I destain it (I dont want to use too much acid etc.). Also, somewhere I read that NO BSA blocking step is necessary when doing BN-Native + PVDF membrane. Those are just a few questions that I have.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 31, 2012 - 3:32 PM
  10. For performing Western directly after 1st dimension BN-PAGE I recommend you to use the semidry system and normal transfer buffer. Of course your gel will be blue, but depending on what you do afterwards that is not a problem (e.g. immunodetection). To have a lighter blue gel you could also exchange blue cathode buffer with colorless cathode buffer during gel run as soon as your samples entered the separating gel.
    Blocking is still necessary! After transfer the membrane should be handeled normally. Please see also Swamy et al. ²006.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 3:31 AM
  11. Actually, you don't need to be worried about when to stop the run. According to the original paper [please find Anal. Biochem. ²17(²), ²²0-²30 (1994)], the pore-size distribution determines the individual migration ends of proteins. You could just run until the current stop (your power supply may show an error signal). Everything that could be separated in your gel will be stay at their own sites.

    Reply
    Posted by: Yeh-Lin L.
    February 3, 2012 - 2:58 AM
  12. Thank you so much for your replies. I still have some strange results.
    1. I noticed that in the Swamy et al ²006 paper you suggested to me and also the video here, your samples are TRANSPARENT, however the original Wittig and other papers have their sample with Coomassie Blue prior to loading. resulting in very very blue samples. I do not know if this is an issue.
    ². However when I run the sample they definitely remain as very very thick blue spots on my gel.
    3. Also, I run gel 1h then increase to 150-170V for another ²+ hours, the dark blue front reaches the bottom SORT OF (look at image), the thick BLUE spots are very visible, and also the upper half of the gel is lighter because of the second lighter cathode buffer. But I never get such a CLEAR and perfect line like yours. My DARK blue part of the gel remains there and as you see underneath the big blue spots there is nothing.
    PLEASE look at the image: http://tinypic.com/view.php?pic=110kcxh&s=5 (look at lanes 3-4-5)

    I am just confused, do I have too much sample. Why do I have such enormous blue spots very clearly visible. My proteins are transmembrane proteins that are very very highly over-expressed. Maybe I should load less? They should be sizes 60kDa, 90kDa at 150kDa. I am using the Bio-rad pre-casted Tris-HCl gels 4-15%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 10:19 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics