Blå Native polyakrylamidgelelektrofores (BN-PAGE) för analys av Multiproteinkomplex från Cellular Lysates

* These authors contributed equally
Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

I denna video beskriver vi karakterisering av Multiproteinkomplex (Medelhavsländerna) med blå infödda polyakrylamidgelelektrofores (BN-sida). I en första dimension är dialyseras cellulära lysates åtskilda av BN-PAGE att identifiera enskilda partnerländerna. I en andra dimension SDS-PAGE är Medelhavsländerna av intresse indelade för att analysera sina väljare genom att immunoblotting.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates. J. Vis. Exp. (48), e2164, doi:10.3791/2164 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multiproteinkomplex (Medelhavsländerna) spelar en viktig roll i cellsignalering, eftersom de flesta proteiner finns i funktionella eller reglerande komplex med andra proteiner (Sali, Glaeser et al. 2003). Därför kräver studier av protein-protein växelverkan nätverken en detaljerad karakterisering av Medelhavsländerna att få en integrerad förståelse av proteiners funktion och reglering. För identifiering och analys måste Medelhavsländerna separeras i enlighet med infödda förhållanden. I denna video beskriver vi en analys av Medelhavsländerna med blå infödda polyakrylamidgelelektrofores (BN-sida). BN-PAGE är en teknik som möjliggör separation av Medelhavsländerna i en infödd konformation med en högre upplösning än erbjuds av gelfiltrering eller sackaros densitet ultracentrifugering, och är därför lämpligt att bestämma MPC storlek, sammansättning och relativa förekomst (Schägger och von Jagow 1991) , (Schägger, Cramer et al 1994.). Genom denna metod är proteiner separeras efter sina hydrodynamiska storlek och form i ett polyakrylamid matris. Här visar vi analys av Medelhavsländerna av totala cellulära lysates och påpekade att lysat dialys är den avgörande steg för att göra BN-PAGE är tillämpliga på dessa biologiska prover. Med en kombination av första dimensionen BN-och andra dimensionen SDS-PAGE, visar vi att Medelhavsländerna åtskilda av BN-PAGE ytterligare kan delas upp i sina enskilda beståndsdelar med SDS-PAGE. Visualisering av MPC komponenterna på gel separation utförs av standard immunoblotting. Som ett exempel på MPC analys av BN-PAGE, valde vi väldefinierad eukaryota 19S, 20S och 26S proteasomer.

Protocol

** Denna video Protokollet är baserat på en tillhörande publikation 1: Blå Native polyakrylamidgelelektrofores (BN-sida) för identifiering och analys av Multiproteinkomplex. Mahima Swamy, Gabrielle M. Siegers, Susana Minguet, Bernd Wollscheid, och Wolfgang WA Schamel. Vetenskapens STKE 2006 (345): PL2, July 25, 2006, [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. Klicka här för att se denna publikation .

1. Beredning av dialyseras cell lysat

  1. Harvest 10x10 6 celler och pellets genom centrifugering vid 350g i 5 min vid 4 ° C.
  2. Tvätta cellpelleten tre gånger med 1 ml iskall PBS (recept 1), centrifug som i steg 1,1.
  3. Resuspendera pelleten i 250 mikroliter av iskall BN-lyseringsbuffert (recept 2) och inkubera på is i 15 min.
  4. Centrifugera vid 13 tusen gi 15 minuter vid 4 ° C för att avlägsna olösliga material.
  5. Smält ett hål i locket på en 1,5-mL mikrocentrifugrör med uppvärmda stor diameter sidan av en pasteurpipett, därefter placera röret på is för att kyla ned till 4 ° C.
  6. Överför supernatanten från steg 1,4 i kylda röret med hålet i locket.
  7. Placera en dialysmembran (molekylvikt cut-off på 10 kD) med tång ovanpå öppnade röret, stäng locket och skär bort överflödig dialysmembran som sticker ut.
  8. Täta locket på sidan noga med Parafilm.
  9. Vänd rören och centrifugera upp och ner på lägsta möjliga hastighet i en 50 ml E-rör i en cellkultur centrifugera i 10 sek vid 4 ° C. Ta bort den inverterade röret från centrifugen använda pincett för att undvika att vrida på sidan röret ända upp.
  10. Förbered en 100-ml bägare med kallt BN-Dialys Buffer (recept 3) och ett rör tallrik. Använd minst 10 ml av BN-Dialys buffert per 100-mikroliter prov.
  11. Fäst röret med tejp upp och ner inne i bägaren, och ta bort luftbubblor från hålet under locket med hjälp av en böjd pasteurpipett.
  12. Placera bägaren på toppen av en magnet omrörare, slå på omröraren och lämna det i 6 timmar eller över natten i kylrum. Kontrollera då och då för att säkerställa att omrörning inte skapa luftbubblor vid dialysmembran.
  13. Samla dialyseras cell lysat i en ny kyld mikrocentrifugrör.

2. Hälla av BN-geler

  1. Toning gel hälla sker vid rumstemperatur med en lutning mixer. Handskar ska användas eftersom polyakrylamid är mycket neurotoxiskt. Undvik kontakt med SDS.
  2. Placera lutning blandaren på en uppståndelse tallrik och bifoga det till en bit av slangar. Stäng kanal med ventilen och stäng slang med en klämma. Placera en magnetomrörare 15% in i "hög" cylindern är ansluten till slangen.
  3. Trä slangar till en peristalitic pump och koppla en spruta nålen i dess slut. Sedan placera nålen mellan två glasskivor i gelen apparaten.
  4. Förbered 4% (recept 5) och 15% (recept 6) separera gel lösningar, lägga APS och TEMED omedelbart före användning. Den kombinerade volymerna bör vara lika med volymen på separera gel.
  5. Häll dessa gel-lösningar till motsvarande cylindrar av gradienten mixern (4% i "låg" och 15% i den "höga" cylinder).
  6. Öppna ventilen och tvinga ut luftbubbla inuti kanalen som förbinder två gelen reservoarerna genom att trycka på den vänstra cylindern med tummen.
  7. Slå på magnetomrörare, ta bort klämman, och slår på peristalitic pumpen till 5 ml per minut. Låt gelen långsamt flöde mellan glasplåtar. Se till att nålen alltid är ovanför vätskan.
  8. Låt all vätska komma in i gelen apparater, och sedan overlay försiktigt med isopropanol. Låt gelen polymerisera i minst 30 minuter vid rumstemperatur.
  9. Rengör hälla apparaten omedelbart med dH 2 O (använd inte diskmedel).
  10. Ta bort isopropanol, tvätta med dH 2 O, och ta bort dH 2 O med en Whatman papper.
  11. Bered en 3,2% stapling gel (recept 7), lägga APS och TEMED omedelbart före användning.
  12. Häll stapling gelen ovanpå separera gel och införa kammen mellan glasskivor, undvika bubblor. Efter att stapla gelen har polymeriserade, kyler gelen ner till 4 ° C.
  13. Omedelbart före provet lastning, ta bort kammen långsamt, dra ut den i en vinkel till planet av gelen. Detta tillåter luft att komma in i fickorna snabbt, vilket förbättrar kvaliteten på brunnarna.

3. Separation av dialyseras cell lysat av BN-PAGE

  1. Ladda 1 till 40 mikroliter av dialyseras lysat och 10 till 20 l Marker Mix (recept 10) i de torra brunnar vid 4 ° C. Overlay proverna i varje brunn med kallkatodrör Buffer (recept 8).
  2. Fyll den inre kammaren med kallt kattHode buffert och den yttre / nedre kammaren med kallt Anod Buffer (recept 9).
  3. Tillsätt 100 V till en MiniGel eller 150V till stor gel, tills proverna har kommit in i separera gel. Kör gelen vid 4 ° C.
  4. Öka spänningen till 180 V (MiniGel) eller 400 V (stora gel) och kör tills färgen når slutet av gelen. Den drivs tar 3 till 4 timmar för en mini-, och 18 till 24 timmar för en stor gel.

4. Den andra dimensionen SDS-PAGE

  1. Förbered en standard 10% SDS-gel (recept 12-15) med en enda stor fil för första dimensionen BN-PAGE körfält, en ordinarie körfält för molekylviktsmarkör, och en ordinarie körfält för en delmängd av dialyseras lysat som har blandats med SDS prov buffert (recept 11) och kokas i 5 min vid 95 ° C. Använd distanser vars tjocklek ökade med två lager av tejp för att förenkla lastning av BN-PAGE gel bit in på SDS gel.
  2. Ta bort BN-PAGE gel i plåtar från elektrofores apparater och försiktigt bända upp en tallrik.
  3. Ta bort stapling gelen och klipp ut körfält i BN-PAGE gel som innehåller proteiner av intresse.
  4. Placera BN-PAGE gel skiva i 2x SDS Exempel buffert och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
  5. Koka BN-PAGE kort gel slice (inte mer än 20 sek) i en mikrovågsugn.
  6. Inkubera BN-PAGE gel bit i den heta SDS Sample buffert för ytterligare 15 minuter i rumstemperatur.
  7. Ladda BN-PAGE gel bit i det stora såväl över stapla gel för SDS-PAGE gel undviker luftbubblor, och overlay segmentet med SDS Sample buffert. Ladda markör och lysat kontroll.
  8. Utför elektrofores enligt standardprotokoll.

5. Upptäckt av MPC subenheter av immunoblotting

  1. För överföring, förbereda sex Whatman papper och en PVDF membran passar till storleken på SDS-gel.
  2. Inkubera PVDF membran i 100% metanol i 30 s och blötlägga Whatman tidningarna i överföring buffert (recept 16).
  3. Placera tre Whatman papper, de PVDF membran, SDS-gel (ta bort stapling gel), och återigen tre Whatman papper i en sandwich-liknande struktur i en halvtorra överföring cell.
  4. Ansök 20 V för 25 min.
  5. Identifiera proteiner enligt standard immunoblotting protokoll.

6. Representativa resultat

Vi presenterar analysen av den eukaryota 19S, 20S och 26S proteasomer som ett exempel för MPC karakterisering av 2D-BN / SDS-PAGE (Figur 1A). HEK293 celler lyseras med en buffert som innehåller 0,1% Triton X-100 som ett rengöringsmedel att störa membran och löses komplex membranprotein. Dessa lysates var dialyseras mot BN-Dialys buffert för att ta bort salter och små metaboliter. Då var Medelhavsländerna separerade med 4-15% lutning BN-PAGE följt av en andra dimension SDS-PAGE. Proteiner visualiseras genom immunoblotting med antikroppar mot subenheter β2 och Mcp21 av 20S proteasom.

Figur 1
Figur 1. En tvådimensionell BN-PAGE/SDS-PAGE tillvägagångssätt och använda cellulär lysates. (A) Flödesdiagram för en 2D BN-PAGE/SDS-PAGE strategi från cellulära lysates. (B) Schematisk ordning med en 2D BN-PAGE/SDS-PAGE. Proteiner och Medelhavsländerna är separerade i modersmål förhållanden av BN-sida i en första dimensionen. För den andra dimensionen, proteiner och / eller Medelhavsländerna är denatureras av SDS i gelen band efter separationen av BN-PAGE och därefter utsatts för SDS-PAGE. Monomera proteiner kommer att migrera i en hyperbolisk diagonal på grund av lutningen gel i den första och en linjär gel i den andra dimensionen. Komponenter i ett konkret MPC kommer att hittas under diagonalen, belägen på en lodrät linje.

Det har visat sig att genom en kombination av första dimensionen BN-och andra dimensionen SDS-PAGE, monomera proteiner vandrar i en hyperbolisk diagonal på grund av lutningen gel i den första och den linjära gel i andra dimensionen ((Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004),. Figur 1B). Komponenter i Medelhavsländerna är placerade under denna diagonala. Proteiner som representerar subenheter av samma MPC kan hittas i en vertikal linje i den andra dimensionen, medan flera fläckar av samma protein i en horisontell linje indikerar närvaro av protein i flera olika Medelhavsländerna. Figur 2 visar att i våra experiment immunoblotting mot β2 och Mcp21 visade förekomst av specifika proteinkomplex som innehåller dessa proteasomal subenheter. Båda proteiner detekteras som enskilda fläckar ordnade i en horisontell linje, vilket indikerar att β2 och Mcp21 representerar beståndsdelar av flera olika Medelhavsländerna. Dessa Medelhavsländerna tydligt kunde identifieras som den 26S proteasom (20S plus 19S CAP), den 20S proteasom tillsammans med det föreskrivande subenheten PA28 och 20S proteasomer ensam, på grund av deras storlek och sammansättning. Sammantaget resuLTS visa att endogena Medelhavsländerna kan identifieras och kännetecknas av en tvådimensionell BN-PAGE/SDS-PAGE tillvägagångssätt och använda cellulära lysat. Denna metod är tillämplig för bestämning av storlek, sammansättning, och relativ förekomst av Medelhavsländerna.

Figur 2
Figur 2. Detektering av olika former av eukaryota proteasom med immunoblotting efter två-dimensionella BN-PAGE/SDS-PAGE. För identifiering och analys av eukaryota proteasomer var HEK293-celler lyseras med 0,1% Triton X-100. Cellular lysates var dialyseras och därefter utsatts för BN-PAGE (4-15%) för att separera partnerländerna. Efteråt var en andra dimensionen SDS-PAGE (10%) kör för storlek separation av enskilda delkomponenter. Immunoblotting utfördes med specifika antikroppar erkänna Mcp21 och β2 subenheten av 20S kärna komplexa, och det föreskrivande subenheten PA28.

I. Tabell över specifika reagenser (alfabetisk ordning):

Reagens Företag Kommentarer
6-aminohexanoic syra
(Ε-Aminokapronsyra)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland Denna kemikalie är ett irriterande och bör hanteras med handskar.
Akrylamid-bisacrylamide-lösning (40%), blanda 32:1 Industry, Darmstadt, Tyskland Denna lösning är neurotoxiskt och bör hanteras med handskar.
Bis-tris Roth, Karlsruhe, Germa-NY
Brij 96 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland
Coomassie blå G250 Serva, Heidelberg, Tysk- Byt inte ut andra typer av Coomassie färgämne som Coomassie blå R250 eller kolloidalt Coo-Massie blues.
Digitonin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland Digitonin är giftigt. Handskar ska användas vid hantering av buffertar eller prover som innehåller detta tvättmedel.
Dodecylmaltoside Industry, Darmstadt, Tyskland
Triton X-100 Roth, Karlsruhe, Germa-NY Triton X-100 är giftig. Handskar ska användas vid hantering av buffertar eller prover som innehåller denna diskmedel.

II. Tabell över specifika material och utrustning:

Utrustning Företag
Dialysmembran (molekylvikt cut-off från 10 till 50 kD) Roth, Karlsruhe, Tyskland
Gelelektrofores systemet Till exempel från Bio-Rad, München, Tyskland
Gradient mixer Self-made eller kommersiellt tillgängliga från Bio-Rad, München, Tyskland
Peristaltiska pumpen Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Tyskland
Polyvinylidenfluorid (PVDF) membran Immobilon-P, Millipore, Eschborn, Tyskland
Halvtorr överföra utrustning Till exempel från Bio-Rad, München, Tyskland
Silicon slang (3 till 5 mm diameter, 1 m längd) NeoLab, Heidelberg, Tyskland

III. Tabell över recept:

Nej. Buffertar och lösningar Innehåll Kommentarer
1 Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) Na 2 HPO 4 8,1 mMKH 2
PO 4 1,5 mm
NaCl 138 mm
KCl 2,7 mM
Lösningen ska vara pH 7,4 om tillreds på rätt sätt.
2 BN-lyseringsbuffert Base buffert
Bis-tris 20 mM
ε-Aminokapronsyra 500 mm
NaCl 20 mM
EDTA, pH 8,0 2 mM
Glycerol 10%

Justera pH till 7,0 med HCl. Förvaras vid 4 ° C.

Tvättmedel
Digitonin 0,5 till 1,0%
eller Brij 96 0,1 till 0,5%
eller Triton X-100 från 0,1 till 0,5%
eller Dodecylmaltoside 0,1 till 0,5%

Proteas och fosfatas hämmare
Aprotinin 10 mikrogram / ml
Leupeptin 10 mikrogram / ml
PMSF 1 mM
Natriumfluorid 0,5 mM
Natrium orthovanadate 0,5 mM
Lämplig tvättmedel måste bestämmas empiriskt och bör vara densamma som används i andra recept lyseringsbuffert.

Digitonin måste läggas strax före användning av ett 2% stamlösning i dH 2 O (butik i 5-ml alikvoter vid -20 ° C).

Proteas och phophatase hämma-orer bör läggas omedelbart före användning.

Vid tillsats av natrium orthova-nadate kommer bufferten bli gulaktig i färgen.
3 BN-Dialys Buffer Base buffert
Bis-tris 20 mM
ε-Aminokapronsyra 500 mm
NaCl 20 mM
EDTA, pH 8,0 2 mM
Glycerol 10%

Justera pH till 7,0 med HCl. Förvaras vid 4 ° C.

Tvättmedel
Digitonin 0,3 till 0,5%
eller Triton X-100 0,1%
eller Brij 96 0,1%
eller Dodecylmaltoside 0,1%

Proteas och fosfatas hämmare
PMSF 1 mM
Natrium orthovanadate 0,5 mM
Lämplig tvättmedel måste bestämmas empiriskt och bör vara densamma som används i andra lys buffertar, men visade lägre halter.

Diskmedel måste läggas för att förebygga aggregering vid stapling steg av gelelektrofores.

Proteas och phophatase hämma-orer bör läggas omedelbart före användning.
4 3x BN-Gel Buffer Bis-tris 150 mm
ε-Aminokapronsyra 200 mm

Justera pH till 7,0 med HCl. Förvaras vid 4 ° C.
5 4% Separera Gel 3x BN-Gel Buffer (recept 4) 5,00 ml
Akrylamid / Bisacrylamide 1,50 ml
dH 2 O 8,50 ml
APS, 10% i dH 2 O 54 mikroliter
TEMED 5,4 mikroliter
Lägg APS och TEMED omedel-tely innan det hälls gel, eftersom dessa reagenser främjar polymerisation.

Detta recept är tillräckligt för att kasta en 30-ml gel. Justera volymen för antalet och storleken på de geler hälls.
6 15% Separera Gel 3x BN-Gel Buffer (recept 4) 5,00 ml
Akrylamid / Bisacrylamide 5,63 ml
Glycerol 70% 4,38 ml
APS, 10% i dH 2 O 42 mikroliter
TEMED 4,2 mikroliter
Lägg APS och TEMED omedel-tely innan det hälls gel, eftersom dessa reagenser främjar polymerisation.

Detta recept är tillräckligt för att kasta en 30-ml gel. Justera volymen för antalet och storleken på de geler hälls.

Koncentrationen av akrylamid-bisacrylamide kan också varieras efter behov 10-18%.
7 3,2% Stapling Gel 3x BN-gel Buffer (recept 4) 3,00 ml
Akrylamid / Bisacrylamide 0,72 ml
dH 2 O 5,28 ml
APS, 10% i dH 2 O 120 mikroliter
TEMED 12 mikroliter
Lägg APS och TEMED omedel-tely innan det hälls gel, eftersom dessa reagenser främjar polymerisation.

Detta recept är tillräckligt för att kasta en 30-ml gel. Justera volymen för antalet och storleken på de geler hälls.
8 Cathode Buffer Bis-tris 15 mm
Tricine 50 mM
Coomassie blå G250 0,02%

Bereda 1 liter som en 10x lager, justera pH till 7,0 med saltsyra, och förvara vid 4 ° C.
Späd 1:10 med dH 2 O före användning.
Byt inte ut andra typer av Coomassie färgämne som Coomassie blå R250 och kolloidalt Coomassie blues.
9 Anod Buffer Bis-tris 50 mM

Bereda 1 liter som en 10x lager, justera pH till 7,0 med saltsyra, och förvara vid 4 ° C.
Späd 1:10 med dH 2 O före användning.
10 Marker Mix Aldolase (158 kD) 10 mg / ml
Katalas (232 kD) 10 mg / ml
Ferritin (440 och 880 kD) 10 mg / ml
Tyreoglobulin (670 kD) 10 mg / ml
BSA (66 och 132 kD) 10 mg / ml
Bis-tris 20 mM
NaCl 20 mM
Glycerol 10%

Justera pH till 7,0 med HCl. Förvaras vid 4 ° C.
Molekylvikt markörer finns också kommersiellt tillgängliga från flera källor, inklusive in vitro-gen eller Pharmacia.
11 SDS Exempel Buffer Tris 12,5 mm
SDS 4%
Glycerol 20%
Bromfenolblått 0,02%

Justera pH till 6,8. För att minska disulfide obligationer, lägga till 9 ml β-merkaptoetanol.
SDS som pulver och β-mer-captoethanol är giftiga. Använd därför handskar och arbeta under en huva.
12 4x lägre buffert Tris 1,5 M
SDS 0,4%

Justera pH till 8,8.
SDS som ett pulver är giftigt. Använd därför handskar och arbeta under en huva.
13 4x övre bufferten Tris 0,5 M
SDS 0,4%

Justera pH till 6,8.
SDS som ett pulver är giftigt. Använd därför handskar och arbeta under en huva.
14 10% Separera Gel Akrylamid (30%) 2,0 ml
4x lägre buffert 1,5 ml
dH 2 O 2,454 mL
APS, 10% i dH 2 O 40 mikroliter
TEMED 6 mikroliter
Lägg APS och TEMED omedel-tely innan det hälls gel, eftersom dessa reagenser främjar polymerisation.

Detta recept är tillräckligt för att kasta en 30-ml gel. Justera volymen för antalet och storleken på de geler hälls.
15 4,8% Stapling Gel Acylamide (30%) 320 mikroliter
4x övre bufferten 500 mikroliter
dH 2 O 1,16 ml
APS, 10% i dH 2 O 20 mikroliter
TEMED 2 mikroliter
Lägg APS och TEMED omedel-tely innan det hälls gel, eftersom dessa reagenser främjar polymerisation.

Detta recept är tillräckligt för att kasta en 30-ml gel. Justera volymen för antalet och storleken på de geler hälls.
16 Semidry Transfer Buffer Tris 48 mm
Glycine 39 mm
Metanol 20%
SDS 0,1%

Justera volymen till 1 liter med dH 2 O. Förvara i rumstemperatur.
SDS som pulver och metanol är giftiga. Använd därför handskar och arbeta under en huva.

Discussion

I denna studie beskriver vi en analys av Medelhavsländerna av BN-PAGE. En 2D-metod används för första separata partnerländerna i modersmål förhållanden, och sedan för att ytterligare dela upp dem i sina beståndsdelar genom en andra dimensionen SDS-PAGE.

Provföremålen från cell lysates. För lösningsgörande många Medelhavsländerna, är ett lämpligt rengöringsmedel behövs, vilket bevarar proteinets struktur komplex. Här använder vi 0,1% Triton X-100. Men den optimala rengöringsmedel och dess lämplig koncentration måste bestämmas empiriskt för varje MPC. I händelse av Triton X-100, till exempel, har det rapporterats att låga tvättmedel koncentrationer möjligt att identifiera en dimeriskt form av F 1 F 0-ATPas komplex (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Högre Triton X-100 halterna dock leda till en dissociation av dimer och till en motsvarande ökning av monomera F 1 F 0-ATPas komplex. Detta är i linje med en av våra tidigare studier, vi visar att multivalenta T-cells receptor komplex (TCR) bevaras när extraheras med låga koncentrationer av Brij 96, medan användningen av högre koncentration eller en annan rengöringsmedel som heter digitonin resultat utvinning av monomera TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). Vanligt använda tvättmedel som kan testas inkludera digitonin (0,5 till 1%), Triton X-100 (0,1 till 0,5%), Brij 96 (0,1 till 0,5%), eller dodecylmaltoside (0,1 till 0,5%). Dessa reagenser är nonjoniska tvättmedel, som tenderar att vara bäst för MPC stabilitet. Var medveten om att kontakten med SDS och andra starka rengöringsmedel bör undvikas (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004).

Dialys av lysates krävs för att uppnå MPC separation i ett BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004.), (Heiss, Junkes et al 2005.). Det verkar som om justering av salthalt eller borttagande av lågmolekylära orenheter är avgörande för hög upplösning. Det är anmärkningsvärt att också membran förberedelser och Medelhavsländerna, som har immunopurified och senare elueras från antikroppar, är lämpliga för BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). I båda fallen har proverna inte dialyseras för BN-PAGE separation, om membranet lys eller upplösning sker i BN-lyseringsbuffert.

För protein separation genom BN-sida, färgen Coomassie blå behövs, som binder ospecifikt till proteiner och täcker dem med negativa laddningar. Därmed gör Coomassie blå genom elektrofores rörlighet av proteiner mot katoden vid neutralt pH (Schägger och von Jagow 1991), (Schägger, Cramer et al 1994.). Vidare förhindrar Coomassie blå proteinaggregering i staplingsordningen gelen under elektrofores. För BN-PAGE, har Coomassie G250 användas i stället för Coomassie blå R250 och kolloidalt Coomassie blues.

Innan du kör en BN-gel är det nödvändigt att säkerställa att den andel av gelen passar till den förväntade storleken på MPC av intresse. Prefabricerade BN-geler med olika lutningar och lämpliga buffertar finns kommersiellt tillgängliga från Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Men BN-geler kan också vara beredd med en lutning mixer tillsammans med en persistaltic pump. För att garantera en intakt lutning bör vätskeflödet ständigt under hälla och bubblor bör undvikas. Vi rekommenderar lastning av olika provspädningar på gelen, eftersom överbelastning kan leda till protein nederbörd under elektrofores processen. Dessutom bör BN-geler köras vid 4 ° C för att förhindra proteinnedbrytning och att hålla Medelhavsländerna intakt.

Efter BN-PAGE, visualisering av Medelhavsländerna kan uppnås genom Coomassie lysande blå färgning, silver färgning eller immunoblotting. Protein band visualiseras genom Coomassie eller silver färgning är lämpliga för vidare analys med masspektrometri (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Vid immunoblotting den optimala överföringen förutsättningarna för partnerländerna i Medelhavsområdet intresse måste bestämmas empiriskt. Var medveten om att Coomassie blå också överförs under blotting av ett BN-gel. Därför kommer gelen vara färglös efter framgångsrik överföring, medan membranet kommer att ha en blå färg. Vidare är det viktigt att nämna att inte alla primära antikroppen, som arbetar för detektion efter SDS-PAGE, är tillämplig på immunoblotting på BN-PAGE. Det kan hända att antikroppar inte känner igen MPC av intresse eftersom deras epitop är gömd i den ursprungliga konformation av proteiner. För att lösa detta problem, är det möjligt att denaturera proteiner inom BN-gel innan överföringen genom att koka gelen inom kort i 1x SDS prov buffert.

I vårt exempel har vi Utsätt inte BN-gel direkt till upptäckt av protein band. Istället delade vi ytterligare BN-page-separerade lysat av en andra dimensipå SDS-PAGE. I den andra dimensionen SDS-gel, monomera proteiner vandrar i en hyperbolisk diagonal på grund av lutningen gel i den första och den linjära gel i den andra dimensionen (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Detta gör att enkel identifiering av Medelhavsländerna, eftersom de är lokaliserade under denna hyperboliska diagonalen. Delkomponenter av en distinkt MPC separeras i en vertikal linje i den andra dimensionen SDS-PAGE. Komponenter som är beståndsdelar i flera dinstinct Medelhavsländerna kan identifieras på en horisontell linje beroende på storleken på MPC. Det har dock beaktas att flera protein fläckar visas i en vertikal linje även kan vara en del av separata komplex som vandrar på samma position i BN-PAGE. Det slutliga beviset på att de finns i samma MPC kan erhållas genom att en antikropp-baserad gel shift assay. I denna analys är cellulära lysat inkuberas med en antikropp mot ett protein som representeras av en av de identifierade platserna före BN-PAGE. Detta resulterar i en förskjutning av alla Medelhavsländerna som innehåller detta protein mot en högre molekylvikt i den första dimensionen. Andra proteiner som också är en del av dessa Medelhavsländerna kommer att genomgå denna komplexa specifika skift och är därför lätt att identifiera i den andra dimensionen SDS-gel.

Inte bara sammansättningen av Medelhavsländerna kan analyseras med BN-sida, men även fastställandet av deras stökiometri är möjlig (Schamel och Reth 2000), (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al 2007.). För detta ändamål kan en Namos analys (native antikroppsbaserade rörlighet-Shift test) utföras. Liksom i antikropps-baserade gel shift assay, är det cellulära lysates inkuberas med monoklonala subenheten-specifika antikroppar. Detta leder till induktion av elektroforetiska immunoshifts i BN-gel, som gör att slutsatsen av omfattningen av skiftet på stökiometri för Medelhavsländerna

I conlusion är BN-PAGE lämpar sig för identifiering av Medelhavsländerna och bestämning av deras storlek, sammansättning, samt relativa överflöd. Utföras som en Namos analys, erbjuder den också möjlighet att bestämma stökiometri av en viss MPC. Med tanke på dess allmänt bindande, är denna teknik ett mycket användbart verktyg för karakterisering av Medelhavsländerna (Dekker, Müller et al 1996.), (Wittig och Schagger 2008), (Wagner, Rehling et al 2009.), (Wittig och Schägger 2009) .

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar Michael Reth, Hermann Schägger och Margarita Camacho-Carvajal för vetenskapligt stöd. Detta arbete har finansierats av FORSYS från Bundesministerium für Bildung och Forschung (BMBF), genom BIOS från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), och stöds delvis av Excellence initiativ av den tyska federala och delstatliga regeringar (GSC-4, Spemann Graduate School ).

References

  1. Arnold, I., Pfeiffer, K. Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits. EMBO J. 17, (24), 7170-7178 (1998).
  2. Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 3, (2), 176-182 (2004).
  3. Heiss, K., Junkes, C. Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells. Proteomics. 5, (14), 3614-3622 (2005).
  4. Sali, A., Glaeser, R. From words to literature in structural proteomics. Nature. 422, 216-225 (2003).
  5. Schägger, H., Cramer, W. A. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217, (2), 220-230 (1994).
  6. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal. Biochem. 199, (2), 223-231 (1991).
  7. Schamel, W. W. Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE. J Immunol Methods. 252, (1-2), 171-174 (2001).
  8. Schamel, W. W., Arechaga, I. Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response. J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).
  9. Schamel, W. W., Reth, M. Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor. Immunity. 13, (1), 5-14 (2000).
  10. Swamy, M., Minguet, S. A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes. J Immunol Methods. 324, (1-2), 74-83 (2007).
  11. Swamy, M., Siegers, G. M. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci STKE. 2006, (345), 4-4 (2006).
  12. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).

Comments

12 Comments

  1. Dear All,

    I found this article quite interesting and useful. Thanks for the providing the information in such a wonderful way.

    Regards,
    GAnesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2011 - 5:12 PM
  2. Why can not I see the video...? please help me..

    Regards,
    Jalal

    Reply
    Posted by: JALAL A.
    July 10, 2011 - 1:39 AM
  3. Please email us at support@jove.com and we will be glad to help you out. Please make sure that you have the latest version of Flash installed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 12:03 PM
  4. Hi Britta, you guys did a wonderful job in explaining something rather elaborate. Hiowever, I would like to ask some questions:
    1. the 30 ml gel referred in the Swamy, M.,et al ²006 paper is the large or small gel? Which by the way is another good and clear paper way better than that protocol from Nature protocols Wittig et al, ²006.
    ². Yesterday I poured a 30 ml gel and got the samples in at 100 volts (with 0.01 A) howerver it only run a third of the gel and current went down to 0.00 and it stopped there (gel: 11 cm x 16 cm x 1.5 mm). Why is this and how can I fix it? Rosa Bermudez from Molecular Biology Department (MeXICO).

    Reply
    Posted by: Rosa B.
    October 5, 2011 - 6:26 PM
  5. I think the buffer of upper chamber was leaked down into the down chamber, hence the current was stopped. You can fix it by using a pomade. Also you can pour the extra buffer in upper chamber by using a syringe.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 6, 2011 - 4:40 AM
  6. Your service is awesome! thank you very much, i really apreaciate this!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 3, 2012 - 10:27 AM
  7. I have ² very VERY important comments that literally 5 minutes ago ruined my extracted samples. I think the video/paper needs to more STRONGLY point to them:
    1. DRY DRY DRY DRY the wells VERY VERY VERY well!!! If you have even the tiniest amount of liquid the sample will LEAK into the next well AND THE NEXT!!! Basically initially i had semi-dry well and from Well 1 leaked up to WELL 4. everything was contaminated. THEN I got a new gel and dried them with an aspirator SUPER WELL....guess what in 3 minutes well 1 was already slowly creeping into well ² and 3. SOOOOO I would suggest to follow the FILL-WELLS-WITH-CATHODE Buffer (no coomassie version)-METHOD. Otherwise it will leak everywhere. I have no idea how this did not happen in this video or they simply brushed over it soooo quickly and u cannot see it.
    ². Secondly, when you put the Cathode buffer everything is VERY BLUE!!!! I have no idea how are they able to say "when the samples have entered the gel". this is very hard to see. maybe their room is very well lit with but my cold room is not that great and everything looks dark blue and nothing I can see. U have to keep this in mind to maybe bring a light.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 23, 2012 - 6:21 PM
  8. Dear K
    thanks for your interest in our protocol and your comments.
    Regarding your comments:
    1. Loading your samples dry into empty wells should not cause them to leak into neighbouring wells. This might only happen in case your wells were filled with liquid (as the BN buffer, in contrast to SDS sample buffer, dŒs not cause the sample to sink into the well). As shown in the video in our lab we remove the comb and load directly into the empty lanes without washing them or anything. I suggest you to check whether the wells themselves are fine after removing the comb. Additionally you should make sure to fill same volumes into every single well, use BN-lysis buffer for wells without sample.
    ². It is true that everything seems to be very blue after addition of blue cathode buffer into the inner chamber. Still, with some practice you will be able to identifiy the running front of your gel without any problems. Focus on the left and right side of the gel, where the glass plate of the gel is pressed onto the rubber of the running chamber. There you can easily see the staight line of the running front as the background is of the coulour of the rubber and not blue due to the buffer. You could also carefully remove the blue cathode buffer from the inner chamber using a pipette.
    Good luck for your next Blue Native!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 24, 2012 - 8:47 AM
  9. Thank you for the great reply. It is true that a blue front can be seen but veeeeeeeery slightly. Also eventually there are ² fronts. FIRST: between the transparent gel and the dark blue and SECONDLY: between the dark blue and the lighter blue buffer. Many papers say "stop eletrophoresis when the front reaches the bottom" I guess I assume this to be when the gel is completely BLUE. So I should ignore the second front?

    In addition, I am very curious about performing a Western directly after the Blue NATIVE. The procedure described here is after the ²D SDS which is different I think. I tried to find protocol for Western immediately after BN-Native but nothing online seems too clear. There are several differenced that I am trying to figure out. For example: the PVDF is completely stained, so how exactly do I destain it (I dont want to use too much acid etc.). Also, somewhere I read that NO BSA blocking step is necessary when doing BN-Native + PVDF membrane. Those are just a few questions that I have.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 31, 2012 - 3:32 PM
  10. For performing Western directly after 1st dimension BN-PAGE I recommend you to use the semidry system and normal transfer buffer. Of course your gel will be blue, but depending on what you do afterwards that is not a problem (e.g. immunodetection). To have a lighter blue gel you could also exchange blue cathode buffer with colorless cathode buffer during gel run as soon as your samples entered the separating gel.
    Blocking is still necessary! After transfer the membrane should be handeled normally. Please see also Swamy et al. ²006.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 3:31 AM
  11. Actually, you don't need to be worried about when to stop the run. According to the original paper [please find Anal. Biochem. ²17(²), ²²0-²30 (1994)], the pore-size distribution determines the individual migration ends of proteins. You could just run until the current stop (your power supply may show an error signal). Everything that could be separated in your gel will be stay at their own sites.

    Reply
    Posted by: Yeh-Lin L.
    February 3, 2012 - 2:58 AM
  12. Thank you so much for your replies. I still have some strange results.
    1. I noticed that in the Swamy et al ²006 paper you suggested to me and also the video here, your samples are TRANSPARENT, however the original Wittig and other papers have their sample with Coomassie Blue prior to loading. resulting in very very blue samples. I do not know if this is an issue.
    ². However when I run the sample they definitely remain as very very thick blue spots on my gel.
    3. Also, I run gel 1h then increase to 150-170V for another ²+ hours, the dark blue front reaches the bottom SORT OF (look at image), the thick BLUE spots are very visible, and also the upper half of the gel is lighter because of the second lighter cathode buffer. But I never get such a CLEAR and perfect line like yours. My DARK blue part of the gel remains there and as you see underneath the big blue spots there is nothing.
    PLEASE look at the image: http://tinypic.com/view.php?pic=110kcxh&s=5 (look at lanes 3-4-5)

    I am just confused, do I have too much sample. Why do I have such enormous blue spots very clearly visible. My proteins are transmembrane proteins that are very very highly over-expressed. Maybe I should load less? They should be sizes 60kDa, 90kDa at 150kDa. I am using the Bio-rad pre-casted Tris-HCl gels 4-15%.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2012 - 10:19 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

Usage Statistics