Author Produced

Immunofluorescentie detectie van twee thymidine-analogen (CldU en IDU) in het jeugdwerk Tissue

* These authors contributed equally
Biology
 

Summary

We hebben afgeleid van een strategie om sequentiële opname van thymidine-analogen (CldU en IDU) op te sporen in de weefsels van volwassen muizen om twee opeenvolgende rondes van celdeling te kwantificeren. Deze strategie is nuttig om de celvernieuwing van de langlevende weefsels, oncogene transformatie, of transit-amplificerende cellen te detecteren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tuttle, A. H., Rankin, M. M., Teta, M., Sartori, D. J., Stein, G. M., Kim, G. J., Virgilio, C., Granger, A., Zhou, D., Long, S. H., Schiffman, A. B., Kushner, J. A. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. J. Vis. Exp. (46), e2166, doi:10.3791/2166 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nauwkeurige meting van de celdeling is een fundamentele uitdaging in de experimentele biologie dat wordt steeds complexer toen langzaam delende cellen worden geanalyseerd. Vastgestelde methoden om de celdeling te sporen zijn onder directe visualisatie door continue microscopie in celkweek, verdunning van vitale kleurstoffen zoals carboxyfluoresceïne di-Aetate succinimidylester (CFSE), immuno-detectie van mitogene antigenen, zoals Ki67 of PCNA, en thymidine-analogen. Thymidine-analogen kan worden gedetecteerd door een verscheidenheid van methoden, met inbegrip radio-detectie voor getritieerde thymidine, immuno-detectie voor broom-deoxyuridine (BrdU), chloor-deoxyuridine (CldU) en jood-deoxyuridine (IDU), en chemische detectie voor ethinyl-deoxyuridine (EDU). We hebben afgeleid van een strategie om sequentiële opname van verschillende thymidine-analogen (CldU en IDU) op te sporen in de weefsels van volwassen muizen. Onze methode maakt het mogelijk om nauwkeurig te kwantificeren onderzoekers twee opeenvolgende rondes van celdeling. Door het optimaliseren van immunokleuring protocollen onze aanpak kan detecteren zeer lage dosis thymidine-analogen worden toegediend via het drinkwater, veilig toe te dienen aan muizen gedurende langere tijd. Bijgevolg kan onze techniek worden gebruikt om de celvernieuwing te detecteren in een zeer lang levende weefsels. Optimale immunofluoresent vlekken resultaten kunnen worden bereikt in meerdere weefseltypen, waaronder de alvleesklier, huid, darmen, lever, bijnier, testis, ovarium-, schildklier-, lymfeklier, en de hersenen. We hebben ook gebruikt een techniek die oncogene transformatie in de weefsels te identificeren. We hebben verder toegepast deze techniek om te bepalen of transit-amplificerende cellen bijdragen aan de groei of de vernieuwing van weefsels. In die zin, opeenvolgende toediening van thymidine-analogen vertegenwoordigt een nieuwe benadering voor het bestuderen van de oorsprong en de overleving van cellen die betrokken zijn in weefsel homeostase.

Protocol

1. Labeling Weefsels met CldU en IDU

  1. Los thymidine-analogen (CldU of IDU) in water. Weeg 1 mg / ml van elke chemische stof en toe te voegen aan glazen flessen gedestilleerd water te scheiden. We meestal voor te bereiden 1 liter van elk op een keer.
  2. Los van de chemicaliën op een roer plaat of andere vorm van agitator. CldU zal oplossen in 10 minuten. van agitatie bij kamertemperatuur. Idu vraagt ​​meer dan een uur van agitatie bij 37 ° C in een shaker. Waterbronnen van invloed kunnen zijn Idu oplosbaarheid. Als Idu blijft onvoorwaardelijke na een nacht schudden, probeer dan een schonere bron van water. De oplossingen worden opgeslagen bij 4 ° C in het donker.
  3. Dien de eerste thymidine bevattende oplossing (ofwel CldU of IDU) om de muizen voor de gewenste etikettering periode. Sta niet toe dat muizen om de toegang tot ongelabelde water hebben tijdens de periode van het etiket. Wanneer de aangewezen etikettering periode is afgerond, begint een wash-out met ongelabelde water gedurende tenminste 24 uur (de thymidine-analogen met serum halfwaardetijden van enkele uren). Dien de tweede thymidine bevattende oplossing (ofwel CldU of IDU) om de muizen voor de gewenste etikettering periode. Vullen flessen water regelmatig om uitdroging te voorkomen!
  4. Als alternatief kunnen muizen worden gelabeld door opeenvolgende intraperitoneale injectie van CdlU en dan IDU. Bereid CldU of IDU op 10 mg / ml concentratie. Idu kan verlangen druppelsgewijze toevoeging van geconcentreerde natriumhydroxide-oplossing gevolgd door heftig schudden in te gaan schorsing. Voeg geen teveel natriumhydroxide. Voeg een druppel van natriumhydroxide om een ​​10 ml oplossing van IDG, gevolgd door een uur roeren bij 37 ° C in een shaker. Als dat niet in oplossing, herhaal dan de toevoeging van natriumhydroxide. Injecteer 100 microgram per gram lichaamsgewicht in de intraperitoneale ruimte.
  5. Controle dia's zijn essentieel voor dit protocol. Als gevolg hiervan, raden we de onderzoekers voeren verschillende varianten van thymidine analoog etikettering sensitiviteit en specificiteit te garanderen. Hiertoe behoren onder andere: 1. Muizen die alleen werden gemerkt met CldU, 2. Muizen die alleen werden gemerkt met IDU, 3. Muizen die opeenvolgend werden gemerkt met CldU en dan IDU, 4. Muizen die opeenvolgend werden bestempeld in omgekeerde volgorde eerste, met IDU en dan CldU, 5 Muizen die zijn mock gelabeld met alleen water. Bij het leren label met CldU en IDU, moeten onderzoekers steeds uit te voeren van de gehele protocol met alle 5 hierboven sets van controle dia's uit het weefsel van belang.

2. Tissue Harvest, Fixatie, en Slide voorbereiding

  1. Met behulp van geschikte verdoving, uit te voeren dodelijke overdosis en dan offer muis via verbloeding. Verwijder de verse weefsel en bevestig met 4% paraformalehyde bij 4 ° C gedurende 24 uur. Overdracht weefsel tot 1:4 formaline buffer en bewaar bij 4 ° C voor het inbedden.
  2. Als alternatief, uit te voeren dodelijke overdosis en dan perfuseren de muis via de linker ventrikel met een zoutoplossing totdat de bloeddruk wordt gewist uit het lichaam, dan onmiddellijk perfuseren met 30-50 cc van 4% paraformaldehyde. Verwijder de weefsels van belang en op te slaan in 01:04 formaline Buffer bij 4 ° C voor het inbedden.
  3. Na het weefsel uitdroging en paraffine inbedding, cut 5-micron weefselcoupes en plaats op geladen dia's. Bak de dia's bij 65 ° C gedurende 16 uur om de hechting van weefsel te schuiven zorgen (essentiële met antigen herstel stappen hieronder).

3. Uitdroging, permeabilisatie en Antigen Retrieval

  1. Verwijder overtollige paraffine door onderdompeling van dia's in twee xyleen baden gedurende 5 minuten. elk.
  2. Hydrateren het weefsel door het onderdompelen van dia's in ethanol verdund met water: 100, 95, 90, 80 70 en 50%. Geniet van de dia's voor 3 minuten. voor elke concentratie, te beginnen met 100% en gaan tot 50% voor de laatste onderdompeling.
  3. Was dia's gedurende 5 minuten. in 1x PBS.
  4. Permeabilize cellen door onderdompeling dia's in 0,2% Triton-X-oplossing voor de 5 min (vers gemaakt elke keer).
  5. Bereid je dia's voor magnetron weefsel antigen herstel. Plaats de dia's in een glazen beker met een voldoende volume 0,01 M pH 6,0 natriumcitraatbuffer, zodat de oplossing 5 cm boven de bovenkant van de dia's om rekening te houden verdamping verliezen dekt.
  6. Magnetron dia's tot de oplossing koken (3-10 min. Op volle kracht). Verlaagt het stroomverbruik tot de oplossing wordt langzaam koken (10-80%) en blijven voor een extra 20 minuten. Controleer regelmatig of magnetron om ervoor te zorgen de oplossing blijft op een langzame kook.
  7. Plaats bekerglas met dia's op een bench-top en laat zachtjes afkoelen tot kamertemperatuur, (ongeveer 2 uur).
  8. Bevestigen dat de dia's zijn bij kamertemperatuur met behulp van een thermometer.
  9. Dompel dia's in 1.5N HCl gedurende 40 minuten. bij kamertemperatuur.
  10. Was dia's tweemaal in 1X PBS, 5 minuten. per wasbeurt.

4. Primaire en secundaire antilichamen

  1. Het is belangrijk dat de dia's blijven zeer vochtig door het hele protocol. Droge tissue zal veel meer auto-Fluorescentie, waardoor de resulterende beelden onbruikbaar. Om te voorkomen dat sterven, proces een dia per keer.
  2. Cirkel elke sectie op de dia's met een vloeistof te blokkeren (dat wil zeggen, was) pen. Plaats de dia's in de container van 1x PBS.
  3. Maak een vochtige incubatiekamer door het plaatsen van natte papieren handdoeken plat op de bodem van een luchtdichte plastic verpakking.
  4. Make-up blokkering oplossing van 10% ezel serum verdund in 1x PBS. Het is belangrijk om volledig te dekken elke sectie met de oplossing. Voor weefselcoupes die zijn 1 x 1,5 centimeter, een volume van 50 micro-liter van de oplossing per sectie is voldoende.
  5. Voeg de blokkering oplossing voor de dia's. Verwijder de dia uit 1x PBS en te elimineren overtollige vloeistof door zachtjes te tikken op de rand glijden op een stapel van droge papieren handdoekjes. Plaats dia in incubatiekamer en voeg 50 micro-liter van 10% te blokkeren oplossing voor elke sectie. Wanneer alle dia's zijn afgerond sluit de kolf en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  6. Bereid primaire antilichaam te verdunnen tot Idu op te sporen. Verdunnen muis anti-BrdU in een 1:250 concentratie in 5% ezel serum gemaakt in 1x PBS. Kraan af block-oplossing van dia en plaats terug in de incubatiekamer. Voeg de bovengenoemde primaire antilichaam voor elk artikel en incubeer overnacht bij 4 ° C.
  7. Bereid hoge stringentie was (die binding minimaliseert door muis anti-BrdU antisera te CldU). Make-up verse laag zoutgehalte TBST buffer (36mm Tris, 50 mM NaCl, 0,5% Tween-20, pH 8,0). U moet 40 ml buffer per paar geleiders. Voeg 40 ml buffer voor elke 50 ml conische buis. Voor het toevoegen van dia's, verwarm de oplossing tot 37 ° C.
  8. Twee in een tijd, verwijder dia's uit de incubatiekamer, plaats ze back-to-back (zodat weefselmonsters af gezicht van elkaar) en tik het overtollige primaire antilichaam. Plaats de dia's in de buizen gevuld met een laag zout TBST en te dekken. Schud de buizen gedurende 20 minuten. in een schuddend bacteriecultuur incubator met de temperatuur op 37 ° C, en de snelheid ingesteld op 225 rpm.
  9. Was de dia's twee keer in verse 1X PBS. 5 minuten. per wasbeurt.
  10. De voorbereiding van de volgende primaire antilichaam oplossing voor de detectie van CldU en weefsel-antigeen, indien gewenst. Verdunnen rat anti-BrdU in een 1:250 concentratie in 5% ezel serum gemaakt in 1x PBS. Verdunnen primaire antisera tegen weefsel antigen bij het werken concentratie in de primaire antistof oplossing.
  11. Tik overtollige 1x PBS off van de dia's en plaats ze in de incubatiekamer. Voeg primaire antistof aan elke sectie en incubeer overnacht bij 4 ° C.
  12. Was de dia's twee keer in verse 1X PBS. 5 minuten. per wasbeurt.
  13. Bereid de secundaire antilichaam oplossing. Verdunnen Cy2 ezel anti-rat naar 1:250 en Cy5 ezel anti-muis 1:500 in een 1X PBS oplossing met 5% ezel serum. Voeg Cy3 tweede naar de eerste soorten van weefsel antigen antisera te detecteren. Ook verdun een 0,4 mg / ml stockoplossing van DAPI te 1:150 in het secundair antilichaam oplossing.
  14. Tik overtollige 1X PBS uit dia's en plaats in de incubatiekamer. Voeg secundair antilichaam oplossing voor elke sectie en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur.
  15. Was de dia's twee keer in verse 1X PBS. 5 minuten. per wasbeurt.
  16. Tik overtollige 1X PBS off van de dia's en zich te dekken glas met Verleng Gold anti-fade montage media (NIET Vectashield gebruik met dyanine kleurstoffen!). Druk op dekglaasjes om luchtbellen te verwijderen. Bewaren bij 4 ° C.

5. Beeldvorming en analyse

  1. Beeld dat de weefsel van belang met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een hoge energie-lichtbron, plan-apochromatische doelstellingen, en een hoog rendement microscoop camera (bijv. Hamamatsu Orca ER). Maak foto's in het AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (Tissue antigeen), en Cy5 (IDU) kanalen. Afbeeldingen samenvoegen tot een enkele multi-layer image bestand te maken.
  2. Indien correct uitgevoerd, zal DAPI gekleurde kernen worden homogeen licht. Tissue antigeen (bijv. insuline) moet uitwijzen cellen van belang. Als kleuring met DAPI of weefsel-antigeen is zwak of inconsistent, dompel dia in 1X PBS 's nachts te verwijderen dekglas en herhaal de toepassing van secundaire antisera.
  3. Focus op weefsel-antigeen in Cy3. Controleer CldU en IDU kleuring in Cy2 en Cy5 kanalen, schakelen tussen kanalen. Kijk voor potentiële kruisreactiviteit tussen de markers, zoals aangegeven door overmatige IDG en CldU co-positiviteit. Kijk voor weefsels die alleen CldU of Idu bevatten. Gebrek aan CldU of ID-positieve kernen kan duiden op een technisch probleem met de etikettering of vlekken. In dit geval, kijk voor een zeer replicatie weefsel (bijvoorbeeld lymfeklier).
  4. Analyseren van beelden. Scherm lagen die DAPI en weefsel antigeen. Met behulp van een white board marker in de dominante hand en een cel balie in de niet-dominante hand, merk elke kern met een contrasterende markering met een droog uitwisbare marker (aka white board marker). Count DAPI positieve cellen in weefsel van belang. Record totaal aantal cellen. Gebruik een droge wisser om vlekken te verwijderen. Scherm laags met DAPI, weefsel-antigeen, en CldU. Count CldU positieve cellen in weefsel van belang. Record CldU celgetal, maar niet wist merken. Wijzig weergave op lagen die weefsel antigen, CldU, en IDU te visualiseren. Count CldU Idu dubbele positieve cellen. Record waarde, wist u alle merken, en weer lagen die DAPI, weefsel-antigeen, en IDU. Tel het totaal aantal ID-positieve cellen in het weefsel van belang. Record Idu celgetal.

6. Representatieve resultaten

We sequentieel 6 week oude vrouwelijke muizen gelabeld met CldU voor een week en dan IDU gedurende twee weken, gevolgd door onmiddellijke offer. Pancreata werden gekleurd om CldU, IDU en insuline (een tissue antigen), evenals DAPI te detecteren. Eilandjes werden gelijkmatig gekleurd met insuline. CldU gekleurde kernen werden onderscheiden van IDU-lood kernen (figuur 2). Veel kernen buiten het eilandje waren CldU IDU co-positief (figuur 2, rechts onderin, witte pijlen). Een enkele insuline positieve cel had nucleaire kleuring voor zowel CldU en IDG (figuur 2, rechtsonder, magenta pijl).

Muizen. Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de IACUC comite van de Children's Hospital van Philadelphia. Vrouw B6.129 F1 wild-type muizen werden gekocht bij Taconic (Germantown New York), ondergebracht bij het proefdier faciliteit in The Children's Hospital van Philadelphia, en gevoed Mouse Dieet 5015 van PMI Nutrition International (Richmond. Indiana).

Labeling strategie. Door het labelen van de eerste celdeling evenement met CldU (groen gemarkeerd in deze regeling) en de tweede celdeling met IDU (rood gemarkeerd in deze regeling), sequentiële celdeling resulteert in co-gelabelde cellen met zowel CldU en IDG (groen / rood) .

Representatieve resultaten van thymidine etikettering van pancreatische cel omzet binnen muizen. Immunofluorescentie afbeelding van een muis pancreas met eilandje van Langerhans in het centrum. Muis was doordrenkt met CldU voor 1 week en daarna IDU voor 2 weken in het drinkwater voorafgaand aan de onmiddellijke offeren. Pancreas monster werd verwerkt zoals beschreven in het protocol. 40x objectief beelden met verschillende lagen weergegeven die geschikt zijn voor het tellen. Samengevoegde beelden bevatten DAPI (wit) CldU (groen), IDU (rood), Insuline (geel). (Boven, links) DAPI en insuline. (Boven, rechts) CldU en insuline. (Lager, links) IDU en insuline. (Lager, rechts) CldU, IDU, en insuline. Schaal bar: 100 urn.

Figuur 1
Figuur 1. Labeling strategie. Door het labelen van de eerste celdeling evenement met CldU (groen gemarkeerd in deze regeling) en de tweede celdeling met IDU (rood gemarkeerd in deze regeling), sequentiële celdeling resulteert in co-gelabelde cellen met zowel CldU en IDG (groen / rood) .

Figuur 2
Figuur 2. Representatieve resultaten van thymidine etikettering van pancreatische cel omzet binnen muizen. Immunofluorescentie afbeelding van een muis pancreas met eilandje van Langerhans in het centrum. Muis was doordrenkt met CldU voor 1 week en daarna IDU voor 2 weken in het drinkwater voorafgaand aan de onmiddellijke offeren. Pancreas monster werd verwerkt zoals beschreven in het protocol. 40x objectief beelden met verschillende lagen weergegeven die geschikt zijn voor het tellen. Samengevoegde beelden bevatten DAPI (wit) CldU (groen), IDU (rood), Insuline (geel). (Boven, links) DAPI en insuline. (Boven, rechts) CldU en insuline. (Lager, links) IDU en insuline. (Lager, rechts) CldU, IDU, en insuline. Schaal bar: 100 urn.

Discussion

Onze benadering van thymidine-gebaseerde benadering van de etikettering cel omzet heeft veel mogelijke toepassingen in biomedisch onderzoek. Tot op heden hebben we ons geconcentreerd op de alvleesklier, maar we hebben ook toegepast deze strategie om de celvernieuwing van de huid, darmen, lever, bijnieren, nieren, testis, ovarium-, schildklier-, lymfeklier, hematopoiese, en de hersenen een te onderzoeken. Omdat de cellen omzet varieert van weefsel tot weefsel, dient de etikettering strategieën worden aangepast aan de meest overtuigende informatie te verkrijgen van het orgel van belang. Morrison en collega's gebruikten CldU en IDU voor een dag elk hematopoiesis 2 label. Kuhn en zijn collega's gebruik CldU en IDU voor 4 dagen per om de celdeling te detecteren in het regenereren myocard 3. In contrast, hebben we gebruik gemaakt CldU en IDU tot negen maanden in totaal om basale cel omzet binnen pancreaseilandjes, een tissue label met minimale cel omzet als het dier eeuwen 1,4-6. De meest voor de hand liggende mogelijke toepassing van onze etikettering van strategie is voor de studies om de celvernieuwing te definiëren binnen weefsel homeostase. Maar onze techniek heeft een aantal andere mogelijke toepassingen. Zo hebben we onlangs ook gebruikt een techniek die oncogene transformatie binnen de weefsels, waar de focusgebieden van een verhoogde replicatie gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door een verhoogde opname van CldU of IDU 5 te identificeren. Morrison en collega's gebruikten CldU en IDU voor 1 dag per om te testen op het etiket het behoud van het gedrag van hematopoietische stamcellen 2. We hebben ook toegepast sequentiële thymidine analoog etiket om te bepalen of transit-amplificerende cellen bijdragen aan de groei of de vernieuwing van weefsels 1. In deze toepassing opeenvolgende toediening van thymidine-analogen vertegenwoordigt een nieuwe benadering voor het bestuderen van de oorsprong en de overleving van cellen die betrokken zijn in weefsel homeostase.

Thymidine-analogen mag niet gebruikt worden zonder waarschuwing. Synthetische thymidine-analogen hebben het potentieel toxische eigenschappen voor delende cellen, en het gebruik ervan kan in theorie aantasten cel omzet in het kweken van dieren. Thymidine-analogen zijn gebruikt als radiosensitizing agenten voor kankerpatiënten, en kan celdeling vertragen. Zo dringen we er bij de onderzoekers voorzichtig te onderzoeken op mogelijke toxiciteit in hun weefsel van belang. Bijvoorbeeld Trumpp en collega's vinden dat de systemische BrdU kunnen dwingen hematopoietische stamcellen om te celcyclus 7 in te voeren. Bijvoorbeeld, Rutter en zijn collega's merkte op dat een hoge dosis thymidine-analogen zijn giftig voor het ontwikkelen van alvleesklier 8. Meer recent Hellerstein en collega's van KineMed, Inc bleek dat BrdU administratie intra-eilandje proliferatie door 16-25% gebruik van een eigen zwaar water etikettering techniek 9 vertraagt. Het hele eilandje preparaten die door Hellerstein en collega's die vele andere endocriene en niet-endocriene celtypen, die maar liefst 50% van het totaal eilandje voorbereidingen kan omvatten. We zien echter dat de langdurige infusie van BrdU niet beta-celproliferatie beïnvloeden bij jonge volwassen muizen, zoals gemeten door Ki67 expressie 4. Ook de langdurige toediening van CldU en IDU niet lijken te betacelmassa uitbreiding van een aantasting. Bovendien, beta-cel proliferatie tarieven zijn gelijk aan het tussen muizen gelabeld met BrdU voor langere tijd en muizen die alleen zijn gelabeld voor een paar uur (tarieven zijn genormaliseerd op gelijkwaardige perioden). Samen vormen deze resultaten suggereren dat muizen die veilig kan op lange termijn een lage dosis toedienen van thymidine-analogen tolereren. Toch kunnen we niet uitsluiten dat de potentiële toxiciteit van thymidine-analogen in pancreatische beta cel groei. Als gevolg daarvan, blijven we controles uitvoeren wanneer de etikettering muizen met thymidine-analogen, en andere onderzoekers aan om zo goed te doen drang.

Onze techniek van de sequentiële thymidine analoog etikettering is niet zonder valkuilen en technische uitdagingen. Als gevolg hiervan, controle dia's zijn bijzonder belangrijk. We hebben gegenereerd controle dia's die van verschillende weefsels bestaan ​​uit 1) Muizen die alleen werden gemerkt met CldU;.. 2) Muizen die alleen werden gemerkt met IDU;. 3) Muizen die opeenvolgend werden gemerkt met CldU en dan IDU, 4.) muizen die opeenvolgend werden bestempeld in omgekeerde volgorde eerste, met IDU en dan CldU;. 5) Muizen die zijn mock gelabeld met alleen water. Bij het leren label met CldU en IDU, moeten onderzoekers steeds uit te voeren van de gehele protocol met alle 5 hierboven sets van dia's uit het weefsel van belang.

Lichte kruisreactiviteit tussen CldU en IDG is een ongelukkige, maar onvermijdelijke keerzijde van de etikettering met beide thymidine-analogen. De CldU en IDU techniek is gebaseerd op verschillen in affiniteit tussen antisera die oorspronkelijk waren tegen BrdU afgeleid in verschillende soorten (muizen en ratten). Ons protocol, terwijl omslachtig, is ontworpen om dergelijke kruisreactiviteit te minimaliseren. Daarom dringen we er voorzichtig onder de onderzoekers die van mening zijn over te slaan stap (pen) van het protocol. In het bijzonder hebben weondervonden problemen met de secundaire antisera dat kruis reactief zijn tussen muis en rat. Dit kan worden geminimaliseerd door het gebruik van Jackson antisera die volledig zijn cross-geadsorbeerd tussen muis en rat.

We soms niet adequaat te detecteren thymidine. In dergelijke gevallen is het van cruciaal belang om positieve controle dia's te gebruiken om te bepalen welke niet reagens of stap werkte. Problemen zijn meestal te wijten aan slechte monsters van antisera, droge dia's, of onvoldoende nucleaire permeabilisatie. We hebben gefaald om succesvol label ontwikkelen van embryo's met IDU. Zo kunnen niet alle weefsels worden doorlaatbaar voor Idu.

Alternatieven voor CldU en IDU voor dubbele thymidine analoog etikettering zijn aan de horizon. Edu (5-ethinyl-2 deoxyuridine) kan een substraat voor koper-gekatalyseerde klik chemie detectie 10,11 worden. Edu detectiemethoden vereisen geen scheiding van DNA-strengen, en zijn dus zeer vatbaar voor analyse door flowcytometrie 12. Edu is compatibel maar niet kruisen reactief met BrdU 10. Edu is gebruikt om de celvernieuwing van de diverse weefsels waaronder de muis bètacellen in de pancreas 13, darm-L-cellen 14 en 15 Epidermis kwantificeren. Edu is vrij duur op dit moment ($ 1000 US per 500mg). Nog steeds, Edu-detectie lijkt te zijn veel gevoeliger dan BrdU detectie 10. Zo kan het economisch haalbaar om Edu en BrdU in plaats van CldU en IDU combineren. Deze methode kan ook toelaten detectie van drie verschillende rondes van celdeling bij muizen driedubbel gelabeld voor Edu, CldU, en IDU.

Kortom, onze techniek van de sequentiële thymidine analoog etikettering is een nieuwe benadering voor het detecteren van de celvernieuwing. We hopen dat onze benadering stelt andere wetenschappers om nauwkeuriger te kwantificeren celdeling, en verwachten dat het nieuwe paradigma's te openen in het weefsel homeostase.

Disclosures

Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd in het dier faciliteit in The Children's Hospital van Philadelphia volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

Acknowledgments

Ondersteund door de JDRF, de NIH (R01-DK081469), het Gemenebest van Pennsylvania (Center for Excellence in de regeneratieve geneeskunde te verlenen 4100043362), de March of Dimes (Basil O'Connor Starter Scholar Research Award), en een University of Pennsylvania DERC piloot en de haalbaarheid te verlenen (DK19525).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-chloro-2-deoxyuridine (CldU) MP Biomedicals 0210547891
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) MP Biomedicals 0210035701
4% Paraformaldehyde USB Corp., Affymetrix 19943
10% Buffered Formalin Fisher Scientific 23-427-098
XYLENES VWR international EM-XX0060-4
Ethanol, Anhydrous (Histological) Fisher Scientific A405P-4
PBS, 10X Powder Concentrate Fisher Scientific BP665-1
Triton –X-100 Fisher Scientific BP151-500
Hydrochloric Acid VWR international BDH3028-2.5LG
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Mouse Anti BrdU BD Biosciences 347580
Rat mab anti BrdU Accurate Chemical & Scientific Corporation OBT0030
Cy2 donkey anti-rat Jackson ImmunoResearch 712-225-153 Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).
Cy5 donkey anti-mouse Jackson ImmunoResearch 715-175-151 See above
Glass Cover Slips Sigma-Aldrich C9056-1CS
YFP Filter Chroma Technology Corp. 49003 ET EYFP Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel
Cy3 Filter Chroma Technology Corp. 49004 ET Cy3
Cy5 Filter Chroma Technology Corp. 49006 ET Cy5
ORCA ER Microscope Camera Hamamatsu Corp. C4742-95-12ER Excellent detection of fluorophores
ProLong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teta, M. Growth and regeneration of adult Beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12, (5), 817-817 (2007).
  2. Kiel, M. J. Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU. Nature. 449, (7159), 238-238 (2007).
  3. Bersell, K., Arab, S., Haring, B., Kuhn, B. Neuregulin1/ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury. Cell. 138, 257-257 (2009).
  4. Rankin, M. M., Kushner, J. A. Adaptive Beta Cell Proliferation Is Severely Restricted with Advanced Age. Diabetes. (2009).
  5. He, L. M. Cyclin D2 Protein Stability Is Regulated in Pancreatic Beta Cells. Mol Endocrinol. (2009).
  6. Kushner, J. A. Beta-cell growth: an unusual paradigm of organogenesis that is cyclin D2/Cdk4 dependent. Cell Cycle. 5, (3), 234-234 (2006).
  7. Teta, M. Very slow turnover of beta-cells in aged adult mice. Diabetes. 54, (9), 2557-2557 (2005).
  8. Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, (6), 1118-1118 (2008).
  9. Van Nest, G., Raman, R. K., Rutter, W. J. Effects of dexamethasone and 5-bromodeoxyuridine on protein synthesis and secretion during in vitro pancreatic development. Dev Biol. 98, (2), 295-295 (1983).
  10. Githens, S., Pictet, R., Phelps, P., Rutter, W. J. 5-bromodeoxyuridine may alter the differentiative program of the embryonic pancreas. J Cell Biol. 71, (2), 341-341 (1976).
  11. Walther, B. T., Pictet, R. L., David, J. D., Rutter, W. J. On the mechanism of 5-bromodeoxyuridine inhibition of exocrine pancreas differentiation. J Cell Biol. 249, (6), 1953-1953 (1974).
  12. Chen, S. Measurement of pancreatic islet cell proliferation by heavy water labeling. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, (5), E1459-E1459 (2007).
  13. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (7), 2415-2415 (2008).
  14. Best, M. D. Click chemistry and bioorthogonal reactions: unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules. Biochemistry. 48, (28), 6571-6571 (2009).
  15. Buck, S. B. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, (7), 927-927 (2008).
  16. Huising, M. O. CRFR1 is expressed on pancreatic beta cells, promotes beta cell proliferation, and potentiates insulin secretion in a glucose-dependent manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2), 912-912 (2008).
  17. Reimann, F. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metab. 8, (6), 532-532 (2008).
  18. Doupe, D. P., Klein, A. M., Simons, B. D., Jones, P. H. The ordered architecture of murine ear epidermis is maintained by progenitor cells with random fate. Dev Cell. 18, (2), 317-317 (2010).

Comments

1 Comment

  1. Very detailed and well explained. Found it very useful to plan my experiments.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 25, 2011 - 10:48 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics