Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Immunology and Infection

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Summary

Este documento describe los diferentes métodos de cultivo

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Moreau-Marquis, S., Redelman, C. V., Stanton, B. A., Anderson, G. G. Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells. J. Vis. Exp. (44), e2186, doi:10.3791/2186 (2010).

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Abstract

Biopelículas bacterianas se han asociado con un número de diferentes enfermedades humanas, pero el desarrollo del biofilm en general ha sido estudiado en la no-vida superficies. En este trabajo se describe la formación de biofilms protocolos de Pseudomonas aeruginosa en las células de las vías respiratorias epiteliales humanas (células CFBE) en un cultivo. En el primer método (llamado estática Co-cultura Modelo Biofilm), P. aeruginosa se ​​incubaron con células CFBE cultivadas como monocapas confluentes en placas de cultivo tisular estándar. Aunque la bacteria es muy tóxica para las células epiteliales, la adición de arginina retrasos de la destrucción de la monocapa de tiempo suficiente para que las biopelículas que se forman en las células CFBE. El segundo método (llamado la celda de flujo Co-cultura Modelo Biofilm), consiste en la adaptación de un aparato de biofilm celda de flujo, que se utiliza a menudo en biofilm de investigación, para dar cabida a un cubreobjetos apoyando una monocapa de células CFBE. Esta monocapa se inocula con P. aeruginosa y una bomba peristáltica entonces fluye a través de un nuevo medio de las células. En ambos sistemas, las biopelículas bacterianas se forman dentro de las 6-8 horas después de la inoculación. Visualización de la película biológica se ve reforzada por el uso de P. aeruginosa cepas que expresan constitutivamente la proteína fluorescente verde (GFP). La estática y el flujo de cultivo de células Co-ensayos de biofilm son sistemas modelo para principios de P. Aeruginosa infección de la fibrosis quística (FQ) de pulmón, y estas técnicas permiten a los diferentes aspectos de P. la formación de biofilm aeruginosa y virulencia a estudiar, incluyendo la citotoxicidad biofilm, la medición de biofilm UFC, y las manchas y la visualización de la biopelícula.

Protocol

1. Estática Co-cultura Biofilm Modelo

  1. La estática Co-cultura Modelo Biofilm 1 utiliza CFBE41o las células (células CFBE), que se inmortalizan las células originalmente desarrollado a partir de una persona con FQ homocigotos para la mutación F508-CFTR 2,3,4. CFBE células deben ser sembradas a una concentración de 10 6 células / pocillo en una placa de tejidos de 6 pocillos cultura o 2 x 10 5 en una placa de tejido de 24 pocillos en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con suero fetal bovino al 10%, 2 mM L-glutamina, 50 U / mL de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina. Usamos 1,5 ml de medio por pocillo en placas de 6 pocillos y 0,5 ml de medio por pocillo en placas de 24 pocillos.
  2. Las células deben ser cultivadas a 37 ° C y 5% CO 2 -95% de aire durante 7-10 días para formar una monocapa antes de la inoculación con bacterias. El medio debe ser cambiado cada 2-3 días. Estas condiciones se ha demostrado que conducen a la formación de una monocapa y uniones estrechas.
  3. Crecer P. aeruginosa en 5 ml de LB durante 18 horas a 37 ° C en un agitador incubadora a 200 rpm. En estas condiciones, P. culturas aeruginosa típicamente llegar a una densidad de 5x10 9 UFC / mL.
  4. Para la inoculación de bacterias, se elimina el medio de las células CFBE y añadir un volumen igual de MEM sin rojo fenol, suplementado con 2 mM L-glutamina (medio Microscopía). Monocapas confluentes CFBE son inoculadas con P. aeruginosa a una multiplicidad de infección de aproximadamente 30:1 en relación con el número de células CFBE originalmente sembradas. Esto equivale a 2 x 10 7 UFC / ml en 1,5 ml de MEM / pocillo para placas de 6 pocillos y 1.2 X 10 7 UFC / mL en mL MEM 0,5 / pocillo para placas de 24 pocillos.
  5. Incubar las placas durante 1 hora a 37 ° C y 5% CO 2 -95% de aire.
  6. Después de la incubación de 1 hora, el sobrenadante debe ser eliminado y reemplazado por medio fresco Microscopía suplementado con 0,4% de arginina.
  7. Se incuba a 37 ° C y 5% CO 2 -95% de aire para varios puntos de tiempo (hasta aproximadamente 8 horas) y analizar la integridad de la monocapa CFBE mediante microscopía de contraste de fase. Si las células de las vías respiratorias no son confluentes, P. aeruginosa rápidamente (en minutos) el acceso a la superficie basolateral de las células y destruye la integridad celular. La inoculación con P. aeruginosa que constitutivamente expresar los resultados de las buenas prácticas agrarias en microcolonias biofilm fluorescente que puede ser visualizado por microscopía de epifluorescencia y confocal.
  8. El UFC de bacterias en el biofilm se puede determinar por el lavado de la co-cultivo 2-3 veces con tampón fosfato salino (PBS) para eliminar las bacterias planctónicas. Tras el lavado, el tratamiento con 0,1% Triton X-100 en PBS o MEM durante 10-15 minutos para lisar las células epiteliales y dispersar el biofilm.
  9. Vortex durante 3 minutos y preparar diluciones seriadas del lisado. Placa de estas diluciones en agar LB e incubar durante la noche a 37 ° C. Contar las colonias al día siguiente para determinar la UFC.

2. Celda de flujo Co-cultura Biofilm Modelo

  1. La celda de flujo Co-cultura Modelo Biofilm (ensayo de flujo) implica la modificación de los aparatos celulares biopelícula de flujo estándar para dar cabida a las células CFBE 5.
  2. Coloque varios de 40 mm de diámetro cubreobjetos de vidrio en un recipiente limpio de 100 ml vaso. Cubra bien con 2 capas de papel de aluminio y autoclave en un ciclo seco durante 20 minutos.
  3. Trabajo en una campana de cultivo celular, tomar un cubreobjetos estériles del vaso con las pinzas de etanol lavar y colocar en un recipiente estéril de 60 mm de diámetro plato de plástico.
  4. Añadir 3 ml de pre-calentado medio de cultivo celular, al pulsar sobre el cubreobjetos con la punta de la pipeta para eliminar cualquier burbuja atrapada debajo y para forzar el portaobjetos en la parte inferior del plato de plástico.
  5. Semillas de 2x10 6 células por placa y agite suavemente el plato hacia atrás y adelante. Evite el remolino para evitar la centrifugación de las células contra los lados del plato.
  6. Coloque el plato en un 5% de CO 2 -95% aire de la incubadora a 37 ° C y alimentar las células de cada dos días con 3 ml de medio de cultivo fresco de 8 a 10 días. Las células se forma una monocapa sobre el cubreobjetos.
  7. Crecer P. aeruginosa en 5 ml de LB durante 18 horas a 37 ° C en un agitador incubadora a 200 rpm. En estas condiciones, P. culturas aeruginosa típicamente llegar a una densidad de 5x10 9 UFC / mL. Usamos P. PAO1 aeruginosa cepa que lleva el plásmido pSMC21 para la expresión constitutiva de GFP 6.
  8. Añadir 1 ml de cultivo bacteriano en un tubo estéril de microcentrífuga. Centrifugar a 6000 rpm durante 3 minutos, y lavar el sedimento bacteriano en dos ocasiones en 1 ml de medio de microscopía.
  9. Diluir 0,5 ml de bacterias lavadas y resuspendidas en 4,5 ml de medio de microscopía para lograr una concentración de ~ 5x10 8 UFC / mL.
  10. La observación de células vivasen tiempo real requiere una cámara de imágenes acoplado a una bomba peristáltica (para asegurar un flujo de nutrientes durante largos períodos de tiempo) y un controlador de temperatura. Usamos la FCS2 Bioptechs (Focht células vivas) la cámara conectada a una bomba de bajo flujo micro-perfusión de 1 / 16 ª C-flex cortar los tubos de longitudes apropiadas y autoclave para esterilización y la temperatura regulada a través del controlador de la cámara FCS2. Nosotros mantenemos la fuente de entrada de medio a 37 ° C baño de agua ubicado justo al lado del microscopio.
  11. Montar la cámara de flujo. La cámara incluye una base de FCS2 auto-bloqueo (que se encuentra en el adaptador de la etapa durante la exposición) y una mitad superior conectado a los tubos de perfusión y el controlador de la cámara. La cámara se monta al revés antes de que se dio la vuelta y se coloca en el adaptador de la etapa. Mantenga la parte superior de la cámara al revés para que los tubos de perfusión son visibles, y alinear los agujeros de paso de una junta de goma de 0,75 mm de espesor en los tubos de perfusión. Pila de la diapositiva microaqueduct siempre con la cámara en la parte superior de la junta de goma, asegurándose de que la parte acanalada, y colocar otra junta de goma en la parte superior de la diapositiva. El espesor y la geometría interna de esta junta determinará el segundo volumen de la cámara. Por lo general trabajan con una junta de goma de 0,75 mm de espesor con un 30-mm geometría interna y vuelta.
  12. Añadir 1 ml de pre-calentado (37 ° C) Microscopía medio en el centro de la diapositiva.
  13. Recuperar un plato de 60 mm desde el cultivo celular incubadora, se elimina el medio gastado y se lavan las células una vez con 3 ml de medio de microscopía de pre-calentado. Este paso asegura la eliminación del rojo fenol y antibióticos presentes en el medio de cultivo celular. Rojo fenol es ligeramente fluorescentes y pueden interferir con la imagen, mientras que los antibióticos pueden eliminar P. aeruginosa antes de que puedan establecer las biopelículas.
  14. Utilizando lavados con etanol fórceps, recuperar el cubreobjetos del plato y lo baja al revés sobre la gota de medio de Microscopía coloca en la cámara. El cubreobjetos está ahora descansando en la segunda junta de goma y la monocapa de células de las vías respiratorias es hacia abajo.
  15. La celebración de los componentes montados en una mano, coloque la base de la cámara en la parte superior de la pila y encienda la cámara más rápida para que todo quede al derecho. Bloqueo de la base en lugar de girar el anillo.
  16. Conecte el tubo de entrada a la corriente de baja micro-perfusión de la bomba e iniciar el flujo a una velocidad de 20 ml / h, este caudal se encuentra dentro de la capacidad de velocidad de nado de P. aeruginosa. Una segunda pieza de tubo de la bomba de enlaces a un matraz de medio de Microscopía coloca en el 37 ° C baño de agua ubicado justo al lado del microscopio.
  17. Adjuntar estéril pre-corte 1 / 16 de C-Flex tubería a la entrada y salida de los tubos de perfusión de la cámara, conectar el controlador de temperatura, a continuación, coloque la cámara montada en la platina del microscopio de un microscopio de fluorescencia invertido.
  18. Usando una jeringa desechable de 1 ml, inyectar la suspensión previamente preparada de bacterias en la cámara, usando una válvula de dos vías colocadas en la línea entre la bomba y la cámara. En nuestro contexto particular, se necesita un volumen de 0,6 ml de suspensión bacteriana para llegar a la cámara. Ajustar este volumen de acuerdo a su longitud de la tubería en particular. También nos parece útil colocar un filtro en línea disponible 0,22 micras filtro entre la bomba y la válvula de dos vías para evitar que las bacterias de nadar contra la corriente y la contaminación del frasco de entrada.
  19. Para permitir que las bacterias se adhieren a las células de las vías respiratorias, detener la bomba de 2h. El flujo puede ser reiniciado y se mantiene a 20 ml / h durante el resto del experimento.
  20. Supervisar la integridad de las células de las vías respiratorias por el contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía durante todo el experimento para comprobar si hay señales de daño en la monocapa. Al mismo tiempo, seguir el desarrollo de buenas prácticas agrarias con etiqueta P. biofilms aeruginosa en la superficie apical de las células de las vías respiratorias mediante la adquisición de imágenes con un microscopio de fluorescencia confocal invertido o de campo amplio.

3. Resultados representante

Usamos una cepa de P. aeruginosa que contiene el plásmido pSMC21 que permite la expresión constitutiva de GFP 6. Por esta razón, las buenas prácticas agrarias con etiqueta biopelículas que crecen en una monocapa CFBE puede ser visualizado por microscopía de epifluorescencia. Por otra parte, la visualización de la película biológica se puede lograr mediante la tinción etiqueta P. aeruginosa con una solución al 1% calcofluor blanco durante 1 hora a 37 ° C 1.

Para la formación de biofilm de imágenes en las células CFBE en el ensayo de flujo, se utiliza un adaptador de etapa a la medida, pero muchas compañías ahora pueden ofrecer adaptadores de etapa especialmente equipados. Trabajamos con una Olympus IX70 microscopio invertido equipado con un ORCA-AG profunda cámara CCD y un enfriamiento de aceite x60 objetivo de inmersión (apertura numérica 1,40). El filtro wtalón está equipado con un filtro de banda 480/40 nm de excitación y pasar a una banda 535/30 nm filtro de emisión pasar. Las imágenes digitales fueron adquiridos con el paquete de software Openlab 4.0.3 (improvisación) y los volúmenes se deconvolved por iterativo restauración utilizando el software 3.5.1 Volocity (Improvisación). El análisis cuantitativo de las estructuras de biofilm en 3D se consiguió con el paquete de software de análisis de imagen COMSTAT 7,8.

Para que un modelo de co-cultivo considerado, se debe prestar especial atención a la citotoxicidad de desarrollo entre los componentes del modelo. Tanto en la estática y los ensayos de la celda de flujo, se encontró que la monocapa CFBE podía soportar la presencia de P. aeruginosa de hasta 8 horas después de la inoculación, sin ningún signo de alteración. La integridad de monocapa epitelial puede ser evaluada por microscopía de contraste de fase mediante un microscopio invertido 1 (Figura 1) o por interferencia diferencial de contraste (DIC) de microscopía durante todo el experimento 5. Con el tiempo, P. aeruginosa se ​​producen toxinas y factores de virulencia que se acumulan y pueden dañar la monocapa de células epiteliales en todo o en secciones (Figura 1B-1C). Citotoxicidad puede ser cuantitativamente evaluó a través de varios kits para medir la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de las células epiteliales. LDH es una enzima citosólica estable liberada en el medio extracelular a la lisis o muerte celular.

Cuando la integridad de la monocapa de las vías respiratorias no se ve comprometida (por lo general de ~ 8 h después de la inoculación), P. biofilms aeruginosa con éxito se pueden formar y desarrollar en la superficie apical de las células de las vías respiratorias, tanto en la cultura co-modelos descritos (Figura 2A-2B). Después de la reconstrucción 3D (Figura 2 C) y la cuantificación, la acumulación de biomasa puede determinarse con precisión. También hemos utilizado estos biofilms de co-cultivo en varios ensayos fenotípicos. Por ejemplo, como se mencionó anteriormente, biofilm UFC se puede determinar fácilmente por lisis de las células epiteliales, diluyendo en serie el lisado, y de las planchas en placas de agar. Hemos encontrado que esta técnica ventajosa en la determinación de la resistencia de las cepas a los antibióticos. Además, la toxicidad de biofilm a las células epiteliales se puede medir con equipos disponibles en el mercado de detección de LDH. De esta manera, el papel de los factores de virulencia en la toxicidad de los biofilms pueden ser evaluados. Estos sistemas de modelos también soportan una serie de aplicaciones de la expresión de genes, incluidos los estudios de fusión de promotor, RT-PCR y análisis de microarrays 1,5,9.

Figura 1
Figura 1. Monocapa de células CFBE e imágenes representativas de peligro y las vías respiratorias dañadas monocapas de células por P. aeruginosa crecimiento del biofilm. (A) imagen representativa de una monocapa de células cultivadas en placas de CFBE cultivo de tejidos, evaluada por microscopía de contraste de fase. Barra de escala, de 120 micras. (B) Ejemplo de una monocapa CFBE comprometida. A pesar de que la monocapa no muestra signos evidentes de daños visibles, sin embargo, P. aeruginosa son vistos difusión entre las uniones estrechas de las células epiteliales y obtener acceso a las membranas basolateral. La formación de biofilm no suele alcanzar en estas condiciones debido al deterioro de la monocapa. Barra de escala, 20 micras. (C) Ejemplo de una maleza P. biofilm aeruginosa observó 24 horas después de la inoculación. Tras superar con éxito el apoyo a la formación de biopelículas, la monocapa CFBE era irreparable y ahora está prácticamente ausente. Biofilm residual, creciendo como una capa plana de bacterias, se muestra correspondientes a la cubreobjetos. Barra de escala, 20 micras.

Figura 2
Figura 2. P. biofilms aeruginosa crecido en la superficie apical de las células CFBE confluente con la estática Co-cultura Modelo Biofilm y la celda de flujo Co-cultura Modelo Biofilm. (A) Imagen de un Representante P. expresan GFP biofilm aeruginosa crecido en una monocapa de células CFBE utilizando la estática Co-cultura Modelo Biofilm, evaluada por microscopía de epifluorescencia. La imagen es una superposición de los canales de contraste de fase y el canal de fluorescencia. Barra de escala, de 35 micras. (B) La imagen de un P. GFP-etiquetados biofilm aeruginosa crecido durante 6 horas en una monocapa de células CFBE utilizando la celda de flujo Co-cultura Modelo Biofilm. Para facilitar la visualización de la monocapa de las vías respiratorias, los núcleos se tiñeron con 10 mg / ml Hoechst 33342 (Molecular Probes) durante 30 minutos antes de la inoculación con P. aeruginosa. Imágenes fusionadas y pseudocolored fueron vistos por contraste de interferencia diferencial (DIC), y las imágenes correspondientes que se muestran son fluorescentes. Biopelículas, se presentan como grupos verdes adheridos a la superficie apical de las células CFBE, se dispersan a través de las células de las vías respiratorias. Barra de escala, 20 micras. (C) la reconstrucción tridimensionalción de las pilas de la imagen de la serie Z que muestra el típico hongo estructuras de 6 h de edad, P. biofilms aeruginosa formando una monocapa de células CFBE. Barra de escala, 10 micras.

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Discussion

Los biofilms son comunidades de bacterias que se forman en respuesta a estímulos ambientales. Estas señales ambientales que llevan a cambios en la regulación mundial dentro de cada bacteria, lo que resulta en la unión a una superficie, la agregación, la producción de exopolisacáridos y otros fenotipos como el aumento de la resistencia antibiótica 10. Durante el último par de décadas, la evidencia más ha apoyado la hipótesis de que los biofilms juegan un papel importante en la patogénesis de las infecciones crónicas. Por ejemplo, es bien aceptado que el P. aeruginosa es capaz de establecer infecciones crónicas en los pulmones de Fibrosis Quística (FQ) de los pacientes mediante la formación de biofilms 11. La FQ es un trastorno genético, donde las mutaciones en el gen CFTR conducen a la secreción de cloruro inadecuado 12. Los pacientes con FQ suelen experimentar una alteración de las vías respiratorias que conducen a la fisiología tapones de moco espeso en las vías respiratorias y, al mismo tiempo, a la infección microbiana 13. Al final de la adolescencia, el agente dominante infecciosas de las vías respiratorias CF es P. aeruginosa, dando lugar a una infección crónica biofilm que es resistente a los antibióticos 14.

Los protocolos descritos en este documento han sido desarrollados para actuar como sistemas modelo para estudiar la formación de biopelículas en las células del pulmón de vida. Biofilms están implicados en muchas enfermedades y, sin embargo, en su mayoría han sido estudiados en la no-vida superficies sólidas, como el vidrio y el plástico 15,16. Mediante el estudio de la formación del biofilm y el crecimiento en superficies abióticas sólo una falta importante interacción entre patógeno y huésped que sólo puede producirse con un modelo de sistema tal como se describe en los protocolos anteriores. En concreto, la estática Co-cultura Modelo Biofilm y la celda de flujo Co-cultura Modelo Biofilm aprovechar la capacidad de P. aeruginosa para interactuar y unirse a la superficie epitelial del pulmón. El uso de estos modelos, hemos demostrado que la respuesta de las biopelículas de co-cultivo con tratamiento antibiótico es único y que estos modelos tienen más probabilidades de reflejar con exactitud el estado infeccioso 1,5. En este sentido, nos han informado de que la resistencia a los aumentos de tobramicina por> 25 veces al P. biofilms aeruginosa se ​​cultivan en las vías aéreas en comparación con las biopelículas en las superficies cultivadas abióticos, como el vidrio 5. Es probable que estas técnicas reflejan los acontecimientos que ocurren durante la colonización a principios de los 17 de pulmón. Por lo tanto, los sistemas de modelo de co-cultivo representan herramientas innovadoras para la comprensión de la infección temprana del epitelio de las vías CF por P. aeruginosa 1.

Sistemas de cultivo de tejidos han sido comúnmente empleados para entender las interacciones entre el huésped y el patógeno. Hemos tomado estas interacciones un paso más allá mediante la formación de biofilms en vivo las células epiteliales humanas. En el futuro, las versiones modificadas de los modelos descritos aquí podrían ser utilizados para investigar la formación de biofilm de bacterias diferentes en otros estados infecciosos.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias a G. O Toole de orientación y sugerencias en el desarrollo de estos modelos. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Fibrosis Quística (ANDERS06F0 a GGA, STANTO07RO y STANTO08GA a BAS), los Institutos Nacionales de Salud (T32A107363 a GGA y R01-HL074175 a BAS), y el Centro Nacional para Recursos de Investigación Centros de Excelencia para la Investigación Biomédica (P20-COBRE RR018787 a BAS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FCS2 (Focht Live-Cell) chamber Bioptechs 060319131616
FCS2 chamber controller Bioptechs 060319-2-0303
40 mm glass coverslips Bioptechs PH 40-1313-0319
MEM Mediatech, Inc. #10-010-CV
MEM without phenol red Mediatech, Inc. Mediatech, Manassass, VA

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References

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Comments

4 Comments

  1. HI thanks for this video it was really great. I was wondering if you have tried using A549 cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 12:28 PM
  2. Not to my knowledge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 5:27 PM
  3. Can this system be used to study effect of various antibiotics on P.
    aeruginosa biofilm formation

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2011 - 11:14 PM
  4. Yes, and we have done so (see references #1 and #5 of the protocol).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 8, 2011 - 1:42 PM

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