الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

Biology
 

Summary

سوف نقوم شرح كيفية دراسة تأثير طفرة نقطة واحدة على وظيفة قناة أيون.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189, doi:10.3791/2189 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

سوف نقوم شرح كيفية دراسة الآثار الفنية لإدخال طفرة نقطة في قناة أيون. ندرس بروتين G - بوابات البوتاسيوم داخليا تصحيح (المشار إليها باسم GIRK) القنوات ، والتي تعتبر هامة لتنظيم استثارة الخلايا العصبية. هناك أربعة أنواع مختلفة من الثدييات قناة GIRK مفارز (GIRK1 - GIRK4) -- ونحن نركز على GIRK2 لأنه يشكل homotetramer. التحفيز من أنواع مختلفة من مستقبلات البروتين يقترن G (GPCRs) ، مثل مستقبلات المسكارينية (M2R) ، ويؤدي الى تفعيل قنوات GIRK. الكحول أيضا تنشيط قنوات مباشرة GIRK. وسوف نبين كيفية تحور one الأحماض الأمينية عن طريق تغيير واحد أو أكثر تحديدا النيوكليوتيدات في [كدنا] للقناة GIRK. سوف تتضخم تحور هذا التسلسل [كدنا] في البكتيريا ، وتنقيته ، وسوف يتم تأكيد وجود طفرة النقطة تسلسل الحمض النووي. وسيتم في transfected cDNAs للقنوات GIRK تحور والبرية من نوع الخلايا الجنينية البشرية في الكلى HEK293T تربيتها في المختبر. أخيرا ، سيتم استخدام خلية كاملة التصحيح ، المشبك الكهربية لدراسة التيارات العيانية البوتاسيوم من خلال القنوات وأعرب ectopically GIRK من النوع البري أو تحور. في هذه التجربة ، وسوف ندرس تأثير طفرة في L257W GIRK2 على تفعيل قنوات M2R والتي تعتمد على الكحول.

Protocol

1. إخراج موقع الطفرات

نحن نستخدم تعبير البلازميد الثدييات pcDNA3.1 ترميز [كدنا] لGIRK2 وأعرض عن طفرة نقطة باستخدام Stratagene (اجيلنت تكنولوجيز) Quikchange موقع XL الثاني الموجه عدة الطفرات ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

ويمكن بسهولة ولدت الاشعال تسلسل عبر الانترنت باستخدام برنامج تصميم التمهيدي متاحة في :
https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx؟PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15

ملاحظة : نحن نستخدم معيار إيبندورف 1.5 مل من أنابيب بدلا من أنابيب دينار بحريني 14 مل هو موضح في البروتوكول. ومع ذلك ، فإن استخدام XL10 الذهب E. ultracompetent القولونية سابقة التجهيز مع المركابتويثانول - β ، 30S الوقت الصدمة الحرارية وNZY + (أو NZYM +) وسائل الاعلام هي حاسمة لنجاح الطفرات. إذا كان ذلك ممكنا ، يمكن الهندسة و طفرة إضافية الصامتة التي بإنشاء موقع قيود جديدة تكون مناسبة لفحص المستعمرات متحولة أدناه.

2. Miniprep ، وتسلسل الحمض النووي Maxiprep

2.1 Qiagen miniprep وتسلسلها.

يتم اختيار المستعمرات البكتيرية الفردية وتزرع في مرق LB مع الأمبيسيلين (AMP). نحن اتباع تعليمات الشركة المصنعة لتنقية [كدنا]. ويمكن استخدام خلاصة القيد بسيطة تأكيد تطبيق ناجح للطفرة ، إذا تم إدراج موقع التقييد في الخطوة 1 أعلاه. تسلسل الحمض النووي الآلي ويتم ذلك بعيدا عن الموقع ، وهو ضروري لتأكيد وجود طفرة في [كدنا] ، وكذلك تقييم ما إذا كان هناك أي طفرات غير مرغوب فيها. هذه الخطوة مهمة جدا. نحن تسلسل تسلسل GIRK بأكملها باستخدام الترميز قدما T7 المروج وعكس التسلسل BGH الاشعال هذا الموقع الجناح استنساخ متعددة من البلازميد pcDNA3.1.

ملاحظة : من المهم لتفتيش دقيق لتسلسل مخطط رحلاني كافية لضمان جودة البيانات التسلسل. عالية الجودة ومخطط رحلاني حاد ، وعدم التداخل مع قمم الضوضاء في الخلفية قليلا.

2.2 Qiagen maxiprep.

نحن اتباع تعليمات الشركة المصنعة.

ملاحظة : يتم تضمين هذه الخطوة في تجاربنا لتحسين نقاء [كدنا] ، والتي نجد من المهم بالنسبة ترنسفكأيشن كفاءة.

3. الثقافة وترنسفكأيشن من الخلايا HEK293T

يجب أن تتم جميع هذه الخطوات في غطاء نسيج الثقافة العقيمة.

3.1 خلية ثقافة

HEK293T الخلايا هي ملائمة للاستخدام لأنها سهلة للثقافة (37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 حاضنة ترطيب) ، والوقت سريع النسخ المتماثل ، عالية الكفاءة ترنسفكأيشن وقابلة للتصحيح ، المشبك الكهربية خلية كاملة. خلايا HEK293T أعرب SV40 المستضد T الكبيرة التي تضمن تكرار episomal من pcDNA3.1 البلازميد.

يتم استزراع خلايا HEK293T الجلوكوز في البلدان المنخفضة الدخل وسائل الاعلام DMEM تستكمل مع الجلوتامين - L و 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS). لخلايا الركض ، إضافة 0.25 ٪ التربسين / EDTA إلى خلايا متكدسة HEK293T (90-95 ٪) ، والانتظار حتى فصل من خلايا الأنسجة الطبق ، ثم وقف نشاط انزيم بواسطة وسائل الإعلام بالإضافة إلى ذلك الطازجة التي تحتوي على FBS /. لوحة ~ 1 X 10 5 خلية / إضافة إلى 12 خلية طبق جيدا الثقافة جنبا إلى جنب مع 1 مل من وسائل الاعلام ثقافة خالية من المضادات الحيوية لكل بئر. (1 X 10 5 الخلايا ~ 350 ميكرولتر من تعليق خلية تم الحصول عليها من القارورة T25 متموجة مع وسائل الاعلام معلق 10 مل).

3.2 ترنسفكأيشن

بعد 8-24 ساعة ، وسوف تلتزم الخلايا كلوة الجنين البشري من البلاستيك ونحن على استعداد لترنسفكأيشن. Transfect الخلايا مع قناة 0.2 ميكروغرام [كدنا] ، 0.4 ميكروغرام ميكروغرام مستقبلات و 0.04 [كدنا] [كدنا] YFP M2R باستخدام Invitrogen Lipofectamine 2000. ملاحظة : نحن نستخدم كمية صغيرة من YFP [كدنا] لتحديد الخلايا التي يتم transfected بنجاح (الخلايا الخضراء سيحتوي على الأرجح على حد سواء ومستقبلات القنوات GIRK M2). وسوف تركز على استخدام [كدنا] الحاجة إلى تعديل كل استنساخ.

3.3 التصور الإسفار transfected من الخلايا.

مكان جيد 12 لوحة في مرحلة من مراحل المجهر an مضان مقلوب ، وفحص الخلايا للتعبير YFP. مقارنة لصورة مدينة دبي للإنترنت وتقديم مذكرة من العدد التقريبي للخلايا خضراء. وهذا يوفر تقديرا للكفاءة ترنسفكأيشن.

3.4 إعداد 24 الأطباق وكذلك بولي - D - يسين زلات تغطية المغلفة

تنظيف 12 ملم زلات تغطية الزجاج (وارنر ، CS - 12R) التي تهتز لها بين عشية وضحاها مع Radiacwash ، تليها مع مياه الغسيل منزوع الأيونات وتهتز بين عشية وضحاها في الايثانول 95 ٪. تخزين زلات النظيفة في تغطية 70 ٪ من الإيثانول حتى الاستخدام.

زلات تغطية مكان في صحن بيتري مع الإيثانول ، لهب قبالة الإيثانول باستخدام ملقط والموقد ، ود مكان في بئر واحدة من 24 لوحة معقمة بشكل جيد.

تغطي كل بئر مع 250 ميكرولتر من بولي - D - يسين (PDL) حل [0.2 ملغ / مل] ، والسماح للانزلاق الغطاء الجلوس بين عشية وضحاها مغمورة في محلول معقم PDL تحت غطاء محرك السيارة. 24 لوحة التفاف جيدا في Parafilm لتجنب التبخر.

صباح اليوم التالي ، ونضح PDL 2X يغسل بالماء المعقم. إجازة مفتوحة لوحات لتجف تحت غطاء محرك السيارة ، ثم الغطاء. يمكن أن تكون ملفوفة الأطباق 24 جيدا مع زلات تغطية مغلفة بورق الألمنيوم في العقيمة وتخزن في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.

3.5 الخلايا التصفيحات HEK293T transfected على غلاف زلات

24H بعد ترنسفكأيشن خلايا ، تنقسم الى 24 طبق بشكل جيد (~ 4 X 10 3 خلية / أيضا) التي تحتوي على غطاء زجاجي زلات المغلفة مع البولي يسين - D. ملاحظة : يمكن استخدام الخلايا transfected تصل إلى 24-72 ترنسفكأيشن آخر ساعة. وتنقسم الخلايا لتوفير تغطية زلات التجربة الفردية عن التصحيح الكهربية المشبك.

4. الكهربية

4.1 إعداد حلول

خارج الخلية (حمام) الحل : 20 ملم بوكل ، 140 ملي مول كلوريد الصوديوم ، CaCl 0.5 مم 2 ، 2 مم 2 و 10 MgCl HEPES ملم (7.4 درجة الحموضة التي تم تحديدها مع هيدروكسيد الصوديوم).

حل قسامة حمام 20K المناسبة وإضافة جهري

  • 20K + 2 + با : محلول يحتوي على 1 ملم BaCl 2 : مثبط محددة من الداخل التيارات تصحيح
  • 20K + كرباكول : حل مع كرباكول ميكرومتر 5 : ناهض M2R محددة ؛ الأزواج M2R لمجموعة من البروتينات التي تفتح قنوات GIRK
  • 20K + الايثانول : حمام حل تحتوي على 100 ملي EtOH لتنشيط قنوات مباشرة GIRK

حمام حلول مكان في المحاقن (الحاويات الحل) من نظام تبادل نضح السريع. ملاحظة : نحن نستخدم صمام قرصة ارنر نظام للسيطرة على حلول الحمام. ينصح أنابيب PE.

الحل الكهربائي الداخلي / : 140 مم بوكل ، 20 مم كلوريد الصوديوم ، 5 ملي EGTA و 5.4 ملي MgCl 2 ، 10 HEPES ملم (7.4 درجة الحموضة) للاعبي التنس المحترفين مع 2.5 مم 2 و 0.3 ميكرومتر K لى 2 GTP.

يمكننا أن نجعل من دون حل الكهربائي وGTP ATP. نحن نستعد للبطولة بشكل منفصل aliquots وGTP ، التي يتم تخزينها في -80 درجة مئوية ، وإضافة إلى الحل الكهربائي في يوم من التجربة. نستمر في المحاقن مع الحل النهائي الكهربائي على الجليد للحفاظ على ATP / GTP. نحن تصفية العقيمة (0.2 ميكرون) وحلول داخلية / خارجية لمنع نمو الجراثيم والحد من احتمال انسداد الأنابيب ، والقطب.

4.2 سحب أقطاب

نستخدم Narishige خطوتين مجتذب الرأسي والبورسليكات الزجاج الكهربائي من آلات وارنر (1.5 مم الخارجي ، وقطرها الداخلي 0.86 مم و 7.5 سم طول) للحصول على أقطاب 3-7 MΩ مع المقاومة عندما امتلأت حل داخل الخلايا.

ملاحظة : من الضروري تحديد معايير لتجريبيا مجتذب الكهربائي ونوع الزجاج الكهربائي في المختبر الخاص بك. لدينا مجتذب العمودي ، ونحن نستخدم إعداد حرارة 60،2 لسحب الأولى و43 ~ للسحب الثاني.

4.3 كامل الخلية التصحيح لقط

  1. جبل تغطية زلة في صحن 35 مم باستخدام كمية صغيرة من الفازلين ، مع تغطية حل الخارجية وطبق على خشبة المسرح من مكان an المجهر مضان مقلوب. استخدام مدينة دبي للإنترنت على التركيز وإيجاد خلايا ، والتحول إلى YFP مضان لتحديد موقع الخلايا YFP إيجابية.
  2. غيض موقف متعددة نضح قرب خلية الأخضر (20-30 ميكرون من خلية من الخلايا = الفائدة طول 2-3 وبصرف النظر).
  3. ملء مع أقطاب الحل ، إرفاقه headstage من مكبر للصوت 200B Axopatch (آلات أكسون) مع الإعدادات الأولية التالية : كسب 1 ، تكوين : كامل الخلية β = 1 ، V - وضع المشبك.
  4. تطبيق الضغط الايجابي على مسرى لمنع انسداد ماصة ، واستخدم لوضع تتلاعب غيض الكهربائي فقط فوق الخلية.
  5. إلى الصفر احتمال ماصة ، حدد الزر اختبار لتسليم الختم خطوة جهد الاختبار. فإن الخطوة 5 بالسيارات الجهد مستطيلة تظهر في إطار اختبار ختم Clampex. ضبط الجهد الماصة أوفست على مكبر للصوت لجعل خط الأساس الحالية إلى 0 غ. بدلا من ذلك ، إمكانات ماصة صفر عن طريق التحول وضع مكبر للصوت محدد إلى الخامس المسار ووضع مفتاح العداد Vtrack الجهد واستخدام الماصة أوفست على مكبر للصوت لإعادة التيار الكهربائي عن مكبر للصوت عرض متر الى "0.00".
  6. الاختيار مقاومة الكهربائي باستخدام ختم الأمر اختبار البرنامج 8.2 Clampex (ينبغي MΩ 3-7).
  7. فتح ملف المحفوظة أو بروتوكول إنشاء بروتوكول جديد. لفتح ملف بروتوكول اختر من القائمة الرئيسية ثم الحصول على بروتوكول مفتوح واختيار بروتوكول الجهد حفظ الملف. عن هذه التجربة ، تم إنشاء لعقد بروتوكول المحتملة في الغشاء - 40mV ، وتقديم الجهد واحدة 50 مللي خطوة لبالسيارات -100 و المنحدر إلى +40 بالسيارات أكثر من 200 مللي ثانية. يتم تنفيذ هذا البروتوكول كل 2 ثانية. بروتوكول يسمح لمراقبة الطريق المنحدر من تصحيح الانعكاس المحتمل والداخل من القنوات GIRK. لقنوات ايون الجهد مسور ، قد خطوة الجهد مستطيلة تكون أكثر ملاءمة.
  8. خلية باستخدام نهج التسوية الدقيقة للمناورة ، والإفراج عن الضغط الايجابي ، وبعد ملامسة سطح الخلية تطبيق الضغط السلبي ، ورصد زيادة في المقاومة في إطار الذبذبات ختم اختبار. المقاومة هي مرة واحدة في نطاق GΩ ، أغلقت القطب على الغشاء (Gigaseal شكلت).
  9. تطبيق نبضة من الضغط السلبي لكسر غشاء الخلية والوصول إلى الخلية. مرة واحدة في تكوين خلية كاملة ، وسوف تسجل زيادة تيارات سعوية.
  10. التبديل إلى اختبار في غشاء Clampex وكتابة وصول رأس المقاومة ، مقاومة الغشاء رو ، سم السعة والتحقق من الغشاء لعين تناسب المنحنى الأسي النظرية الحالية لcapacitative الحقيقي. غشاء السعة متناسبة مع حجم الخلية ، وسيتم استخدامها لاحقا لحساب الكثافة الحالية.
  11. التبديل إلى ختم اختبار ، مجموعة V - خارج (غشاء المحتملة) ل-40 بالسيارات والتصفية في 10 كيلوهرتز
  12. تعويض عن غشاء السعة والمقاومة في سلسلة مكبر للصوت مع الخطوات التالية :
    1. تبديل CAP خلية كاملة على التبديل. ضبط خلية CAP الجامعة وبطلب المقاومة SERIES ذهابا وإيابا ، حتى تحصل على نبض اختبار مسطح. قد تحتاج أيضا إلى ضبط مفتاح ماصة سعة CAP FAST.
    2. بدوره على مقبض تنبؤ ٪ الى نحو 60-80 ٪ ، ومرة ​​أخرى إعادة ضبط الجامعة CAP CELL والطلب المقاومة سلسلة (قد تضطر إلى ضبط ماصة FAST التعويض السعة مقبض الباب أيضا).
    3. بدوره على ٪ COMP إلى 100 ٪ بدون تتأرجح الخلية ، بينما كان يحاول الحفاظ على نبض شقة من خلال إعادة ضبط CAP خلية كاملة والمقاومة سلسلة (قد تضطر إلى ضبط ماصة سعة مقبض التعويض CAP FAST كذلك). ضبط الفارق عن طريق تقليل الوقت ثابت.
    4. كتابة قيم سم (السعة الغشاء) ، روبية (سلسلة المقاومة) ، COMP ٪ ، PRED ٪ والفارق الزمني تعيين على مكبر للصوت في دفتر الملاحظات. ينبغي أن يكون سم وروبية تقريبا نفس سم ورو قياسها في اختبار الأغشية أعلاه.
  13. بدوره على صمام حل خارجي للتحكم في حل الحمام. تعيين مكبر للصوت 8 القطب بسل تصفية ل2kHz ، فتح بروتوكول المشبك الجهد وتبدأ التيارات التسجيل.
  14. نسجل التيارات GIRK باستخدام بروتوكول المنحدر خطوات لبالسيارات -100 لمدة 50 مللي ثانية ثم سلالم من 100 فولت إلى +40 بالسيارات أكثر من 200 مللي ثانية ، ويتم تسليم كل 2 ثانية. بروتوكول منحدر يسمح لرصد احتمال انعكاس للممتلكات والتصحيح الداخلي لقنوات GIRK. في درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية) ، وينبغي عكس GIRK الحالي بالقرب -50 بالسيارات (مع بوكل 20 ملي في الحمام) ، والتي تقع بالقرب من المحتمل التوازن المحسوب لK (K E = -50 فولت) ، ثم تبقى شقة إلى حد ما في إمكانات إيجابية لK E.
  15. البروتوكول التجريبي : بعد تسجيل خط مستقر ، والتحول إلى حل 20K + كرباكول وانتظر ذروة ردا على ذلك ، التبديل إلى حل حمام 20K ، 20K ثم تطبيق + الإيثانول وتنتظر ردا الذروة ، ثم التبديل إلى حل حمام 20K ، وأخيرا 20K + 2 + با الحل. خلال تطبيق هذه الأدوية سوف ترى تغييرات في السعة التيارات GIRK (أكثر وضوحا في بالسيارات -100). لاحظ عدد تتبع المقابلة لتطبيق حلول خارج الخلية مختلفة في دفتر الملاحظات. وهناك ملف واحد Clampfit تحتوي على كافة الاحتلالات للتجربة بأكملها.

5. تحليل البيانات

نستخدم Clampfit 9.2 برامج لتحليل البيانات GIRK التيارات في بالسيارات -100.

  1. فتح الملف مع التسجيل ، مجموعة المؤشر في بالسيارات -100. افتراضيا سترى كل آثار مضافين على الشاشة. بالضغط على "كتابة المؤشرات" رمز سيتم إنشاء اكسل مثل جدول مع البيانات الرقمية.
  2. عن طريق تعيين X لتتبع عدد وY العمود إلى العمود المؤشر والضغط على "إنشاء رسم بياني" الرمز الذي يمكن أن يوجه بسرعة مؤامرة الوقت أثناء التجربة.
  3. حساب الحالية القاعدية من خلال طرح الحالية في وجود با 2 + من الجاري سجلت في محلول الارواء الخارجية وحدها ("20K الحالية" ناقص "20K + 2 + با الحالية"). حساب التيارات الناجمة عن طرح الحالية القاعدية في 20K من التيارات المنشط ("20K + كرباكول الحالية" ناقص "20K الحالية" ، "20K + الايثانول الحالية" ناقص "20K الحالية"). حساب الكثافة الحالية (PA / PF) بقسمة السعة الحالية غشاء (قراءة مباشرة من مكبر للصوت). تفعيل حساب في المئة من خلال تقسيم التيارات التي تحدثها التيارات القاعدية وضرب 100.

6. ممثل النتائج

يجب أن تكون قادرة على السجل الحالي من الخلايا transfected مع البرية من نوع القنوات. لقياس قنوات GIRKد في حل خارج الخلية التي تحتوي على 20 ملي K + (و 145 ملي K + الخلايا) التي ينبغي أن تبدي تصحيح الداخل قوية واحتمال انعكاس بالسيارات -50 ~ ، الذي هو خاصية أساسية من قنوات البوتاسيوم. سوف الحالية من النوع البري بناء على طلب زيادة بقوة كرباكول (3-5 أضعاف الزيادة الحالية القاعدية) والرد بالمثل على الايثانول 100 مم. ملاحظة : توقيع اتفاقية لالكهربية الحالية هو ان الداخل هو سلبي وايجابي نحو الخارج الحالية. لطفرة L257W في جيب ملزمة GIRK2 الكحول ، سترى ردود الموهن لكلا كرباكول والايثانول. هذا يشير إلى أن تشارك في الكحول وL257 G تنشيط بروتين GIRK2 القنوات. لمزيد من الأمثلة لنتائج GIRK2 الطفرات ، انظر منشور صدر مؤخرا عن أريال وآخرون 1.

الشكل 1
الشكل 1. نافذة 8.0 Clampfit الملف وتظهر بيانات لتسجيل GIRK2 من النوع البري. اللوحة اليسرى العليا يظهر فرضه الاحتلالات سجلت ردا على منحدر بروتوكول الجهد في وجود مختلف الحلول الخارجية باه. يتم وضع المؤشر 1 في بالسيارات -100. مكتوبة قيم المؤشر إلى جدول (اللوحة اليمنى). اللوحة اليسرى السفلى ويبين عدد من مؤامرة ضد الاجتياح ، الحالية. ملاحظة الزيادة في الحالي (انحراف النزولي) مع الإيثانول (EtOH) وكرباكول (كارب) وتثبيط الحالية مع با 2 +.

الشكل 2
الشكل 2. نافذة 8.0 Clampfit الملف وتظهر بيانات لتسجيل GIRK2 - L257W متحولة. الأوصاف هي نفسها كما في الشكل 1. لاحظ فقدان التنشيط (كارب) والحد من كرباكول EtOH بفعل التيارات في القنوات متحولة.

Discussion

موقع الموجه الطفرات هو النهج الكلاسيكي لدراسة بنية وظيفة علاقات القنوات الأيونية. لأنه يقوم على فرضية أن طريق تغيير بقايا تنتقد القناة الايونية ينبغي للمرء أن يكون قادرا على مراقبة التغيرات وضوحا في وظيفة القناة. في المقابل ، يمكن عرض العديد من الطفرات في موقف غير الحرجة دون حدوث اضطرابات كبيرة في وظيفة القناة. عادة ، يتم تحور لأول مرة في المسألة إلى بقايا ألانين ، صغيرة غير القطبية الأحماض الأمينية ، تليها لطفرة التربتوفان ، وهو أكبر من الأحماض الأمينية 2. إذا كانت بقايا المهم وظيفة القناة ، سوف تغير كل من الطفرات نشاط القناة. إذا تحولت بقايا أقل أهمية ، وآثار الطفرة ، وبخاصة للألانين وغالبا ما تكون غير ملحوظة. الطفرات التربتوفان هي أكثر احتمالا للتسبب تغيرات بسبب العراقيل المرتبطة الفراغية حجم التربتوفان. في كثير من الأحيان ، يمكن استخدام هذه المعلومات عندما تفتقد الهيكلية ، طفرة منهجية لألانين أو التريبتوفان في غضون جزء من قناة (تسمى ألانين أو المسح التربتوفان) لتحديد موقع بقايا حرجة. ومن المهم أن نلاحظ أن الحيوانات المستنسخة يمكن إعداد متعددة مع الطفرات نقطة مختلفة في السماح موازية لاختبار مخلفات متعددة ضمن فترة زمنية قصيرة نسبيا. في الآونة الأخيرة ، أصبحت هياكل الكريستال متعددة من القنوات المتاحة 3،4،5. يمكن استخدامها لاقتراح مخلفات الرئيسية المحتملة لفحصها باستخدام النهج الموصوفة في هذا البروتوكول.

وينبغي على قياسات البرية من نوع القناة ترافق دائما قياس قناة متحولة لتكون بمثابة مراقبة إيجابية للتأكد من أن أجريت تجارب ترنسفكأيشن والكهربية بشكل صحيح. الطفرات قد يؤدي إلى نقطة عدم وجود الوظيفية الحالية ، وهي مشابهة للائحة الحالية من النوع البري أو تغيير نشاط القناة. قد تفتقر الحالية قابلة للقياس يكون نتيجة لسوء الاتجار لطي أو تغييرها. في مثل هذه الحالة قد يكون من المفيد معرفة ما إذا كانت القناة يتاجر بشكل صحيح على السطح باستخدام مقايسة biotinylation أو تلطيخ المناعي ضد العلامة خارج الخلية (بدون permeabilization الخلية) للتمييز بين القنوات غير وظيفية في غشاء البلازما وقنوات الاحتفاظ داخل الخلية . وأخيرا ، فإنه من المستحسن أن التحقيق ليس فقط النشاط القاعدي للقناة ولكن أيضا من عواقب الطفرات بشأن تنظيم القناة. ويمكن دراسة آليات مختلفة للتعديل وظيفة قناة تبعا للقناة أيون ذات الاهتمام بما في ذلك تنظيم مجموعة من البروتينات ، PIP2 ، الأيونات ATP التركيز ، والفسفرة (باستخدام التيروزين ، أو السيرين ثريونين الطفرة) ، أو ubiquitination sumoylation (باستخدام الطفرة يسين) وفتاحات أو حاصرات قناة مباشرة.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأدلى عملنا بفضل الدعم المالي من صندوق الهبات ماكنايت علم الأعصاب (PAS) ، والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات (R01 DA019022 ؛ PAS) ، وقبل المعاهد الوطنية للصحة NRSA الدكتوراه زمالة للسلطة الفلسطينية (F31AA017042) من المعهد الوطني لتعاطي الكحول والإدمان على الكحول. وزودت متحولة GIRK2 - L257W الدكتور أريال Prafulla.
مضان المجهر ورعايته قدمت تفضلت آلات لايكا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals Sigma Varies
Mini Prep Kit Qiagen 27104
Radiacwash Biodex 005-100
Poly-D-lysine hydrobromide BD Biosciences CB40210 Poly-L-lysine can also be used
Maxi Prep Kit Qiagen 12263
QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit Stratagene 200512-5
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
Cover slips ˆ… 12 mm Warner Instruments CS-12R
Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall Warner Instruments G150-3
Inverted fluorescence microscope Leica DMI3000 B
Electrophysiology Nikon/
Leica/
Zeiss
Any inverted DIC
(Hoffmann)
microscope with fluorescence
Amplifier Molecular Devices Axon Axopatch 200B amplifier
Perfusion system Warner Instruments VC-6 Perfusion MM-6
Digitizer Molecular Devices Digidata 1320 digitizer
Manipulators Sutter Instruments Manipulator: MP-85
Electrode Puller Narishige PC10 vertical electrode puller
Isolation Table Technical Manufacturing Corporation Air table

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation. Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).
  2. Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis. J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).
  3. Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &, B. T., MacKinnon, R. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science. 280, 69-77 (1998).
  4. Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera. EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).
  5. Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 Å resolution. Science. 326, 1668-1674 (2009).

Comments

1 Comment

  1. The procesure of patch clamp is very useful for me. I am new using 200B. I saw you using syringe to rupture cells. Could you send me a picture of syringe connecting system? My syringe system is not working well. Thanks.

    Reply
    Posted by: zhigang j.
    August 23, 2013 - 1:09 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics