Strategies for Study of Neuroprotektion von Cold-Vorkonditionierung

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Summary

Wir versuchen, die neuronalen Immunsystems Signalisierung für Kälte-Vorkonditionierung als Mittel, um neue Targets für therapeutische Entwicklung zu identifizieren, um Gehirn vor Verletzungen schützen Beginn zu definieren. Wir präsentieren Strategien für solche Arbeiten, die biologische Systeme, experimentelle Manipulationen sowie technische Fähigkeiten, die in hohem Maße reproduzierbar und empfindlich sind, erfordern.

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Mitchell, H. M., White, D. M., Kraig, R. P. Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning. J. Vis. Exp. (43), e2192, doi:10.3791/2192 (2010).

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Abstract

Neurologische Verletzungen ist eine häufige Ursache von Morbidität und Mortalität von Narkose und chirurgischen Prozedere, dass durch die Entwicklung wirksamer gelindert werden könnte, einfach zu verwalten und sicher Vorkonditionierung Behandlungen. Wir versuchen, die neuronalen Immunsystems Signalisierung für Kälte-Vorkonditionierung als Mittel, um neue Targets für therapeutische Entwicklung zu identifizieren, um Gehirn vor Verletzungen schützen Beginn zu definieren. Low-Level-pro-inflammatorischen Mediators Änderungen der Signalgebung im Laufe der Zeit sind für Kalt-Vorkonditionierung Neuroprotektion unerlässlich. Diese Signalisierung ist im Einklang mit den Grundprinzipien der physiologischen Klimaanlage hormesis, was bedeutet, dass irritative Reize einen Schwellenwert Größenordnung erreichen mit genügend Zeit zur Anpassung an die Reize für den Schutz sichtbar zu machen müssen.

Dementsprechend erfordert Abgrenzung des Immunsystems Signalisierung in kalt-Vorkonditionierung Neuroprotektion beteiligt, dass biologische Systeme und experimentelle Manipulationen und technischen Kapazitäten sind sehr gut reproduzierbar und empfindlich. Unser Ansatz ist es, Hippocampus Scheibe Kulturen als den Einsatz in vitro Modell, das sich eng an ihre in-vivo-Pendants mit Multi-synaptischen neuronale Netze von reifen und ruhenden macroglia / Mikroglia beeinflusst. Diese Gliazellen Zustand ist besonders wichtig für Mikroglia, da sie die wichtigste Quelle von Zytokinen, die wirksam sind in der Femtomolbereich sind. Auch, Slice Kulturen in vitro kann für mehrere Wochen aufrechterhalten werden, was genügend Zeit, um die Aktivierung Reize hervorrufen und zu bewerten adaptive Reaktionen. Schließlich können Umgebungsbedingungen genau kontrolliert werden mit slice Kulturen, so dass Cytokine Signaling von Kalt-Vorkonditionierung kann gemessen werden, nachgeahmt werden, und moduliert werden, um den kritischen Knoten Aspekte zu sezieren. Cytokine Signaling System analysiert erfordern den Einsatz von empfindlichen und reproduzierbaren Multiplex-Techniken. Wir verwenden quantitative PCR für TNF-α zum Screening auf Mikroglia-Aktivierung durch quantitative real-time qPCR Array-Screening, um Gewebe-weiten Zytokin Veränderungen zu bewerten gefolgt. Letzteres ist eine sehr sensitive und reproduzierbare Mittel, um mehrere Zytokin-Systems zu messen Änderungen der Signalgebung gleichzeitig. Wesentliche Änderungen sind mit gezielten qPCR und dann Proteindetektion bestätigt. Wir Sonde für die Gewebe-basierte Zytokin-Protein Veränderungen mit Multiplex-Mikrosphären durchflusszytometrischen Assays unter Verwendung von Luminex-Technologie. Cell-spezifischen Zytokin-Produktion ist mit Doppel-label Immunhistochemie bestimmt. Zusammengenommen können diese Hirngewebe Vorbereitung und Stil zu verwenden, gekoppelt an die vorgeschlagenen investigative Strategien, die optimale Vorgehensweise zur Identifizierung potentieller Ziele für die Entwicklung neuartiger Therapeutika, die die Vorteile von Kälte-Präkonditionierung imitieren konnte.

Protocol

Sterile und aseptische Techniken sind für die Vorbereitung, Wartung und Nutzung der Scheibe Kulturen über längere Zeiträume. Darüber hinaus ist die Begründung für unseren Einsatz von Slice Kulturen erst nach 18 Tagen in vitro auf Beweise, dass erregenden und hemmenden zeigt synaptischen Übertragung wird am meisten ausgereifte und Gliazellen (Astrozyten und Mikroglia) zur Ruhe und im Einklang mit ihrer Basis in vivo Kollegen (Abbildung 1 ).

1. Vorbereitung und Wartung des Hippocampus Scheiben Kulturen

  1. Am selben Tag der Kultivierung, äquilibrieren sterile Einsätze in 1,1 ml Wachstumsmedium bestehend aus 50 ml Basal Medium Eagle, 25 ml Earle Balanced Salt Solution, 23 mL Pferdeserum, 0,5 mL Glutamax (200 mM Lager), 0,1 mL Gentamicin (10 mg / mL Lager), 0,4 mL Fungizone (250 pg / mL), 1,45 ml D-Glucose (45%; 42 mM gesamt).
  2. Keep Sechs-Well Schalen in einem Brutschrank bei 36 ° C, 5% Kohlendioxid und 95% Luftfeuchtigkeit.
  3. Für maximale Sterilität, wird die Kultivierung idealerweise in einem HEPA-Filter Überdruck Kultur Raum mit der Luft auch über geschlossene ultra-violettes Licht Luft-Reinigung-Fans gereinigt getan, und während des Tragens einer sauberen Kittel und sterile Handschuhe erstreckte sich über den Laborkittel Ärmel .
  4. Bereiten Scheibe Kulturen in einer BSL-1 laminar Dunstabzug, dass alle benötigten Materialien (dh McIlwain Gewebe Chopper, bezogen Teflon-Einsätze, gestochen Messereinheit Dissektion kalt (3-4 ° C) Platte, chirurgische Instrumente, und Dissektion Petrischalen) umfasst mit einer Wild (M8) Stereomikroskop.
  5. Lassen Sie die Kühlplatte (run aus einem nahe gelegenen Wasserbad) auf 3-4 ° C Temperatur für mindestens 30 min zu erreichen, während zur gleichen Zeit auszusetzen Dissektion Materialien mit UV-Licht weiter zu etablieren Sterilität der Dissektion Bereich und Werkzeuge.
    1. Die Laminarströmungshaube wird regelmäßig getestet, um sicherzustellen, das UV-Licht hat genügend Kraft auf die Tischplatte Ebene mit einer kurzwellige ultraviolette Licht messend.
  6. Verwenden Sie Rattenjungen (P8-P9 und ~ 23 g / ea. Aus Würfen getötet und 10 bei der Geburt) narkotisiert mit 100% Kohlendioxid in einem kleinen Tier-Box auf einer aseptischen Bank hinter den Dunstabzug und gereinigt durch Eintauchen in 100% Ethanol in der Abzug, in dem alle weiteren Schritte durchgeführt werden.
  7. Enthaupten Welpen in einer Hälfte eines 100 mm Petrischale und platzieren Sie den Kopf in der zweiten Hälfte, mit einem frischen Teller pro Welpe.
  8. Dissect aus dem Gehirn und setzen Sie es in die untere Hälfte einer 60 mm Petrischale mit 10 mL sterile Kälte (3-4 ° C) Gey-Balanced Salt Solution mit D-Glucose zu 6,5 ergänzt mg / mL (dh 7,5 ml von 45 % d-Glucose pro 500 ml Flasche Gey ist.
  9. Dissect aus dem Hippocampus von jeder Hemisphäre und legen Sie sie auf eine Teflon Festplatte für die McIlwain Chopper. Spread-Medien vom Hirngewebe mit einem Iris-Spachtel zu schneiden Hirnschnitten an der Einhaltung der Klinge zu verhindern.
  10. Section der hippocampi senkrecht zu ihrer Längsachse mit der McIlwain Chopper, mit Schnittdicke bei 350-400 um eingestellt.
  11. Munter waschen frisch geschnittenen Scheiben aus der Teflon-Einsätze und in die obere Hälfte einer 60 mm Petrischale mit kaltem (3-4 ° C) Gey-Balanced Salt Solution mit 6,5 mg / mL D-Glucose mit einem mL Pipette.
  12. Überprüfen Sie Scheiben unter dem Stereomikroskop für eine intakte Gyrus dentatus und pyramidalen Zellschicht.
  13. Gently Ort der größten Scheiben auf einen Einsatz (drei pro Einsatz und 12 Scheiben / pup) und unter normalen Inkubationsbedingungen im Brutschrank zu halten gereinigt alle sechs Monate kalibriert und alle drei Monate mit einem Infrarot-Kohlendioxid-Analysator und Thermometer genau auf eine Dezimalstelle.
  14. Refresh Nährmedien in Petrischalen alle 3-4 Tage in vitro mit einem BSL-2 Kapuze und sterile Technik.
  15. Nach 7 Tagen in vitro, ersetzen Medien mit 1,1 ml serum-freien Medien (SFM), bestehend aus 97 ml Neurobasal, 2 mL B27, 0,5 mL Glutamax (200 mM), 0,1 mL Ascorbinsäure (0,5 M) und 0,68 ml D- Glucose (45%; 42 mM gesamt).

2. Pre-Bildschirm Vitality von Slice Kulturen

  1. Aliquot Sytox Grüne Lager (10 l) und bei -20 ° C.
  2. Verdünnen Sytox Lager auf 500 nM arbeiten Konzentration im Serum-freien Nährmedien (dh 10 l in 100 mL Medien). Shop Sytox Medien bei 4 ° C und die Nutzung von bis zu einer Woche.
  3. Legen Sie 1,1 ml Sytox pro Well in 6-well Kulturschalen und warm bis 36 ° C bei 5% Kohlendioxid für einen ausreichenden Zeitraum (dh, wie durch das Fehlen von Kondensat auf Kulturschalen belegt).
  4. Inzwischen ermöglichen eine UV-Lampe (dh einer fluoreszierenden Lichtquelle mit einem FITC-Filter) über ein stabilisiertes Netzteil mit Strom versorgt, um eine einheitliche Lichtintensität zu gewährleisten, um Temperatur für mindestens 20 min warm.
  5. Legen Scheibe Kulturen (18 Tages in vitro) in Sytox-Medien für 10 min und dann wieder auf dem Bildschirm für irreversible CA1-Pyramidenzellen Schicht Verletzungen SFM.
  6. Zeige Kulturen auf eine aseptische Oberfläche eines inversen Mikroskop, unter 5-facher Vergrößerung untersucht.
  7. Accept Kulturen mit weniger als 30 Sytox positive Zellen in der CA1 Region.

3. Cold-Vorkonditionierung

  1. Legen Sie 1,1 ml SFM in 6-well Kulturschalen. Lassen Sie gekühlte Medien (z. B. 30 ° C) in einem Inkubator (5% Kohlendioxid und 95% Luftfeuchtigkeit) äquilibrieren für mindestens 20 min vor dem Gebrauch. Das Fehlen von Kondensat auf Kulturschalen zeigt an, dass ausreichend Zeit für die Äquilibrierung aufgetreten.
  2. Transfer-Scheibe Kultur Einsätze zu kühlenden Medium (1,1 ml / well) Tablett bei 30 ° C und Inkubation für 90 min mit sterilen Technik in einem BSL-2 Abzug gehalten.
  3. Legen Scheibe Kulturen wieder in den normalen SFM unter normalen Inkubationsbedingungen für 24 Stunden wieder mit sterilen Technik über ein BSL-2 Dunstabzug.

4. Exzitotoxische Injury

  1. Begin Stück Kultur experimentellen Einsatz prescreen indem auf Sytox Medien für 20 min.
    1. Erwerben Sie einzelne Schnittbilder mit Scheiben an einer Orientierung ähnlich wie bei prescreen (Hintergrundbilder) verwendet gepflegt. Dies geschieht, indem eine Markierung nach links und zwei Marken auf der rechten Seite mit Filzstift auf "10" und "zwei" Uhr auf jeden Einsatz getan. Dieses Manöver erleichtert mit dem gleichen Gebiet von Interesse Form für jede Kultur der Bilder festzulegen.
  2. Zur gleichen Zeit, auf die UV-Lampe Quelle wiederum (unter geregelte Stromversorgung) und CCD-Kamera für mindestens 20 min, so dass sie warm Temperatur.
  3. Dann kalibrieren der CCD-Kamera mit einem Fluorescein-Standard.
    1. "Clear" die CCD indem für 50 Zyklen Licht, es sei denn eine automatisch kalibrieren CCD-Kamera verwendet wird. Wir haben ein Programm innerhalb MetaMorph gegründet, um unsere Cool-Snap-Kamera für Verletzungen Quantifizierung verwendet klar.
    2. Platz 10 ul von Fluorescein in 90 mL PBS (10 mM Phosphat-Puffer, 150 mM NaCl bei 7,3 pH) und Wirbel.
    3. Je 10 ul von Fluorescein Mischung auf eine 100 um tief Hämazytometer.
    4. Passen Vollbild Intensität 1000/4096.
  4. Sammeln Sie Hintergrund-Bilder der Scheibe Kulturen zu überprüfen, ob kalt-Vorkonditionierung nicht zu Verletzungen führen (dh verwerfen Kulturen mit ≥ 250 CA1 Region von Interesse Intensität).
  5. Bereiten Sie Schalen mit NMDA-Medien.
    1. Bereiten 10 mM Stammlösung von NMDA mindestens einmal wöchentlich.
    2. Für excitotoxic Verletzungen, verdünnte NMDA um 20 50 uM in SFM und Gleichgewicht in den normalen Inkubationsbedingungen für mindestens 20 min.
  6. Mit dem BSL-2 Kapuze und sterile Technik, Ort-Einsätze in den NMDA-Medien für 60 min unter normalen Inkubationsbedingungen.
  7. Spülen NMDA off von Einsätzen durch Eintauchen jeder Einsatz dreimal in drei separate 60 mm Platten mit je 10 mL Neurobasal bis 36 ° C erwärmt Verwenden Sie nicht mehr als drei Einsätze für jede Gruppe von drei 60 mm Geschirr spülen.
  8. Zurück Kulturen zum normalen Inkubationsbedingungen.
  9. Sammeln Verletzungen Bilder 24 Stunden nach der Exposition gegenüber NMDA.
    1. Kalibrieren Kamera mit Fluorescein-Standard, wie oben beschrieben.
    2. Legen Kulturen in Sytox Medien für 20 min.
  10. Quantifizieren Verletzung:
    1. Mit MetaMorph Software, zeichnen ein AOI rund CA1 Region.
    2. Messen Sie die Intensität der ausgewählten Region für "Verletzungen".
    3. Kopieren und Einfügen von AOI von "Verletzungen" auf "Hintergrund" Bild.
    4. Geben Sie die Werte von "Verletzungen" und "Hintergrund" in Excel.
    5. Quantifizieren "Zähler-Hintergrund" für Steuerungs-und Cold-vorkonditioniert Kulturen.
    6. Mit Hilfe statistischer Software (zB SigmaStat), führen entsprechende statistische Tests, um Verletzungen der experimentellen Gruppe (n) im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, die immer mit jedem experimentellen laufen sollten einbezogen werden zu vergleichen.
    7. Hinweis: Wenn Verletzungen Ebenen sind in einem Tag nach der Verletzung Bilder niedrig, Carry-Out Experiment auf zwei von drei Tagen. Schutz in Kulturen können durch einen Mangel an Anfälligkeit für Verletzungen (Abbildung 2) maskiert werden.
    8. Hinweis: Das Thema "Schutz" hat uns veranlasst, auf die Messung Verletzungen Ebenen und nicht-Verhältnisse für alle Vergleiche (Abbildung 3) zu bewegen.

5. Co-Behandlungen mit Cold-Vorkonditionierung Applied

Ein wichtiger Vorteil der Scheibe Kulturen ist, dass ökologischer Zustands genau kontrolliert werden kann. Dies bedeutet, dass Cytokine Signaling von kalt-Vorkonditionierung kann gemessen werden, nachgeahmt werden, und moduliert werden, um den kritischen Knoten Aspekte zu sezieren.

  1. Rekombinante (zB Agonist) Proteine ​​und neutralisieren (z. B. Antikörper oder löslicher Rezeptor)-Proteine ​​können verwendet werden, um zu imitieren und zu modulieren bzw. Cytokine Signaling werden.
  2. Im Allgemeinen sind diese Proteine ​​rekonstituiert und gespeichert als Aliquots bei -20 ° C für den Einsatz innerhalb von sechs Monaten eine ausreichende Bioaktivität zu gewährleisten.
  3. Hier beschreiben wir beispielhafte Verwendung von TNF-α-Signalisierung Aufhebung Verwendung von löslichen TNF-Rezeptor 1 (sTNFR1).
    1. Rekonstituieren sTNFR1 in 0,1% Rinderserumalbumin in PBS zu einem Bestand von 50 ug / mL, Aliquot in 20-50 ul Mengen und bei -20 ° C.
    2. Für den Einsatz, verdünnte sTNFR1 bis 200 ng / mL in Scheiben Kulturen Nährmedien erwärmt auf 36 ° C und Ort Slice Kulturen in sTNFR1-Medien für 20 min vor der Kälte-Vorkonditionierung.
      1. Hinweis: Um Varianz zu reduzieren, ist es am besten, 200 ng / mL sTNFR1 in ein großes Volumen an Nährmedium verdünnen (dh 1:250 Verdünnung von 50 ug / mL sTNFR1 Lager in 10 ml Wachstumsmedium benötigt 40 ul sTNFR1) vs Hinzufügen sTNFR1 direkt in jede Vertiefung in Schale (4,4 mL pro 1,1 ml Medium).
    3. Verdünnen sTNFR1 bis 200 ng / mL in Medien und Platz 1,1 ml in jeder Einsatz gut. Lassen Medien bis 30 ° C für mindestens 20 min vor der Belichtung Scheibe Kulturen zu kalt Vorkonditionierung für 90 min, wie oben beschrieben Gleichgewicht zu bringen.
    4. Legen Scheibe Kulturen wieder bei 36 ° C mit sTNFR1 in Medien.
    5. 24 Stunden später aussetzen Kulturen Sytox Medien für 20 min wie zuvor beschrieben, und sammeln Sie Hintergrund-Bilder zu diesem kalt-Vorkonditionierung nicht verletzen Kulturen zu überprüfen.
  4. Quantifizieren Daten wie oben beschrieben.
  5. Refresh-Medien mit Komponenten alle 3-4 Tage in vitro.

6. Sofortige und verzögerte exzitotoxische Injury nach Cold-Vorkonditionierung

  1. Unmittelbare Verletzungen mit Kalt-Vorkonditionierung.
    1. Führen kalt Vorkonditionierung wie oben beschrieben.
      1. Nach Kälte-Vorkonditionierung Rückkehr Kulturen zum normalen Inkubation für 20 min.
      2. Dann setzen Kulturen auf 20-50 uM NMDA Verletzungen für eine Stunde.
      3. Spülen Kulturen dreimal wie oben beschrieben und zum Normalbetrieb zurückzukehren Inkubation.
      4. Nach 24 Stunden erwerben Verletzungen Fotos wie oben beschrieben.
  2. Verzögerte Wirkung von Kälte-Vorkonditionierung.
    1. Führen kalt Vorkonditionierung wie oben beschrieben.
    2. Expose Kulturen NMDA Verletzungen 24 Stunden später, wie oben beschrieben.
    3. Weiter, um Verletzungen Bilder für Erwerb von bis zu 3 Tage nach der ersten kalten Vorkonditionierung auf Schutz zu überwachen.

7. RNA Isolation

Die folgenden Genexpression Verfahren sind für eine einzelne Scheibe Kultur skaliert.

  1. Transfer-Slice Kulturen von Nährmedien und normale Inkubationszeit bis 3 ml RNAlater in 6-well Kulturschalen auf RNA zu stabilisieren. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 3 Tage bis zur Verarbeitung, wie unten beschrieben.
  2. Heben Sie die Scheibe Kultur aus dem Einsatz mit einer feinen Spitze Pinsel und in 1 ml kaltem (4 ° C) PBS in einem 1,5 mL (DNase, RNase und DNA frei) Mikrozentrifugenröhrchen.
  3. Centrifuge Proben für 30 sec und entfernen PBS Überstand.
  4. Shop-Proben bei -80 ° C.
  5. Zur Isolierung von RNA aus Slice Kulturen (~ 250 ng / ea.) Auftauen Proben auf Eis.
  6. Isolieren RNA mittels Qiagen MicroRNeasy Kit über die folgenden Verfahren, die im Einzelnen beschrieben werden und in Anlehnung an die RNeasy Micro Handbook (Qiagen).
    1. Legen Sie 350 &mgr; l Puffer RLT (mit 10 ul β-Mercaptoethanol pro ml) in jedes Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Scheibe Kultur.
    2. Homogenisieren Proben durch Vortexen für 30 sec. Man reibt Gewebe, falls erforderlich (dh Gewebe, Pellet noch sichtbar) mit einem Einweg-Stößel, bis sie vollständig in Buffer RLT homogenisiert.
    3. Legen Sie 350 ul 70% igem Ethanol in das Lysat mischen und Pipette zu mischen.
    4. Transfer-Homogenat zu einem Spin-Säule und in einem Sammelgefäß (beide Spin-Säule und Sammel-Tube von Qiagen mitgeliefert).
    5. Centrifuge Probe für 15 sec bei max Speed. Bewahren Sie die Spalte.
    6. Waschen Sie die Spin-Säule durch Zugabe von 350 ul Puffer RW1 Plus Zentrifuge für 15 sec bei max Geschwindigkeit. Discard-Puffer.
    7. Verdünnen Sie 10 l DNase I Stock in 70 ul Puffer RDD zu 80 ul Gesamtvolumen ergeben. Pipette vorsichtig zu mischen nicht vortexen. Bereiten Sie 80 ul des verdünnten DNase Lager pro Probe. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min.
    8. Geben Sie 350 ul Puffer RW1 auf Spin-Säule und zentrifugieren Sie für 15 sec Probe. Discard Sammelrohr.
    9. Mit einer neuen Sammel-Tube, 500 ul Puffer RPE auf Probe und für 15 sec zentrifugiert und entsorgen Puffer.
    10. Ort 500 ul 80% Ethanol auf Probe und Zentrifuge für 2 min. Entsorgen Sie die Sammel-Tube.
    11. Trocknen Sie die Spin-Säulen durch Zentrifugation für 5 min bei max Geschwindigkeit, mit der Tube caps zu öffnen, zu verwerfen Sammelröhrchen und Transfer-Spin-Säule in ein 1,5 ml Collection Tube mit dem Kit geliefert.
    12. Um isolierte RNA, Platz 14 ul RNase-freies Wasser auf die Mitte des Spin-Säule Membran zu sammeln. Zentrifuge für eine Minute und sammelt die Flüssigkeit.
    13. Add 2 ul der RNasin (verwässert bei 1 U / ul in TE-Puffer) und bei -80 ° C. TE-Puffer besteht aus 10 mM Tris (Tris [hydroxymethyl] aminomethan), 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz-Hydrat) bei 8,0 pH.

8. RNA Quantifizierung

  1. Hinweis: RNasin nicht mit dem RiboGreen Assay stören.
  2. Verdünnen RiboGreen 1:200 in RNase-freiem TE-Puffer wie folgt.
    1. TE (ml): 1; RiboGreen (ul): 5;
    2. TE (ml): 4; RiboGreen (ul): 20;
    3. TE (ml): 6; RiboGreen (ul): 30.
  3. RNA-Standards werden wie folgt hergestellt.
    1. Hefe tRNA wird als RNA-Standard verwendet. tRNA gespeichert ist (-20 ° C) als 1 mg / mL in TE-Puffer.
    2. Verdünnen Sie die 1 mg / mL Lager 1:100 in TE-Puffer mit (DNase, RNase und DNA frei) 1,5 mL Reaktionsgefäße zu einem 1 pg / mL Arbeitsstandards zu produzieren.
    3. Bereiten Sie die Standard-Kurve direkt in einer 96-well Fluoreszenztest Platte, indem Sie die TE-Puffer Verdünnungsmittel, dann wird die entsprechende Menge des 1 pg / mL Standard in die TE-Puffer bereits in den Plattenvertiefungen wie in der nebenstehenden Tabelle dargestellt. Machen Sie doppelt angelegten Vertiefungen für jeden Standard wie folgt.
      1. Vol. von std. (Ul): 100; Vol. von TE (ul): 0; RNA in gut (ng): 100;
      2. Vol. von std. (Ul): 80; Vol. von TE (ul): 20; RNA in gut (ng): 80;
      3. Vol. von std. (Ul): 60; Vol. von TE (ul): 40; RNA in gut (ng): 60;
      4. Vol. von std. (Ul): 40; Vol. von TE (ul): 60; RNA in gut (ng): 40;
      5. Vol. von std. (Ul): 20; Vol. von TE (ul): 80; RNA in gut (ng): 20;
      6. Vol. von std. (Ul): 0; Vol. von TE (ul): 0; RNA in gut (ng): 0.
  4. Der Test wird wie folgt hergestellt.
    1. Add 99 ul TE-Puffer zu jedem der Probe Wells der 96-Well-Platte. Der effizienteste Weg, dies zu tun ist, um eine Mehrkanalpipette verwendet werden.
    2. Add 1 ul RNA an die experimentellen Probenvertiefungen.
    3. Geben Sie 100 ul der verdünnten RiboGreen in jede Vertiefung mit der Mehrkanalpipette und verreiben mit einem oder zwei Schläge der Pipette.
    4. Lesen Sie die Platte auf einem fluoreszierenden Plattenlesegerät bei 480 nm Anregung und 520 nm Emission.
    5. Konstruieren Sie eine Standardkurve unter Verwendung von Microsoft Excel mit gemessenen Fluoreszenz-Intensitäten der RNA-Standards.
    6. Berechnen RNA-Konzentrationen in den Proben mit den daraus resultierenden linearen Gleichung von den Standards Kurve.

9. SYBR Green Quantitative PCR

  1. PCR-Verfahren sind am besten in einem sauberen Bereich speziell für die Arbeit mit RNA (Abbildung 4) vorbehalten getan.
    1. Dekontaminieren Bereich und verwandten Laborgeräte von möglichen DNA-Kontamination und RNase-Aktivität vor der Verwendung mit UV-Licht, 10% Bleichmittel oder RNase Away.
    2. Tragen Sie Handschuhe während aller Verfahren.
    3. Verwenden RNase freies Wasser für alle Verfahren, wie mit dem Kit bei. Verwenden Sie keine DEPC-(Diethylpyrocarbonat) behandelte Wasser.
    4. Schließen Sie alle PCR Röhrchen sofort nach Gebrauch zu verzögern Aerosol Kontamination von Fremd-DNA.
  2. Entwicklung und Charakterisierung Primer für die mRNA-Ziel (e) von Interesse. Diese Methoden sind in die zusätzlichen Methoden detailliert, um et al Hulse., Journal of Neuroscience, 2008 13.
  3. cDNA ist von 30 bis 200 ng Gesamt-RNA durch reverse Transkription mit iScript produziert.
    1. Die Wahl der Ausgangs-RNA Menge wird durch die Gesamtmenge der RNA zur Verfügung mit dem Ziel der Durchführung von RT-PCR-Analyse auf einem Teil der Probe (dh 10% -20% der Gesamtzahl) bestimmt.
    2. Die verbleibenden größeren Teil der RNA ist für eine spätere Analyse gespeichert werden.
    3. Die iScript Kit verwendet eine Mischung aus zufälligen Hexameren und Oligo-dT-Primer und einem modifizierten MMLV Reverse Transkriptase in einem Gesamtvolumen von 20 ul.
    4. Reverse Transkription Erlöse für 25 ° C für 30 min von 42 ° C für 50 min, und die Reverse Transkriptase folgte anschließend denaturiert bei 85 ° C für 5 min.
    5. Verdünnen Sie in TE-Puffer cDNA bis zu einer Endkonzentration von 0,4 ng / ul bezogen auf Ausgangs-RNA Menge.
  4. SYBR Green PCR-basierte Strategie zur Amplifizierung cDNA.
    1. PCR-Reaktionen werden in Echtzeit durch die Überwachung der SYBR Green Einbau überwacht.
    2. Die 50 ul Reaktionen enthalten 3 mM MgCl 2, 200 uM dNTPs, 15 pmol jedes von Vorwärts-und Rückwärts-Primer, 1 uM Fluorescein, 1x SYBR Green Farbstoff, 10 l (4 ng) Stück Kultur cDNA und 1,25 U Platinum Taq-Polymerase in Reaktion Puffer bestehend aus 50 mM KCl und 10 mM Tris, 8,3 pH.
    3. PCR wird unter Verwendung der iCycler Thermocycler, dass die Daten in Echtzeit erfassen können.
    4. Radfahren Parameter bestehen aus 15 sec Denaturierung (95 ° C) um 30 sec Annealing / Extension (60 ° C) wiederholt 45 Mal gefolgt.
    5. Optische Messungen sind während der Annealing / Extension Schritt getan und Ct-Werte wurden mit dem iCycler System-Software.
    6. cDNA für Zytokin-Ziele von Interesse und β-Aktin verwendet werden, um Standard-Kurven zu konstruieren.
      1. Copy-Nummer ist aus dem Molekulargewicht und die Masse der Plasmid-cDNA bestimmt.
      2. Standard-Kurven der Kopienzahl / Masse aufgebaut sind und in jedem Test enthalten.
      3. Ct-Werte für jede cDNA-Verdünnung verwendet, um die Kopienzahl v. Ct-Kurve zu bestimmen.
    7. Cytokine und β-Aktin Kopienzahl Ebenen sind für die Proben unter Verwendung von Standard-Kurven bestimmt.

10. Quantitative PCR für Microarrays

Quantitative real-time qPCR Array-Screening ist eine hoch empfindliche und reproduzierbare Mittel zur Low-Level-Entzündungsmediator Ausdruck ändert Sonde.

  1. Die RT2 Profiler PCR Array aus SABiosciences ist für Entzündungsmediatoren Veränderungen der Genexpression verwendet, mit den folgenden Schritten näher vom Hersteller beschrieben.
  2. Der Test verwendet 0,1-1,0 pg RNA. Wir verwenden lokale Scheibe Bereichen (zB CA1, die ~ 250 ng Gesamt-RNA liefert aus zwei Mischproben) oder ganze einzigen Scheiben, die eine ähnliche Menge an Gesamt-RNA enthalten.
  3. Probe und Kontrolle RNAs sind umgekehrt zu cDNA transkribiert mit einem ersten Strang-Kit (zB # C-03).
    1. Die resultierende cDNA wird mit SYBR Green-basierten PCR-Mix (# PA-011) und 25 ul in jede der 96 Vertiefungen des PCR-Array-Platte (Messung 84 einzigartige experimentelle Gene und 16 Housekeeping-Gene) aliquotiert gemischt.
    2. Ein Array Platte ist für die experimentelle Probe hergestellt und einer zweiten Platte ist für die Steuerung vorbereitet.
    3. Hinweis: Die SYBR Green Master Mix vom Hersteller bereitgestellt wird Thermocycler-spezifisch.
  4. Temperaturwechsel erfolgt mit einem iCycler mit einem 40 Zyklus-Protokoll, bestehend aus einer Denaturierung von 15 sec bei 95 ° C durch eine Erweiterung Schritt eines min bei 60 ° C. Optische Daten bei der Erweiterung Schritt gesammelt. Temperaturwechsel ist durch Schmelz-Kurven-Analyse Scannen der 55-95 ° C Temperatur bei 0,5 ° C Schritten gefolgt.
  5. Die relative Expression von Genen in Behandlungs-und Kontrollgruppe Platten wurde mit dem 2 - ΔΔCt Methode unter Verwendung der mitgelieferten Excel-basierte Software und ausgedrückt als eine Falte erhöhen oder zu verringern Vergleich zu den Kontrollen.
  6. Gene mit zweifacher erhöht oder verringert im Ausdruck sind für die weitere Auswertung berücksichtigt.
  7. Gene von PCR-Array-Screening identifiziert (zB mit # PARn-011A für Kalt-Vorkonditionierung) sind weitere confirmed mit qPCR.
    1. PCR-Arrays ermitteln, welche Gene in Reaktion auf Reize reguliert werden.
    2. Im Beispiel der Kälte-Vorkonditionierung, identifizierten wir die IL-11-Gen als positiv in Reaktion auf Kälte-Vorkonditionierung geregelt.
    3. Der nächste Schritt in der Analyse ist zu bestätigen, dass das neu identifizierte Gen in Scheiben Kulturen mit der qPCR Assay oben beschrieben reguliert wird.

11. Multiplexed Microsphere Durchflusszytometrischer Proteomic Assay

  1. Expose Scheibe Kulturen zu kalt Vorkonditionierung wie oben beschrieben.
  2. Ernte schneiden Kulturen für Gesamt-Protein-Assay.
    1. Heben Scheiben aus dem Einsatz mit einem feinen Pinsel-Spitze und in 1 ml kaltem (4 ° C) PBS.
    2. Zentrifugenröhrchen und entfernen PBS off Scheibe Kulturen. Legen Sie auf Trockeneis, bis die Ernte abgeschlossen ist.
    3. Shop-Röhrchen bei -80 ° C.
  3. Homogenisieren Stück Kultur-Proben für die Durchführung einer Gesamt-Protein-Assay.
    1. Bereiten Zelllysepuffer zur Homogenisierung.
      1. Nach den Anweisungen des Herstellers (Bio-Rad), add-Protease-Inhibitoren zu 5 ml Lysepuffer und beiseite stellen auf dem Eis.
    2. Platz 100 ul Lysepuffer auf Slice Kulturen und agitieren Scheiben durch Auf-und Abpipettieren fünfmal mit 100 ul Pipettenspitze aufgeschnitten, um 1 mm.
    3. Schütteln Sie Proben auf einem Schüttler bei 4 ° C für 20 min.
    4. Centrifuge Proben bei 13.000 rpm für 15 min bei 4 ° C.
    5. Überstand in ein sauberes Röhrchen und beiseite stellen auf dem Eis.
  4. Führen Gesamt-Protein-Assay.
    1. Bereiten BSA (Rinderserumalbumin) Protein-Standards.
      1. Rekonstituieren Lager BSA mit Reinstwasser nach den Anweisungen des Herstellers.
      2. Bereiten Protein-Standards bis hin 0-1000 pg / mL, in Lyse-Puffer verdünnt.
    2. Berechnen Sie das Volumen der Arbeitszeit Reagenz benötigt nach Montageanweisungen.
      1. Zum Beispiel (acht Standards + 18 unbekannte Proben) x (zwei Wiederholungen) x (200 ul arbeiten Reagenz pro Probe erforderlich) = 10,4 ml Gesamtvolumen der Arbeitszeit Reagenz benötigt, um auf eine 96-Well-Mikroplatten (zB Mikrosphären durchflusszytometrischen Assays Last , siehe unten).
      2. Beim Mischen von Reagenz A mit Reagenz B, einige Trübungen auftreten, sollte aber in Kürze verschwinden.
    3. Last 10 ul von Standards und Proben auf Mikrotiterplatten.
    4. Legen Sie 0,2 ml der Arbeit Reagenz in die Vertiefungen.
    5. Deckel Mikrotiterplatten mit Dichtband und schütteln auf einem Schüttler für 30 sek.
    6. Inkubieren Mikrotiterplatte bei 37 ° C für 30 min.
    7. Coole Mikroplatten auf Raumtemperatur (ca. 10 min) vor dem Lesen auf einem Platten-Lesegerät bei 595 nm Wellenlänge.
    8. Konstruieren Sie eine Standardkurve unter Verwendung von Microsoft Excel mit gemessenen Extinktionen von BSA-Standards.
    9. Berechnen Proteinkonzentrationen in den Proben mit den daraus resultierenden linearen Gleichung von den Standards Kurve.
      1. Verdünnen Sie alle Proben, die niedrigste Konzentration mit Lysepuffer und bei -80 ° C gemessen
  5. Führen Sie einzelne komplexe und Multiplex-Zytokin-Gewebe (oder Flüssigkeit)-Assays, wie in allen Einzelheiten in Verweise Nr. 12 und 16 dargestellt.

12. Immunhistochemie

  1. Fix Kulturen für 24 Stunden mit PLP Fixativ, bestehend aus 10 mL 16% Paraformaldehyd, 1,096 g Lysin, 0,42 g Natriumphosphat und 0,17 g Natrium-Perjodat, auf ein Gesamtvolumen von 80 mL mit Reinstwasser (Fixativ beträgt 6,2 pH) gefüllt.
    1. Wir finden, dass PLP Fixativ eine sanfte Fixativ dass der Nachweis von low-level Immunfärbung, die sonst nicht möglich wären offensichtlich mit anderen Fixierungen ermöglicht wird.
    2. Die Kulturen werden für 24 Stunden fixiert und dann mit einem feinen Pinsel auf PBS mit Natriumazid (100 mg / L) übertragen.
  2. Hellfeld Immunfärbung von schwimmenden ganze Scheibe Kulturen erreicht wird wie folgt mit allen Schritten gekoppelt bei ~ 50 rpm geschüttelt.
    1. Wash Scheibe Kulturen in 3 mL PBS dreimal für 10 min.
    2. Quench Scheibe Kulturen in 0,3% H 2 O 2.
      1. Verdünnen Sie 30% H 2 O 2-Stammlösung in PBS.
    3. Wash Scheibe Kulturen in PBS dreimal jeweils 10 Minuten.
    4. Block Scheibe Kulturen für eine Stunde bei Raumtemperatur in 3 ml Blocking-Lösung in einem Sechs-Well-Platte, bestehend aus 10 mL Ziegenserum, 0,75 ml Triton X-100 und 89,25 mL PBS.
      1. Serum für die Sperrung Lösung sollte aus der gleichen Spezies, bei denen der sekundäre Antikörper wurde angehoben kommen.
    5. Inkubieren Scheibe Kulturen über Nacht in primärer Antikörper in Blockierungslösung bei 4 ° C verdünnt
      1. Das maximale Volumen der primären Antikörper-Lösung für kleine Glas Pyrex Schüssel Brunnen sollte 0,3 mL höheren Volumina tendenziell zu laufen über den Rand der Platte.
      2. Die Schale in einem befeuchteten geschlossenen Behälter. Wir decken nicht die Schale mit anhaftenden Film seit Schnitte auf den darüber liegenden Film gedreht werden könnte und verloren für die weitere Aufarbeitung.
      3. Passen Schüttelgeschwindigkeit von Schüttler nur hoch genug, um Scheiben in der Antikörper-Lösung zirkulieren.
    6. Entfernen Sie Scheiben von Glasplatte und waschen in PBS dreimal für 10 min pro Waschgang.
    7. Inkubieren Scheiben in sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 Stunde unter Schütteln.
      1. Verwenden Sie kleine Glas Pyrex Gerichte auf 0,3 mL sekundären Antikörper-Lösung zu laden.
    8. Dreimal in PBS, 10 min pro Waschgang.
    9. Visualisieren Färbung mit 3'-Diaminobenzidin (DAB).
      1. Lösen Sie 30 mg DAB in 3 ml Dimethylsulfoxid.
      2. Filter DAB mit zwei Nr. 1 Filterpapier und wäscht mit 54 ml PBS.
      3. Unmittelbar vor dem Gebrauch mit 20 ul von 30% H 2 O 2.
      4. Inkubieren Kulturen in DAB-Lösung für 5-7 min bei Raumtemperatur.
      5. Hinweis: DAB ist krebserregend und muss ordnungsgemäß entsorgt werden. Entsorgen Sie alle DAB-Lösungen in einem gekennzeichneten Behälter in einem Abzug aufbewahrt, und legen Sie alle Gerichte in Bleichlösung DAB deaktivieren. Alle DAB-Lösungen sollten letztlich über den Institutional Safety Office entsorgt werden.
    10. Wash Scheibe Kulturen in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten.
    11. Nasspräparat Scheibe Kulturen auf Gelatine (oder Silan) beschichtete Objektträger mit 100 ul Spülmittel in destilliertem Wasser gelöst. Dry über Nacht bei Raumtemperatur.
      1. Vermeiden Sie die Verwendung schieben warmers starke Hitze können zu Rissen in den Kulturen angebracht, um Dias.
    12. Entwässern gleitet durch eine Reihe von abgestuften Ethanol (50, 75, 95, 95, 100, 100%) für jeweils 30 sec.
    13. Klare Folien mit Xylol viermal für zehn Minuten jeder.
    14. Mit einem Glas Pasteur Pipette statt 0,1 ml Eindeckmittel oben auf Rutsche und sanft Deckglas, um Luftblasen zu bilden, zu vermeiden. Dry über Nacht bei Raumtemperatur.
  3. Fluorescent Immunfärbung.
    1. Schnittscheibe Kulturen bis 20 um dicke mit einem Kryostaten.
      1. Passen Sie die Einstellungen Kryostaten auf -16 ° C für die interne Temperatur und -12 ° C für Objekt-Temperatur.
      2. Legen Sie eine kleine Menge Wasser auf Metall Spannfutter mit einer Pasteurpipette und frieren auf Trockeneis.
      3. Tragen Sie eine dünne Scheibe Schicht von Tissue-Tek Medien auf gefrorenen Futter.
      4. Lassen Futter zu fixieren und ins Gleichgewicht zu Kryostat Kammertemperatur.
      5. § Tissue-Tek Medien zu schaffen eine abgeflachte Oberfläche für die Verlegung Scheibe Kulturen flach.
      6. Beachten Sie die Ausrichtung des Futters beim Schneiden dieser bietet eine konsistente Winkel zum Schneiden, dass die Montage Medien Herunterfallen des Futters zu verhindern.
      7. Wenn gefroren, nehmen rausschmeißen und in einen Halter. Mit einem Spatel und eine feine Spitze Pinsel, schieben eine Scheibe Kultur auf Spachtel und die Übertragung über dieMitte der abgeflachten Schicht von Tissue-Tek Medien auf das Futter.
      8. Legen Sie eine dünne Schicht von Tissue-Tek Medien über montierten Scheibe Kultur und frieren bei Kammer Temperatur für mindestens 10 min.
      9. Mit dem "Trimm"-Taste aktiviert, Abschnitt den oberen Schichten der Tissue-Tek Medien bis slice Kultur sichtbar ist.
      10. Wechseln Sie von "trim" auf "Abschnitt" voreingestellt 20 um.
      11. Pick-up 20 um Abschnitte mit Gelatine beschichtete Folien, die Raumtemperatur und trockenen Objektträger über Nacht.
      12. Tissue-Tek Medien sichtbar sein wird auf Folien, löst sich aber in PBS gewaschen.
    2. Immunfärbung.
      1. Waschen Sie die Objektträger in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten.
      2. Quench in 0,3% H 2 O 2 für 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt.
      3. Waschen Sie die Objektträger in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten.
      4. Mit SFX Signal Enhancer, ein paar Tropfen der Komponente A direkt auf der Abschnitte auf dem Objektträger und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer.
        • Inkubation mit der Komponente A ersetzt die Sperrung Schritt mit 10% Ziegenserum-Lösung in Hellfeld Immunhistochemie durchgeführt.
      5. Inkubieren in primärer Antikörper in 0,75% Triton X-100 in PBS für 2 Stunden bei 37 ° C verdünnt
        • Bewerben primärer Antikörper-Lösung direkt nach oben rutscht und inkubieren in feuchten Kammer, um Verdunstung zu verhindern.
        • Verwenden Sie keine Serum in einer der Antikörper-Lösungen nur PBS und Triton X-100.
      6. Waschen Sie die Objektträger in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten.
      7. Inkubieren in sekundären Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur und schützen Folien aus Licht.
        • Centrifuge alle fluoreszierenden Sekundärantikörper für 20 min keine Aggregate ab, in der Antikörper-Lösung zu verhindern.
        • Bereiten Antikörperverdünnungen mit 0,75% Triton X-100 in PBS.
      8. Waschen Sie die Objektträger in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten.
      9. Dip Slides einmal in destilliertem Wasser abgewaschen werden Salze aus PBS.
      10. Dry Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht bedeckt.
      11. Deckglas Objektträger mit ProLong Antifade Medien.
        • Thaw Komponente A in der Mikrowelle für 5-10 sec und fügen etwa 1 mL ein Fläschchen Komponente B mischen mit einem Pastuer Pipette, darauf achten, daß Luftblasen in Lösung einzuführen.
        • Zentrifuge für 5 min bei max Geschwindigkeit Blasen zu entfernen.
        • Tragen Sie eine dünne Schicht aus ProLong Medien nach oben schieben mit einem Pastuer Pipette vorsichtig vorzunehmen, dass keine Luftblasen.
        • Sanft statt Deckglas auf der Rutsche und über Nacht trocknen, fern von Licht bedeckt.
      12. Double-label fluoreszierenden Immunfärbung (Abb. 5).
        1. Führen fluoreszierenden Immunfärbung wie oben, nur verdünnt sowohl Primär-Antikörper in der gleichen Inkubationslösung beschrieben.
        2. Verdünnen Sie alle Sekundärantikörper in der gleichen Lösung, Inkubation, wie oben beschrieben.
        3. Serielle Inkubationszeiten mit zwei Antikörpern führte zu verminderter Immunfärbung.

13. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1
Abbildung 1. Aussehen des Hippocampus Scheibe Kulturen und Mikroglia. Das linke Bild zeigt eine typische reife (dh 21 Tage in vitro) Hippocampus Scheibe Kultur mit NeuN (grün) Fleck auf der Zytoarchitektur der wichtigsten Neuronen zu illustrieren. Pyramidalen Neuronen befinden sich in Gebieten CA1 und CA3 und dent gezeigtaß Gyrus (DG) Neuronen auf der linken Seite. Scale-Bar ist 250 pm. Das rechte Bild ist von der CA1 Region abgeleitet und dargestellt bei höheren Macht, die verzweigten Qualität des ruhenden Mikrogliazellen im reifen Scheibe Kulturen zu veranschaulichen. Die Zellen wurden mit der Mikroglia-Oberflächenmarker, CD11b markiert. Scale-Bar ist 50 pm.

Abbildung 2
Abbildung 2. Cold-Vorkonditionierung Neuroprotektion in hippokampalen Slice Kulturen. Kulturen werden mit Sytox Green, einem fluoreszierenden markierten toten Zell-Marker inkubiert. Die obere Reihe zeigt sham Kontroll-Kulturen und die untere Reihe zeigt Scheiben ausgesetzt bis 28 ° C für 90 min. Linke Hand, vor dem Bildschirm Bilder zeigen keine CA1 Verletzungen. Relative Verletzungen Farbkalibrierung Skala ist in der linken oberen Bild gezeigt. Mittlere Reihe Bilder zeigen relative Scheibe Kultur Verletzungen 24 Stunden nach der Exposition gegenüber 20 uM NMDA. Beachten Sie, dass Schein-Kontrolle Verletzung größer als die der Kulturen ausgesetzt Kälte-Vorkonditionierung (CP) ist. Traditionell werden die Kulturen dann auf 20 uM NMDA Nacht zu CA1 neuronaler Schädigung Ebenen und relativen Verletzung von CP v. sham maximieren ausgesetzt, stellte als Verhältnis von Verletzungen / maximal Verletzungen. Allerdings kann der Einfluss von maximal Verletzungen Reize nicht ausreichen, um Neuroprotektion von Vorkonditionierung zu überwinden. Dementsprechend des Verhältnisses der Verletzung / maximal Verletzungen Verwendung kann nicht genau Neuroprotektion von Vorkonditionierung. Dies ist in der rechten Hand Bilder, die CP maximal Ebenen sind weniger als die der Schein-Kontrollen zeigen evident.

Abbildung 3
Abbildung 3. Schematische Darstellung der Nutzen des Einsatzes von ersten, am ersten Tag Messungen die Verletzungen in quantifizieren Kälte-Vorkonditionierung Experimente. Wie oben erwähnt, fanden wir, dass die Verwendung von Kennzahlen (Verletzung / maximal Verletzung) konnte Neuroprotektion von Kalt-Vorkonditionierung unklar. Dies kann aus der schematischen Darstellung nach links, wo Schein Verletzungen in rot dargestellt wird und dass zu sehen, nachdem Kälte-Vorkonditionierung in blau. Einen Tag nach NMDA Exposition Kälte-Vorkonditionierung zeigt eine relative "3" auf der Verletzung v. Schein ("5") zu steuern, die mit 40% Neuroprotektion. Allerdings, wenn ein traditionelles Format mit Kennzahlen (dh Verletzung / maximal Verletzung) verwendet wird, ist kein Schutz evident [dh (10.5) = 50% zum Schein v. (06.03) = 50% für Kalt-Vorkonditionierung ].

Abbildung 4
Abbildung 4. Typial qPCR Ergebnis gezeigt. Obere Kurve RNA-Kopienzahl v. Schwelle Zyklus für PCR-Amplifikation zeigen Kontrollen (blau) und experimentellen Proben (rot). Unteres Bild zeigt eine typische Verstärkung Profile für vier Proben (schwarz, grün, gelb und violett). Beachten Sie diese Ct Schwelle Zyklen (gekennzeichnet durch orange Linie) treten bei 26,0, 29,5, 31,0 und 32,5.

Abbildung 5
Abbildung 5. Double-label Immunfärbung verwendet werden, um qPCR und qPCR-Arrays Ergebnisse bestätigen, Ein Stück Kultur für IL-11 (rot) und NeuN (grün; Neuronen mark) verarbeitet wurde. Für die zelluläre Expression loci von IL-11-Sonde. Beachten Sie, dass einige Pyramidenneuronen (Pfeile) IL-11 und NeuN Färbung (gelb) zeigen, während ein paar kleinere Zellen (Pfeile), vermutet, dass Astrozyten werden, zeigen nur erhöhte IL-11-Färbung (rot).

Discussion

Zwei grundlegend wichtige Konzepte wichtig, Abgrenzung der Cytokine Signaling System in kalt-Vorkonditionierung Neuroprotektion beteiligt sind in Abb. 6 und 7 dargestellt. Erstens sind Zytokine extrem niedrigen Konzentration Signalmoleküle im normalen Gehirn. Dennoch haben physiologische Zytokin-Konzentration ändert ein immenses Potenzial zur Hirnstruktur und-funktion (dh Phänotyp) wegen ihrer Fähigkeit, die Genexpression verändern (Abbildung 6) zu ändern. Darüber hinaus sind Zytokine hochredundanten und pleiotrope in die mehrere Zytokine können ähnliche Effekte und ein einzelnes Zytokin variable Effekte (Abbildung 7) haben können. So muss sich genau feststellen das angeborene Zytokin-Basen zur Neuroprotektion vor Kälte-Vorkonditionierung (oder anderen physiologischen Vorkonditionierung Stimuli), Composite-Analyse der damit zusammenhängenden Signalisierung Variablen bestimmt werden. Dies geschieht über Multiplex-Assay-Strategien durchgeführt. Dies wird zunächst der Zytokin "Signatur" kalt-Vorkonditionierung Neuroprotektion.

Abbildung 6
Abbildung 6. Power of Cytokine Signaling Gehirn. Die Abbildungen vermitteln die immense Signalwirkung von physiologischen Konzentrationen von Gehirn Zytokine im Vergleich zu den Konzentrationen anderer allgemein anerkannten Kollegen. Konzentration ist als der Kehrwert der Entfernung dargestellt, beginnend mit einer einzigen Katze Whisker als Bezugspunkt. Natrium (10 -1 M durch ein Körnchen Pfeffer dargestellt) und Kalium (10 -3 M durch eine Tomate dargestellt) sind in den interstitiellen Raum des Gehirns auf einem Niveau von rund 150 und 3 mm, bzw., und haben allgemein anerkannten Rollen in neurale Zellen elektrophysiologische Funktion. Auch pH-Wert (dh ~ 10 -7 M Ebenen der Wasserstoff-Ionen und illustriert, wie 780 Meter entlang Chicagos Seeufer) und Kalzium (dh ~ 10 -8 M Ebenen dargestellt als 7,8 km von einem Satelliten Google Bild entlang Chicagos Seeufer von McCormick gesehen Place to Promontory Point in Hyde Park in der Nähe der University of Chicago). Darüber hinaus beeinflussen Neurotransmitter freigesetzt interstitiellen Raum über diese Konzentrationen lokalen Hirnregion Aktivität. Im Gegensatz dazu können Zytokine (gezeigt als der Abstand von der Erde zum Mars) verändern Hirnfunktionen bei Konzentrationen mehr als 10 Millionen Mal weniger.

Abbildung 7
Abbildung 7. Interactive Signalisierung von angeborenen Zytokin Wege. Zytokine sind hoch redundant und pleiotrope in die mehrere Zytokine können ähnliche Effekte und einem Zytokin kann mit unterschiedlichen Auswirkungen. Diese Vielfalt resultiert aus komplexen interaktiven signalisiert, dass auf der Ebene der Liganden, Rezeptoren und Phosphoproteine ​​auftritt. Weitere Komplexität resultiert aus der Tatsache, dass Gehirn von verschiedenen Zelltypen, wobei jede Lage von Zell-spezifische angeborene Zytokin, Rezeptor und die damit verbundenen Phosphoprotein Veränderungen besteht. Zur Veranschaulichung hier sind nur angeborene Zytokin-Signalwege (abgeleitet von Immunzellen Studien) gezeigt. Der Einfachheit halber wird das Gehirn als eine einzelne Zelle (weiße Linie) zeigt die mögliche Wechselwirkungen für angeborene Zytokine (IL-1α und IL-1β (hier bezeichnet als IL-1α / β), TNF-α, IL-6 gezogen, IFN-γ und IL-10), Rezeptoren (IL-1R1, TNFR1, IL-6/gp130, IFNγR und IL-10R) und Phosphoproteine ​​(dh Kinasen ERK1 / 2, P38 (P38-MAPK) und JNK) und Transkriptionsfaktoren (ATF-2, NFKB und STAT3). Zum Beispiel, TNF-α-Signale via TNFR1 auf JNK, p38-MAPK und ERK1 / 2, die die Genexpression auslöst via ATF-2. TNF-α verändert auch die Genexpression direkt durch NFKB Aktivierung. Gemeinsam Aktivierung dieser Transkriptionsfaktoren evozieren erhöht (Pfeil) und zurück (blunt end) Expression von Zytokinen und deren Rezeptoren wie angegeben. Wichtig ist, zeigen diese Wege, die Änderungen in einem Zytokin (zB TNF-α) beeinflussen die Produktion von anderen (zB IL-1β) Zytokine. So muss sich genau feststellen das Zytokin-Basen zur Neuroprotektion vor Kälte-Vorkonditionierung, Composite Analyse der damit zusammenhängenden Signalisierung Variablen bestimmt werden. Dies wird zunächst der angeborenen Zytokin "Signatur" kalt-Vorkonditionierung. (Das Bild wurde aus Daten von Referenz Nr. 25 zusammengestellt.)

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS-19108), die Migräne Research Foundation und das Weiße Stiftung Richard P. Kraig finanziert. Frau Marcia P. Kraig in Herstellung von Nährmedien und Wartung von Slice Kulturen unterstützt. Wir bedanken uns bei Yelena Grinberg für ihre Kommentare und Revisionen auf eine endgültige Version dieses Artikels.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Preparation of Slice Cultures
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) PICM0-3050
Basal Medium Eagle 21010
Earle s Balanced Salt Solution E2888
Horse serum 26050-088
Glutamax 35050
Gentamicin 15710-064
Fungizone 15295
D-glucose G8769
BSL-1 fume hood
McIlwain tissue chopper
Teflon disks 023-49-310-1
Spatula 14-373-25A
Curved iris scissors 14091-09
Long straight scissors 14002-14
Long forceps 13-812-40
Angled forceps 11808-02
Short forceps 13-812-38
#5 Inox forceps 11254-20
2 Iris spatulae 10094-13
150 x 15 mm Petri dishes 08-757-148
60 x 15 mm Petri dishes 08-757-100B
Wild M8 stereomicroscope
Gey s balance salt solution G9779
Blak-Ray shortwave Ultraviolet measuring meter J-225
6-well Falcon culture dishes 08-772-1B
Neurobasal 21103
B27 supplement 17504
Gem21 Neuroplex 400-160-010
Ascorbic acid A4544
CO2 Analyzer #2820
Pre-screening for Vitality of Slice Cultures
Sytox Green S7020
DMIBRE inverted microscope
Cold-Preconditioning
BSL-2 Fume Hood
Excitotoxic Injury
CoolSnap fx CCD camera
Fluoroscein F36915
MetaMorph software v. 7.5.04
100 μm deep hemacytometer
N-methyl-D-aspartate 454575
SigmaStat software v. 3.5
Co-treatments applied with Cold-Preconditioning
sTNFR1 425-R1-050
Bovine Serum Albumin A-4503
RNA Isolation
RNAlater AM7021
Micro RNEasy Kit 74004
β-mercapt–thanol 03446-100
Diposable 1.5 RNAse-free Pestle 749521-1590
RNasin N261A
Tris[hydroxymethyl]aminomethane T3069
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt hydrate #E7889
RNA Quantification
RiboGreen Assay R11491
Yeast tRNA 15401-011
1.5 mL centrifuge tubes 16155500
96-well fluorescent assay plate DK-4000
96-well fluorescent plate reader Safire II
Quantitative PCR
iScript reverse transcription kit 170-8891
SYBR Green S7563
Platinum Taq polymerase RNA Ultrasense 11732-927
iCycler thermocycler iCycler Optical Module
iCycler system software v. 3.1
Quantitative PCR for Microarrays
RNase Away #7000
RT2 First Strand Kit C-03
SYBR Green-based PCR mix Specific for iCycler PA-011
RT2 Profiler PCR Array PARN-011A
Proteomic Assay
Cell lysis kit 171-304011
Microcentrifuge Micro 7
BSA protein stock 500-0007
BCA protein assay kit 23225
Immuno 96 MicroWell plates 449824
Sealing tape 2239444
96-well plate reader 1420-mulilabel counter
Bioplex Rat TNF-α cytokine assay X0000001T
Immunostaining
16% Paraformaldehyde 43368
Lysine L-6001
Sodium phosphate S374-1
Sodium periodate S-1878
Sodium azide S-2002
Hydrogen Peroxide (30%) H1009
Goat serum CS 0920
Triton X-100 T-8787
Staining dishes 14511
Plate Shaker 3520
#1 Filter Papers (185 mm) 1001-185
3,3 -diaminobenzidine D8001
Dimethyl sulfoxide D8418
Ethanol 111000200
Xylene X3S-4
Permount mounting media SP15-100
Cryostat cm3050 S
Tissue-Tek 27050
Fine-tip paint brush 11806
PAP blocking pen 22309
SFX signal enhancer A31631
ProLong Antifade P7481

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References

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