بروتوكول للعدوى حمى الضنك في البعوض (بعوض ألف) ، وتحديد النمط الظاهري العدوى

Published 7/04/2007
6 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

حالما يتم التعرف على الجينات المقاومة للحرارة كما يحتمل أن تكون للفيروس حمى الضنك ، لا بد من تقييمها لدورها في الوقاية من العدوى الفيروسية داخل البعوض. هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن أن يعاير مدى الإصابات بحمى الضنك من البعوض. وأظهرت تقنيات لزراعة الفيروس حتى في الثقافة والدم غشاء البعوض تغذية الإنسان ، ويعاير التتر الفيروسية في المعي المتوسط ​​البعوض.

Cite this Article

Copy Citation

Das, S., Garver, L., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopoulos, G. Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination. J. Vis. Exp. (5), e220, doi:10.3791/220 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الغرض من هذا الاجراء هو لإصابة البعوضة الزاعجة مع فيروس حمى الضنك في حالة المختبرات وفحص مستوى العدوى وديناميكية من الفيروس في أنسجة البعوض. ويستخدم هذا البروتوكول بشكل روتيني لدراسة التفاعلات البعوض الفيروس ، وخاصة لتحديد العوامل المضيفة الرواية التي تكون قادرة على تحديد اختصاص النواقل. يجب أن تجرى التجربة في مختبر كامل BSL2. مماثلة للعدوى الملاريا المنجلية ، يجب أن تلبس الملابس المناسبة بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر في جميع الأوقات. بعد التجربة ، وجميع المواد التي جاءت في اتصال مع الفيروس يجب أن يتم التعامل مع 75 ٪ من الإيثانول والمقشور قبل الشروع في غسل طبيعية. جميع المواد الأخرى يجب أن يتم تعقيمها قبل التخلص منها.

Protocol

A. نشر الفيروس في خط خلية C6/36.

  1. الخلايا تنمو إلى 80 ٪ في 75 قارورة confluency 2 سم ؛
  2. إزالة وسائل الاعلام مع مل 3-4 المتبقية في قارورة ؛
  3. تأخذ 0.5 مل الفيروس الأسهم وإضافة إلى الخلية المذكورة أعلاه مع تعدد العدوى من جزيئات الفيروس بنسبة 1.5 في الخلية. هز القارورة ببطء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. احتضان لمدة 45 دقيقة في 5 ٪ CO 2 و 37 درجة مئوية
  5. إضافة الوسائط 30 مل ، واحتضان لمدة 5 أيام.

باء تحضير خليط من الفيروسات والدم

  1. فصل الخلية مع مكشطة ونقل الخلايا وسائل الإعلام للأنابيب مخروطية 50 مل ؛
  2. نباذة في 800G لمدة 10 دقيقة ، جمع طاف ، ولكن ترك 1ml من طاف مع بيليه الخلية ؛
  3. تجميد أعلاه بيليه في الخلية الجافة CO 2 ثم الذوبان في الماء 37 درجة مئوية حمام ، كرر مرتين إلى ثلاث مرات ؛
  4. نباذة في 800G لمدة 10 دقيقة ، واتخاذ طاف ، ويتحد مع طاف جمعها من الخطوة 3 ؛
  5. جمع الدم البشري كله مع نفس الإجراء (الخطوة 3) لإعداد ثقافة العرسية تصيب الأنوفيلة البعوض مع المنجلية ؛
  6. الجمع بين كمية متساوية من الدم البشري كله أعلاه طاف مع الفيروس من الخطوة 4 ، وإضافة مصل الإنسان (10 ٪ من حجم كاملة).
  7. احتضان الخليط أعلاه من الدم البشري وفيروس حمى الضنك لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 ° C

جيم تغذية البعوض

هذا الإجراء هو مطابق تقريبا الى ما تم وصفها في المقطع للعدوى الملاريا المنجلية في البعوض. نحن مقايسة العدوى المعى المتوسط ​​في يوم 7 وإصابة اللعابية في اليوم 14 بعد تغذية الدم. يتم التعامل مع جميع المواد التي جاءت في اتصال مع أول فيروس الايثانول مع 75 ٪ ثم 10 ٪ مع التبييض.

د. عيار الفحص للفيروس في الأنسجة البعوض

  1. يومين أو ثلاثة أيام قبل تشريح الأنسجة البعوض ، وتنمو C6/36 خلية في 24 لوحة جيدا ان هذه الخلية إلى 80 ٪ في اليوم confluency عندما أجرى الفحص ؛
  2. البعوض هي تخدير عند 4 درجات مئوية ، وظهرت التضحية العقيمة التي نقع عليها في الايثانول 75 ٪ لمدة 1 دقيقة. ثم تم غسلها بالماء المعقم البعوض مرتين قبل تشريح الغدة اللعابية المعي المتوسط ​​أو تشريح تحت المجهر. من هذه الخطوة ، كل الإجراء أدناه يجب أن تتم في بيئة معقمة مثل خزانة السلامة البيولوجية. يتم نقل هذه الأنسجة التي تحتوي على أنبوب 150 ميكرولتر وسائل الاعلام والمتجانس مع محرك Kontes مدقة بيليه لمدة 90 ثانية ؛
  3. جعل التخفيف 1:100 بإضافة 10 ميكرولتر من جناسة في وسائل الاعلام ميكرولتر 990 ؛
  4. كذلك جعل 1 : 10 ، 1:100 و 1:1000 التخفيف مع المتوسط ​​في 96 لوحة جيدا ؛
  5. إزالة وسائل الإعلام في لوحة 24 أيضا ، وإضافة 100 ميكرولتر من كل من التخفيفات الأربعة المذكورة أعلاه على كل جانب المقابلة ؛
  6. هزة لوحة ببطء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتضان لمدة 45 دقيقة في 5 ٪ CO 2 و 37 درجة مئوية ؛
  7. إضافة 1ml من تراكب methycellulose (1 ٪) على كل جانب ؛
  8. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5 ٪ لمدة 5 أيام ؛
  9. الخطوات من هنا لا تتطلب بيئة معقمة ولكن ينبغي أن تؤخذ كما هو الحال مع أي رعاية الممرضة الأخرى في جميع الأوقات. تجاهل تراكب methycellulose من كل لوحة وصمة عار لازالة الزائدة وسائل الإعلام
  10. إضافة 1ml من الميثانول / الأسيتون تثبيتي (1:1) على كل بئر. تبقي على 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة ؛
  11. تخلصي من تثبيتي ، ويغسل مرة واحدة مع 1X PBS ؛
  12. جعل 1:1000 التخفيف إلى الأجسام المضادة ضد الفيروس الأولية مع blotto 5 ٪ ؛
  13. إضافة 200 ميكرولتر من السائل المخفف لكل مفرط المناعة C جيدا ، واحتضان على 37 درجة لمدة 1 ساعة ؛
  14. إزالة السوائل ومفرط المناعة وحة يغسل مع PBS X 1
  15. يعد التخفيف من 1:1000 المتقارن المضادة للماوس الماعز (القط KPL # 074-1806) في 5 ٪ blotto (اللبن المجفف المنزوع 5G في 100 مل من برنامج تلفزيوني X 1) ، ثم قم بإضافة 200 ميكروليتر إلى كل بئر ، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ؛
  16. تعد الركيزة على النحو التالي : 1 إضافة قرص من 3' - Diaminobenzidine terrahydrochloride (سيغما القط # D5905) في 20 مل من برنامج تلفزيوني X 1 ، بعد حلها ، ومن ثم إضافة 8 ميكرولتر من البيروكسيداز الهيدروجين 30 ٪
  17. إضافة 200 ميكرولتر من الركيزة أعلاه إلى كل بئر. دعونا نقف عند درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة
  18. إزالة الركيزة ووقف رد الفعل بإضافة 1ml من الماء المقطر إلى كل بئر
  19. صب قبالة المياه وصمة عار لوحات لتجف
  20. عد جسيمات الفيروس

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Incubator with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes plastic
human serum and blood O+
pipette tip for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts glass, sterile
water bath 37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates 6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish glass
Slides
fine-tip forceps
PBS 1X, sterile
dissecting microscope Microscope
C6/36 cells cells For virus propagation
C6/36 medium MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride Sigma-Aldrich D5905 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti Animal mosquito

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

6 Comments

  1. Do you normally culture your Ae. albopictus (C6/36) cells at 37C? Conventionally we culture at around ²8C; what is the reason for keeping yours so warm?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 15, 2008 - 2:06 PM
  2. Hi KellyI'm from the Dimopoulos Lab - we actually keep the C6/36 cells at 3² C, not 37 C (that was probably a typo). We have found that they grow fine at lower temperatures (²7 C), but we have been getting weird results with plaque assays done at that temperature, so it may affect how the virus replicates in them.RegardsShuzhen

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 15, 2008 - 3:15 PM
  3. I watched with interest your demo. The one step I was waiting to see is missing! You do not show in your video how exactly you remove the methylcellulose overlay and blot excess medium before adding the fixative.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 16, 2009 - 3:15 PM
  4. Hi, I have a suggestion. After you kill the mosquitŒs with 70% ethanol, picking them up individually with forceps to wash them looks a bit tedious. How about putting them in a cell strainer so you can pick up and wash a bunch together?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 10:47 PM
  5. Where can I get the hyperimmune fluid?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 9, 2010 - 8:32 PM
  6. Do you guys keep the C6/36 cell in the incubator with CO² or not?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 10, 2012 - 5:35 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats