Протокол денге инфекций в Комары (A. aegypti) и определение инфекции Фенотип

Published 7/04/2007
6 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

Как только ген определены как потенциально огнеупорные для вируса денге, он должен быть оценен для его роль в профилактике вирусных инфекций в комара. Этот протокол иллюстрирует, как степень инфицирования денге комаров могут быть проанализированы. Методы для посадки у вируса в культуре, мембранные кормления комаров человеческой крови, и опробование вирусные титры в комара кишки демонстрируются.

Cite this Article

Copy Citation

Das, S., Garver, L., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopoulos, G. Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination. J. Vis. Exp. (5), e220, doi:10.3791/220 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Целью этой процедуры является заразить комаров Aedes с вируса денге в лабораторных условиях и изучить уровень инфекции и динамика вируса в организме комара тканей. Этот протокол широко используется для изучения комаров вирус взаимодействия, особенно для идентификации новых факторов хозяина, которые способны определить вектор компетенции. Весь эксперимент должен проводиться в лаборатории BSL2. Как и Plasmodium тропической инфекции, соответствующая одежда, включая перчатки и халат следует носить в любое время. После эксперимента все материалы, которые были в контакте с этим вирусом, должны рассматриваться с 75% этанола и беленой прежде чем приступить к нормальной стирки. Все остальные материалы должны обрабатываться в автоклаве, прежде чем выбросить их.

Protocol

А. Распространить вирус в C6/36 клеточной линии.

  1. Клетки растут на 80% слияния в 75 см 2 колбы;
  2. Удалить средах с 3-4 мл, оставшихся в колбу;
  3. Возьмите 0,5 мл фондовом вирусов и добавить в выше ячейки с множественностью заражения 1,5 вирусных частиц в клетку. Встряхивания колбы в течение 15 минут медленно при комнатной температуре.
  4. Инкубировать 45 минут при 5% СО 2 и 37 ° C
  5. Добавить 30 мл средствах массовой информации, и выдержать в течение 5 дней.

Б. Подготовка смеси вируса и крови

  1. Отсоедините ячейки с скребок и передачи ячейки и СМИ 50 мл конические пробирки;
  2. Центрифугата на 800 г в течение 10 минут; собирают супернатант, но оставить 1 мл надосадочной с осадок клеток;
  3. Стоп выше осадок клеток в сухом CO 2, а затем оттепель в 37 ° С водяной бане, повторить два-три раза;
  4. Центрифугата на 800 г в течение 10 минут, принимать супернатант, и в сочетании с надосадочной собранных с шага 3;
  5. Сбор цельной человеческой крови с той же процедурой (шаг 3) для подготовки гаметоцит культуры инфицировать малярийных комаров с Plasmodium тропической;
  6. Смешайте равное количество выше цельной человеческой крови с вирусом супернатант с шага 4, а также добавить сыворотке крови человека (10% от всего объема).
  7. Инкубируйте выше смесь крови человека и вируса денге в течение 30 минут при 37 ° С водяной бане

Комаров С. Кормление

Эта процедура почти идентична той, что были описаны в разделе Plasmodium инфекций в тропической комаров. Мы анализа кишки инфекции на 7 день, и слюнных инфекции на 14 день после того, питающимися кровью. Все материалы, которые были в контакте с вирусом рассматриваются сначала с 75% этанола, а затем с 10% гипохлоритом натрия.

Д. Анализ титра вируса в тканях комара

  1. Два или три дня до рассечения тканей комара, растут C6/36 ячейки в 24-луночный планшет так, что клетка достигает 80% слияния в день, когда анализ проводится;
  2. Комары анестезии при 4 ° С, жертвы и всплыли стерильной путем замачивания их в 75% этаноле в течение 1 минуты. Затем комаров промывали стерильной водой дважды, прежде чем рассечения кишки или слюнных желез при вскрытии микроскопом. С этого шага все ниже процедуру необходимо проводить в стерильных условиях, таких как биологические кабинета безопасности. Эти ткани переданы пробирку, содержащую 150 мкл СМИ и гомогенизировали с Kontes гранул пестиком двигателя в течение 90 секунд;
  3. Сделать 1:100 разбавления путем добавления 10 мкл гомогената в 990 мкл средствах массовой информации;
  4. Сделайте еще 1: 10, 1:100 и 1:1000 разбавления среды в 96 ячейках;
  5. Удалить средств массовой информации в 24-луночный планшет, и добавьте 100 мкл каждого из этих четырех разведениях к каждому из которых соответствует хорошо;
  6. Встряхните пластины медленно в течение 15 минут при комнатной температуре, затем инкубировать 45 минут при 5% СО 2 и 37 ° С;
  7. Добавить 1 мл methycellulose наложения (1%) в каждую лунку;
  8. Инкубируйте пластин при 37 ° C с 5% CO 2 в течение 5 дней;
  9. Шагах отсюда на не требующие стерильных условиях, а как с любой другой возбудитель следует проявлять осторожность во все времена. Отменить methycellulose наложения друг от пластины и промокните, чтобы удалить излишки средства массовой информации
  10. Добавить 1 мл метанола / ацетон фиксатором (1:1) в каждую лунку. Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 ч;
  11. Вылейте фиксатора, и мыть один раз 1X PBS;
  12. Сделать 1:1000 разбавления до первичного антитела против вируса с 5% пьяный;
  13. Добавьте 200 мкл разведенной гипериммунных жидкости в каждую лунку, инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1 ч;
  14. Удалить гипериммунных жидкость и промыть пластины с 1 х PBS
  15. Подготовка 1:1000 разбавления антимышиного сопряжены (КПЛ Cat # 074-1806) в 5% одурманенный (5 г порошкообразного обезжиренное молоко в 100 мл 1 х PBS), а затем добавить 200 мкл в каждую лунку и инкубировать в 37 ° С в течение 1 ч;
  16. Подготовка субстрата следующим образом: добавить по 1 таблетке 3 'диаминобензидина terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) в 20 мл 1 х PBS, после растворения, а затем добавить 8 мкл 30% водорода пероксидазой
  17. Добавить 200 мкл выше субстрата в каждую лунку. Дайте постоять при комнатной температуре в течение 10 минут
  18. Удалите подложку и остановить реакцию добавлением 1 мл дистиллированной воды в каждую лунку
  19. Слейте воду и промокните пластин высохнуть
  20. Граф вирусной частицы

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Incubator with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes plastic
human serum and blood O+
pipette tip for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts glass, sterile
water bath 37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates 6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish glass
Slides
fine-tip forceps
PBS 1X, sterile
dissecting microscope Microscope
C6/36 cells cells For virus propagation
C6/36 medium MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride Sigma-Aldrich D5905 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti Animal mosquito

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

6 Comments

  1. Do you normally culture your Ae. albopictus (C6/36) cells at 37C? Conventionally we culture at around ²8C; what is the reason for keeping yours so warm?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 15, 2008 - 2:06 PM
  2. Hi KellyI'm from the Dimopoulos Lab - we actually keep the C6/36 cells at 3² C, not 37 C (that was probably a typo). We have found that they grow fine at lower temperatures (²7 C), but we have been getting weird results with plaque assays done at that temperature, so it may affect how the virus replicates in them.RegardsShuzhen

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 15, 2008 - 3:15 PM
  3. I watched with interest your demo. The one step I was waiting to see is missing! You do not show in your video how exactly you remove the methylcellulose overlay and blot excess medium before adding the fixative.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 16, 2009 - 3:15 PM
  4. Hi, I have a suggestion. After you kill the mosquitŒs with 70% ethanol, picking them up individually with forceps to wash them looks a bit tedious. How about putting them in a cell strainer so you can pick up and wash a bunch together?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 10:47 PM
  5. Where can I get the hyperimmune fluid?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 9, 2010 - 8:32 PM
  6. Do you guys keep the C6/36 cell in the incubator with CO² or not?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 10, 2012 - 5:35 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats