פרוטוקול זיהומים דנגי ב יתושים (א aegypti) ו הפנוטיפ קביעת זיהום

Published 7/04/2007
6 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

Summary

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאל הווירוס דנגה, זה חייב להיות מוערך על תפקיד זה במניעת זיהומים נגיפיים בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים דנגה של יתושים יכול להיות assayed. שיטות לגידול את הנגיף בתרבית, האכלה קרום דם יתושים אדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

Cite this Article

Copy Citation

Das, S., Garver, L., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopoulos, G. Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination. J. Vis. Exp. (5), e220, doi:10.3791/220 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מטרתו של נוהל זה כדי להדביק את היתוש Aedes עם וירוס דנגה בתנאי מעבדה ולבדוק את רמת זיהום דינמי של הווירוס ברקמות יתושים. פרוטוקול זה נמצא בשימוש שגרתי ללימוד יתושים וירוס אינטראקציות, במיוחד עבור זיהוי של גורמים מארח רומן כי הם מסוגלים לקבוע יכולת וקטור. הניסוי כולו צריך להתבצע במעבדה BSL2. בדומה לזיהומים Plasmodium falciparum, בלבוש הולם, כולל כפפות וחלוק מעבדה חייב להיות משוחק בכל עת. לאחר הניסוי, כל החומרים כי בא במגע עם הנגיף צריכים להיות מטופלים עם 75% אתנול ו מולבן לפני שתמשיך עם כביסה רגילה. כל החומרים האחרים צריכים להיות autoclaved לפני השלכת אותם.

Protocol

א להפיץ את הנגיף בקו C6/36 התא.

  1. תאים לגדול ל -80% confluency בבקבוק 75 ס"מ 2;
  2. הסר את התקשורת עם 3-4 מ"ל הנותרים הבקבוק;
  3. קח 0.5 מניות וירוס מ"ל ולהוסיף לתוך התא מעל עם ריבוי של 1.5 זיהום חלקיקי הנגיף לכל תא. טלטול את הבקבוק במשך 15 דקות לאט בטמפרטורת החדר.
  4. דגירה במשך 45 דקות ב 5% CO 2 ו - 37 ° C
  5. הוסף מדיה 30 מ"ל, ו דגירה במשך 5 ימים.

ב הכינו תערובת של הנגיף בדם

  1. ניתוק התא עם מגרד ולהעביר את תא התקשורת של 50 צינורות חרוטי מ"ל;
  2. Centrifugate ב 800g במשך 10 דקות, לאסוף את supernatant, אבל להשאיר 1ml של supernatant עם תא גלולה;
  3. להקפיא את התא גלולה לעיל CO 2 יבש ולאחר מכן להפשיר בתוך 37 ° C אמבט מים, חזרו פעמיים עד שלוש פעמים;
  4. Centrifugate ב 800g במשך 10 דקות, לקחת את supernatant, ולשלב עם supernatant שנאספו בשלב 3;
  5. איסוף דם אדם שלם עם הליך זהה (שלב 3) להכנת תרבות gametocyte להדביק יתוש האנופלס עם Plasmodium falciparum;
  6. מערבבים כמות שווה של דם מעל האנושי כולו עם supernatant הנגיף בשלב 4, ולהוסיף בסרום אדם (10% של נפח כולו).
  7. דגירה את התערובת מעל דם האדם וירוס דנגה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים

ג יתושים האכלה

הליך זה כמעט זהה מה תוארו בסעיף לטיפול בדלקות Plasmodium falciparum של יתושים. אנו assay את הזיהום midgut ביום 7, ואת זיהום הרוק ביום 14 לאחר האכלה דם. כל החומר בא במגע עם הנגיף מטופלים הראשון עם אתנול 75% ולאחר מכן עם אקונומיקה 10%.

ד Assay כייל הנגיף ברקמות יתושים

  1. יומיים או שלושה לפני דיסקציה של רקמת יתושים, לגדול C6/36 תא צלחת 24 גם כך התא להגיע 80% confluency על היום שבו assay מתנהל;
  2. יתושים מורדמים ב 4 ° C, הקריבו פני השטח סטרילי ידי טבילתם אתנול 75% למשך דקה 1. אז יתושים נשטפו עם מים סטריליים פעמיים לפני דיסקציה של בלוטת הרוק midgut או מתחת למיקרוסקופ לנתח. מ בשלב זה, את כל ההליך בהמשך צריך להתנהל בסביבה סטרילית כגון ארון בטיחות ביולוגית. רקמות אלו מועברים צינור המכיל 150 μl התקשורת, ומעורים עם גלולה Kontes העלי מנוע עבור 90 שניות;
  3. ביצוע דילול 1:100 ידי הוספת 10 μl של homogenate לתוך 990 μl התקשורת;
  4. בצע עוד 1: 10, 1:100 ו 1:1000 דילול עם המדיום בצלחת 96 היטב;
  5. הסר את המדיה צלחת 24 היטב, ולהוסיף 100 μl של כל אחד מארבעת דילולים לעיל גם בכל המקביל;
  6. לנער את הצלחת לאט במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ואז דגירה של 5% במשך 45 דקות CO 2 ו - 37 ° C;
  7. הוסף 1ml של methycellulose כיסוי (1%) זה טוב;
  8. דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 5 ימים;
  9. השלבים מכאן והלאה לא דורשים סביבה סטרילית אך כמו כל טיפול אחר הפתוגן צריך להילקח בכל עת. מחק כיסוי methycellulose מהצלחת כל כתם כדי להסיר עודפי התקשורת
  10. הוסף 1ml של מקבע מתנול / אצטון (1:1) היטב כל אחד. שמור על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה;
  11. יוצקים את מקבע, ולשטוף פעם עם 1X PBS;
  12. בצע 1:1000 דילול כדי הנוגדן העיקרי נגד הנגיף עם שיכור סחוט 5%;
  13. הוסף 200 μl של נוזל hyperimmune בדילול זה גם C, דגירה על 37 מעלות במשך שעה 1;
  14. הסרת נוזל hyperimmune צלחת לשטוף עם 1 X PBS
  15. הכן דילול של 1:1000 המצומד עז אנטי עכבר (חתול KPL # 074-1806) ב 5% שיכור סחוט (5 גרם חלב דל שומן אבקת ב 100 מ"ל של 1 X PBS), ולאחר מכן להוסיף 200 μl זה היטב, דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1;
  16. הכנת המצע כדלקמן: להוסיף 1 טבלית של terrahydrochloride 3'-Diaminobenzidine (חתול Sigma # D5905) בתוך 20 מ"ל של 1 X PBS, לאחר מומס, ולאחר מכן להוסיף 8 μl של peroxidase מימן 30%
  17. הוסף 200 μl של המצע הנ"ל גם כל אחד. בואו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות
  18. הסר המצע ולהפסיק התגובה על ידי הוספת 1ml של מים מזוקקים זה טוב
  19. יוצקים מעל צלחות מים כתם להתייבש
  20. ספירת החלקיקים וירוס

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Incubator with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes plastic
human serum and blood O+
pipette tip for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts glass, sterile
water bath 37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates 6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish glass
Slides
fine-tip forceps
PBS 1X, sterile
dissecting microscope Microscope
C6/36 cells cells For virus propagation
C6/36 medium MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride Sigma-Aldrich D5905 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti Animal mosquito

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

6 Comments

  1. Do you normally culture your Ae. albopictus (C6/36) cells at 37C? Conventionally we culture at around ²8C; what is the reason for keeping yours so warm?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 15, 2008 - 2:06 PM
  2. Hi KellyI'm from the Dimopoulos Lab - we actually keep the C6/36 cells at 3² C, not 37 C (that was probably a typo). We have found that they grow fine at lower temperatures (²7 C), but we have been getting weird results with plaque assays done at that temperature, so it may affect how the virus replicates in them.RegardsShuzhen

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 15, 2008 - 3:15 PM
  3. I watched with interest your demo. The one step I was waiting to see is missing! You do not show in your video how exactly you remove the methylcellulose overlay and blot excess medium before adding the fixative.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 16, 2009 - 3:15 PM
  4. Hi, I have a suggestion. After you kill the mosquitŒs with 70% ethanol, picking them up individually with forceps to wash them looks a bit tedious. How about putting them in a cell strainer so you can pick up and wash a bunch together?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 10:47 PM
  5. Where can I get the hyperimmune fluid?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 9, 2010 - 8:32 PM
  6. Do you guys keep the C6/36 cell in the incubator with CO² or not?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 10, 2012 - 5:35 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats