Protocolo para infecções por dengue em mosquitos (A. aegypti) e Determinação Fenótipo Infecção

Published 7/04/2007
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Biology
 

Summary

Uma vez que um gene é identificada como potencialmente refratário para o vírus da dengue, deve ser avaliado para o seu papel na prevenção de infecções virais dentro do mosquito. Este protocolo ilustra como a extensão das infecções por dengue de mosquitos podem ser ensaiadas. As técnicas para crescer o vírus em cultura, alimentando-se membrana de sangue os mosquitos humanos e assaying títulos viral no intestino médio do mosquito são demonstradas.

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Das, S., Garver, L., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopoulos, G. Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination. J. Vis. Exp. (5), e220, doi:10.3791/220 (2007).

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Abstract

O objetivo deste procedimento é para infectar o mosquito Aedes com o vírus da dengue em uma condição de laboratório e examinar o nível de infecção e dinâmica do vírus nos tecidos do mosquito. Este protocolo é utilizado rotineiramente para o estudo de interações mosquito-vírus, especialmente para a identificação de novos fatores de host que são capazes de determinar a competência vetorial. Todo o experimento deve ser realizado em um laboratório BSL2. Semelhantes às infecções Plasmodium falciparum, traje apropriado, incluindo luvas e jaleco deve ser usado em todos os momentos. Após o experimento, todos os materiais que entraram em contato com o vírus precisam ser tratados com etanol 75% e branqueadas antes de prosseguir com a lavagem normal. Todos os outros materiais devem ser autoclavados antes de descartá-los.

Protocol

A. Propagar vírus na linhagem de células C6/36.

  1. Células crescem a 80% confluência em 75 frasco cm 2;
  2. Remova a mídia com 3-4 ml que fica no frasco;
  3. Tomar 0,5 ml do vírus estoque e adicionar na célula acima, com a multiplicidade de infecção de 1,5 partículas de vírus por célula. Agitar o frasco durante 15 minutos lentamente na temperatura ambiente.
  4. Incubar por 45 minutos em 5% CO 2 e 37 ° C
  5. Adicionar 30 ml de mídia, e incubar por 5 dias.

B. Prepare a mistura de vírus e de sangue

  1. Retire a célula com o raspador e transferir o celular e mídia para os 50 mL tubos cônicos;
  2. Centrifugado a 800g por 10 minutos; coletar o sobrenadante, mas deixar 1ml do sobrenadante com o pellet celular;
  3. Congelar o pellet celular acima das emissões de CO 2 e, em seguida, secar descongelar em banho-maria 37 ° C, repita duas a três vezes;
  4. Centrifugado a 800g por 10 minutos, retirar o sobrenadante, e combinam com o sobrenadante do passo 3;
  5. Coletar sangue humano total com o mesmo procedimento (passo 3) para a preparação da cultura gametócitos para infectar mosquitos Anopheles com Plasmodium falciparum;
  6. Combinar a quantidade igual de todo o sangue acima do humano com o vírus sobrenadante do passo 4, e adicionar soro humano (10% do volume total).
  7. Incubar a mistura acima de sangue humano e vírus da dengue durante 30 minutos a 37 ° C banho de água

Alimentação mosquitos C.

Este procedimento é quase idêntico ao que foi descrito na seção de infecções Plasmodium falciparum em mosquitos. Nós ensaio a infecção do intestino médio no dia 7, ea infecção salivar em 14 dias após a sangue-feeding. Todo o material que entrou em contato com o vírus são tratados pela primeira vez com etanol 75% e depois com lixívia a 10%.

D. Ensaio o título do vírus no tecido mosquito

  1. Dois ou três dias antes da dissecação de tecido mosquito, crescer C6/36 célula em uma placa de 24 poços de tal forma que a célula de chegar a 80% confluência no dia em que o ensaio é realizado;
  2. Os mosquitos são anestesiados a 4 ° C, sacrificados e surgiu estéril, mergulhando-os em etanol 75% por 1 minuto. Em seguida, os mosquitos foram lavados com água estéril duas vezes antes de dissecção da glândula salivar do intestino médio ou sob o microscópio de dissecação. A partir deste passo, todo o procedimento a seguir deve ser conduzido em um ambiente estéril, como uma cabine de segurança biológica. Estes tecidos são transferidos para um tubo contendo 150 mL de mídia e homogeneizados com uma pelota Kontes pilão do motor por 90 segundos;
  3. Fazer uma diluição de 1:100, adicionando 10 ml do homogenato em media 990 mL;
  4. Fazer mais um: 10, 1:100 e 1:1000 de diluição com o meio na placa de 96 poços;
  5. Remova a mídia na placa de 24 poços, e adicione 100 ml de cada uma das diluições acima de quatro em cada cavidade correspondente;
  6. Agite a placa lentamente por 15 minutos na temperatura ambiente, em seguida, incubar por 45 minutos em 5% CO 2 e 37 ° C;
  7. Adicionar 1 ml de Metilcelulosa overlay (1%) a cada poço;
  8. Incubar as placas a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 5 dias;
  9. Os passos a partir daqui não requerem um ambiente estéril, mas como com qualquer outro cuidado deve ser tomado patógeno em todos os momentos. Descartar overlay Metilcelulosa de cada prato e blot para remover excesso de mídia
  10. Adicionar 1 ml de metanol / acetona fixador (1:1) a cada poço. Manter a 4 ° C por 1 h;
  11. Deitar fora o fixador, e lave uma vez com 1X PBS;
  12. Faça 1:1000 diluição para o anticorpo primário contra o vírus com Blotto 5%;
  13. Adicionar 200 mL de líquido hiperimune diluído a cada C bem, incubar a 37 ° para 1 hora;
  14. Remover o líquido hiperimune e placa de lavagem com PBS 1 X
  15. Prepare uma diluição 1:1000 do conjugado de cabra anti-rato (KPL Cat # 074-1806) em 5% dopada (5g de leite em pó desnatado em 100 ml de PBS 1 X), e depois adicionar 200 mL em cada poço e incubar a 37 ° C por 1 h;
  16. Prepare substrato da seguinte forma: adicionar 1 comprimido de 3'-diaminobenzidina terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) em 20 ml de PBS 1 X, depois de dissolvido, e então adicionar 8 mL de peróxido de hidrogênio 30%
  17. Adicionar 200 mL do substrato acima para cada poço. Deixe descansar em temperatura ambiente por 10 minutos
  18. Remover substrato e parar a reação pela adição de 1ml de água destilada para cada poço
  19. Despeje em pratos de água e secar para secar
  20. Contar a partícula do vírus

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Incubator with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes plastic
human serum and blood O+
pipette tip for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts glass, sterile
water bath 37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates 6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish glass
Slides
fine-tip forceps
PBS 1X, sterile
dissecting microscope Microscope
C6/36 cells cells For virus propagation
C6/36 medium MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride Sigma-Aldrich D5905 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti Animal mosquito

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Comments

6 Comments

  1. Do you normally culture your Ae. albopictus (C6/36) cells at 37C? Conventionally we culture at around ²8C; what is the reason for keeping yours so warm?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 15, 2008 - 2:06 PM
  2. Hi KellyI'm from the Dimopoulos Lab - we actually keep the C6/36 cells at 3² C, not 37 C (that was probably a typo). We have found that they grow fine at lower temperatures (²7 C), but we have been getting weird results with plaque assays done at that temperature, so it may affect how the virus replicates in them.RegardsShuzhen

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 15, 2008 - 3:15 PM
  3. I watched with interest your demo. The one step I was waiting to see is missing! You do not show in your video how exactly you remove the methylcellulose overlay and blot excess medium before adding the fixative.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 16, 2009 - 3:15 PM
  4. Hi, I have a suggestion. After you kill the mosquitŒs with 70% ethanol, picking them up individually with forceps to wash them looks a bit tedious. How about putting them in a cell strainer so you can pick up and wash a bunch together?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 10:47 PM
  5. Where can I get the hyperimmune fluid?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 9, 2010 - 8:32 PM
  6. Do you guys keep the C6/36 cell in the incubator with CO² or not?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 10, 2012 - 5:35 PM

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