高度耦合的大鼠心肌线粒体的制备

Published 9/23/2010
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Biology
 

Summary

我们描述а纯,高度耦合的大鼠心脏细胞生物能,生物物理测量学,蛋白质组学或线粒体DNA和脂质分析的功能或结构的研究线粒体隔离协议。

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Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria. J. Vis. Exp. (43), e2202, doi:10.3791/2202 (2010).

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Abstract

在氧化磷酸化的的过程中在细胞内ATP生成的线粒体的功能,是举世公认的。在过去几十年中已经出现了重大进展,我们比其他能源发电的线粒体的功能的认识。这些措施包括在细胞凋亡中的作用,作为信号的细胞器,哺乳动物发育和老化细胞的新陈代谢和细胞增殖之间的协调所作出的贡献以及的。我们的生物过程由线粒体调制的理解是基于强劲隔离和处理实验动物组织的完整线粒体方法。从大鼠心脏线粒体是细胞代谢的过去和目前的研究,包括对敲除动物的研究中最常见的准备工作之一。

在这里,我们描述了一个详细的隔离与耦合的高度完整的线粒体快速的方法。大鼠心脏线粒体的这些准备工作是出色的功能和结构研究,对细胞的生物能,生物分子,蛋白质组研究和分析线粒体DNA,蛋白质和脂质的运输对象。

Protocol

简介

从大鼠心脏线粒体是细胞代谢的过去和目前的研究中最常见的准备工作之一。它们可以快速,可靠地获得了很大的数量从野生型基因敲除动物。一般程序包括胰蛋白酶,分馏和差速离心组织消化。

有几个条件,要保持在线粒体的分离,从各种组织,包括心脏(图1)。

  • 该组织已被彻底剁碎,因为它直接影响产量获得线粒体。心脏组织是最好讳言小弯剪,可以接着使用Latapie组织磨床,或者,如果一个组织研磨机无法使用,与插座孔直径约1.0毫米直径的压蒜。
  • 这是必要的温度维持在每一步的解决方案。因此整个过程必须在寒冷的房间和所有仪器和解决方案已提前准备和冷却。如果没有保存的温度条件,稳定的几个属性的准备可能会丢失。线粒体的结构是非常敏感的冻结,以便overfreezing暂停(例如在离心)是不允许的,尤其是如果研究是重要的主动运输。
  • 一个重要的参数是该过程的时间长度;隔离应尽快进行,并获得准备立即使用。因此,手术器械,解决方案和设备要提前做好准备。

材料与仪器

仪器

  1. 直剪刀,尖
  2. 弯剪刀
  3. 镊子
  4. 培养皿
  5. 小漏斗+尼龙过滤片(预洗)
  6. 6烧杯50毫升
  7. 磁力搅拌器和两个冰浴
  8. 一个大冰浴
  9. 2个小型的磁力棒
  10. 为颗粒铲刮
  11. 离心管
  12. Latapie组织记者(可取代压蒜)
  13. 铁氟龙玻璃均质20毫升和12毫升
  14. 废物烧杯
  15. 最终线粒体悬浮和测定蛋白质的样品的Eppendorf管
  16. 冰浴

解决方案(每2只计算):

  1. 洗涤缓冲液:0.3米蔗糖,10毫米的HEPES(pH值= 7.2),0.2毫米EDTA(1000毫升)
  2. 分离缓冲液:蔗糖0.3米,10毫米的HEPES(pH = 7.4的),0.2毫米EDTA,1 mg / ml的BSA(Sigma公司A6003)(100毫升洗液编制)。牛血清白蛋白可以取代更便宜的脂肪酸类似物。相同的缓冲区或等渗的变化,可以用来作为Resuspending缓冲。
  3. 胰蛋白酶(Sigma公司T8003)解决方案:在1MM盐酸2.5mg/ml(0.5毫升)
  4. 从大豆的胰蛋白酶抑制剂(Sigma公司T9128)6.5 mg/10毫升隔离缓冲

协议

上图所示的程序的总体方案。 1。心应冷却和洗涤缓冲液,心室组织切除,切碎,并在光解治疗胰蛋白酶均质洗涤。悬挂在低速离心和更高的速度再次获得上清离心收集线粒体。根据计划实验resuspending缓冲区可取代任何其他的等渗溶液。

动物,终止与英国“动物(科学规程)法”的规定。“颈椎脱位由斩首。提取后,立即斩首的动物心脏,这是必要的,因此,没有任何动物终止和心脏提取之间的延迟。如果平行隔离肝线粒体预计应大鼠实验前禁食过夜。

  1. 准备三个含有40毫升的洗涤缓冲液的烧杯。在3至5分钟,然后再继续下一步的冰盐浴冷却他们。确保不overfreeze冰晶云后开始出现,并立即使用。
  2. 断头处死大鼠,打开胸腔,并提取心脏。小切口,然后立即转移的心冰冷的解决方案中的第一个烧杯。挤压心脏,以清除血液,并放入第二个烧杯。重复此操作,每个心。
  3. 干滤纸上的心。卸下所有的脂肪,血块,耳廓和筋膜和池心室组织。
  4. 百果汇集的组织,直到5分钟左右的小弯剪刀在培养皿上冰粒子的大小约1-2毫米。
  5. 组织按放入剁碎的组织和传递它通过。请注意,大量的材料可以在按下继续这样做从记者的墙壁和底部收集所有的心脏组织。
  6. 转移到烧杯中的物质与50毫升的洗涤缓冲液和搅拌。通过尼龙过滤器,然后过滤暂停。洗液洗净剁碎组织在过滤器上的3倍,并丢弃滤液。
  7. 转移到20毫升的洗涤缓冲液洗涤组织和放置在冰水浴磁力搅拌器。加入0.5毫升的胰蛋白酶不断搅拌下的解决方案,并启动计时器。准备另一磁力搅拌器,冰浴和第二个50毫升的烧杯。
  8. 4分钟,简单地通过使用几个和向下招松散安装一个小玻璃均质聚四氟乙烯(10 - 15毫升),以驱散暂停部分均质暂停部分。均质后转移到第二个烧杯中暂停。 9分钟的重复过程,所以,你总执行暂停均质两次。孵育15分钟后,添加10毫升的隔离缓冲含有胰蛋白酶抑制剂和孵育1分钟。
  9. 暂停,再通过过滤器的尼龙过滤器,并保存滤液。收集的微粒分数左一个过滤器,均质,洗涤缓冲液15-20毫升1分钟。
  10. 合并滤液,离心15分钟在600克匀浆。
  11. 仔细筛选到一个新的离心管中产生的上清液。避免污染颗粒,离心15分钟8500克再次。
  12. 高速离心后,弃上清,用1毫升的缓冲区丢弃的蓬松的白色外缘层冲洗沉淀2-3次。分手的颗粒,但要避免用锅铲在底部红细胞的红点。如果血细胞得到洛斯,删除从均质前悬挂红色位。
  13. 用小均质或交替轻柔吹打重悬沉淀。更多Isolationbuffer悬浮液稀释,离心15分钟8500克再次。
  14. 弃上清,重悬在Resuspending缓冲区(选择的等渗缓冲)沉淀,离心一次。
  15. 由此产生的棕色颗粒包含洗完整的线粒体。在您所选择的等渗缓冲的体积非常小的重悬沉淀。

图1
图1展示的隔离大鼠心脏线粒体的程序一步一步的计划。顶端部分,1-9阶段:组织受阻,胰蛋白酶处理和均质化;底部的一部分,阶段10-15:差速离心。

Discussion

迅速隔离与耦合的高度完整的线粒体协议详细描述。准备获得可用于功能或结构,对细胞的生物能学,蛋白质组学研究或线粒体DNA的分析和脂肪含量的研究。也可以进行主动运输的离子和代谢中间体的生物物理研究。这是可能的进一步过程中线粒体的准备,以隔离submitochondrial颗粒,外膜或氧化磷酸化的净化单独的组件。所描述的方法是修改的标准协议隔离雅各和Saks 1。准备线粒体的预期收益率大约为10-15毫克每心脏线粒体蛋白质和苹果酸/谷氨酸等准备不同的呼吸控制率8至12国IV周围O 20.12μmolxmin -1 XMG蛋白呼吸-1 23 ° C中的介质,包括0.25 M蔗糖氯化钾,10毫米,0.2毫米EDTA,5 mM磷酸钾(pH值8.0)与150微米ADP启动国家第三呼吸(确切的实验条件和补充,见文献2)。

应特别注意隔离程序开始前的几个技术细节。它是使用干净的聚碳酸酯或聚丙烯离心管的关键,因此应彻底刷干净的热水,然而,洗涤剂治疗应保持在最低,洗涤管。此外,它是更好地收集一切必要的玻璃器皿和仪器在寒冷的房间隔离的前一天。

在隔离烧杯烧瓶传输缓冲区时,а特别注意应的解决方案,防止滴冰水。处理组织时,应该强调的,因为即使短期斩首的动物和冷却的组织之间的时间延迟将导致部分耦合线粒体进行了心脏提取应尽快。快速冷却,除去心中的彻底清洗是必须获得标准的编制,血红蛋白及红细胞NADase。

胰蛋白酶是降解结缔组织蛋白组织的易感性增加在均质剪切力。应避免长时间暴露在蛋白酶组织,因为它在质量低劣的线粒体结果。

经过高速离心,离心管的墙壁应该用纸巾擦拭,删除任何墙壁上积累的脂肪物质的存款。

对于最终的再悬浮,它是更好地使用,以低量的最终缓冲区,以尽量减少在储存过程中(150至200μL心每缓冲区)线粒体功能的丧失。运输二价阳离子的研究没有螯合剂必须在最后的准备,因此线粒体应清洗数次与EGTA无介质隔离后的第一个小时内使用。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

我们感谢作者介绍的线粒体生物学和许多有益的见解和意见,在此过程中领域的教授A.维诺格拉多夫和维拉Grivennikova博士。作者感谢夫人阿曼达McKintock从皇后大学媒体与视频准备的帮助办公室。

References

  1. Jacobus, W. E., Saks, V. A. Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation. Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).
  2. Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).

Comments

6 Comments

  1. Why is it better to fast animals before isolating mitochondria?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 29, 2011 - 3:34 PM
  2. For isolation of heart mitochondria fasting is not really essential. However, in order to increase the efficiency of animal use, your colleagues might use other organs such as liver (for mitochondria, microsomes or hepatocytes isolation). If any processing of liver tissue is expected, then fasting is essential to deplete glycogen stores and avoid white precipitate in all stages and excessive washing.

    Reply
    Posted by: Alexander G.
    August 30, 2011 - 7:00 AM
  3. Why do you need trypsin treatment? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 24, 2011 - 8:53 AM
  4. Trypsin (or any other protease) is needed to loosen connective tissue and weaken junctions between cardiomyocytes in order to separate them at later stages. It significantly increases the yield of the mitochondria.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 9:01 AM
  5. What were the clearances (gap sizes) you used for the homogenizes? Thanks.

    Reply
    Posted by: Yashar G.
    May 25, 2012 - 3:21 PM
  6. Most of commercially avalable Potter homogeniser have a clearance of 0.1-0.15mm. Ours were closer to 0.15. It should not be completely loose; the plunger should move freely, but you have to feel some resilience.

    Reply
    Posted by: Alexander G.
    May 28, 2012 - 5:31 AM

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