Microfabricated платформы для механическим динамическим культуре клеток

Published 12/26/2010
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

В этом протоколе, мы демонстрируем изготовление microactuator массив вертикально перемещенных сообщений, на котором основана технология, и как это технологическая база может быть изменена для проведения высокой пропускной способностью механически динамических клеточных культур в обоих двумерных и трехмерных культуры парадигм.

Cite this Article

Copy Citation

Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture. J. Vis. Exp. (46), e2224, doi:10.3791/2224 (2010).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Способность систематически зонда в пробирке клеточного ответа на комбинации mechanobiological стимулы для тканевой инженерии, лекарств или фундаментальные исследования клеточной биологии ограничено современными технологиями биореактора, которые не могут одновременно применяться различные механические стимулы к культуре клеток. Для того, чтобы решить эту проблему, мы разработали серию microfabricated платформы предназначены для выявления последствий механических раздражителей в высокой пропускной формате. В этом протоколе, мы демонстрируем изготовление microactuator массив вертикально перемещенных сообщений, на котором основана технология, а в дальнейшем продемонстрировать, как базовой технологии могут быть модифицированы для проведения высокой пропускной способностью механически динамических клеточных культур в обоих двумерных и трех- мерных парадигмы культуры.

Protocol

А. описание устройства и эксплуатации

Устройства изготовлены с использованием многослойной мягкой литографии 1 в полидиметилсилоксан (PDMS), и способны одновременно генерации диапазон механических условий в отдельных клеточных культур местах по всей microfabricated массива. В этом протоколе шаги для изготовления массив пневматическим приводом microposts которые впервые описаны, а затем шаги для изменения устройства позволяют механически динамичной культуры как в двумерном (2D) и трехмерных (3D) парадигмы культуры. Изложенные microfabricated подход повышает пропускную способность по сравнению с существующими системами макроуровне, и лучше всего подходит для скрининга на последствия различных механических условий.

Принцип работы устройства основан на массив вертикально приводом microposts. Microposts изготавливаются на свободно-приостановлены диафрагмы, а поднимаются и опускаются, применяя положительное и отрицательное давление под срабатывание диафрагмы (рис. 1). Ключевой особенностью массива является то, что при изменении размера срабатывание диафрагмы, единый источник давления может быть использован для получения диапазон вертикального перемещения по массиву. Этот принцип используется для быстрого экране клеточного ответа на большое количество механических условий стимулирующего через одно устройство.

На основании аналогичных макромасштабе дизайн Шаффер и соавт. 2, наш проект включает в себя второй приостановлено и смазкой фильм культуре клеток за сообщение, что позволяет клеткам опыт 2D деформации подложки, как культура фильм скользит над повышенной нагрузки пост. Кроме того, photopatterning массив клеточных нагруженные гидрогели на загрузку сообщений позволяет сжатие стимуляции клеток в 3D культуры. Подробные инструкции по созданию этих систем следовать.

Б. Изготовление массив microactuator пневматические

Изготовление массив пневматического microactuator требует строгого согласования в многослойных структурах PDMS. Это является сложной задачей из-за усадки вызванных ошибками выравнивания регистрации. Для решения этой проблемы мы используем процесс изготовления называется «сэндвич плесень изготовления '3, показано, эффективно устраняют этот вопрос 4.

Подготовка материалов

  1. Одно-или многоуровневый SU-8 мастеров для каждого из различных уровней изготавливаются в чистых помещениях с использованием стандартных процедур. Для этих устройств мастеров 200-400 мкм, в зависимости от приложения. Мастера hardbaked при 80 ° С в течение трех дней перед использованием.
  2. Чистая слайды стекло и SU-8 мастеров silanized в вакуумной камере, чтобы предотвратить прилипание лечения PDMS к материалам. В fumehood, 60 мкл silanization агента (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-трихлорсилана (Соединенные химических технологий, Бристоль, штат Пенсильвания) является пипеткой в ​​чашки Петри в камере. Голое стекло и SU-8 мастеров помещаются в камеру и держали под вакуумом в течение ночи.
  3. Два коврики (продается в магазинах ремесло питания) и накладные фильм прозрачности струйных разрезаются на размеры немного больше, чем SU-8 мастер используется для изготовления сэндвич плесени.

Производство сэндвич Mold

  1. Каждый слой многослойного устройства требуется слой PDMS формованных используя этот метод. Схема процесса изготовления форм сэндвич предоставляется на рисунке 1.
  2. PDMS мономера и сшивающего тщательно перемешивают в стандартном соотношении 10:1. 3 мл смеси неотвержденного PDMS наносятся на предварительно сфабрикованных SU-8 хозяина, и дегазированной в вакуумной камере.
  3. Пенные подкладки и СУ-8 мастер размещаются на плите плексигласа.
  4. Прозрачность тщательно опускается на неотвержденного PDMS, убедившись, чтобы избежать захвата пузырьков воздуха. Струйные прозрачных пленках имеется грубая и гладкой стороной, и важно, чтобы гладкая сторона контакты неотвержденного PDMS.
  5. Silanized предметное стекло помещается в верхней части прозрачности, под вторую площадку пены и пластины оргстекла сверху. Сэндвич затем зажаты вместе с помощью C-зажим.
  6. Сэндвич PDMS лечится в духовке при температуре 80 ° С в течение не менее 4 часов.
  7. Сэндвич удаляется из печи и дают остыть, прежде чем снимать зажим.
  8. Зажим удаляют, а сэндвич разобрана, а губки, отбрасываются. Прозрачность, тщательно очищенные от SU-8 мастера, сохраняя фильм узорной PDMS.
  9. Эти узорной PDMS слоев и их обработку слоев прозрачности может быть сохранен в пыли и пока они не готовы к использованию. Мы успешно использовали PDMS слоев до двух месяцев, без каких-либо заметных вредных последствий.

Построение многослойной устройство

т "> Схема для изготовления microactuator массиве содержится в 2А рис и эксплуатации приводов показано на рисунках 2В и С. Для изготовления устройства:

  1. Самый нижний слой PDMS узорной готовится сэндвич изготовления пресс-формы. Для этих экспериментов, круглые модели от 600 до 1200μm в диаметре были использованы.
  2. Слой PDMS затем переносится на чистую предметное стекло. Коронного разряда блок используется для лечения PDMS и стеклянных поверхностей с кислородом плазмы, а две поверхности находятся в контакте друг с другом. Стек помещается на плите при температуре 80 ° C для завершения процесса связи. Прозрачность может быть затем очищенный прочь и отбрасывается. Во время этого процесса, фильм узорной PDMS никогда не освобождается от жесткой подложке, не давая усадки отдельных слоев.
  3. В зависимости от успеха шаг сэндвич литье, тонких пленок PDMS, которые не были вытеснены из между СУ-8 функций и прозрачности, возможно, должны быть удалены. Это можно сделать вручную с помощью иглы 25G в стереоскоп.
  4. Второй сэндвич формованных слой образуется отрицательная форма копию желаемой диафрагмы-и-структуры должностей. Это потому, что изготовление больших площадей СУ-8 мастеров является сложной задачей, но использование альтернативных процессов производства может устранить этот дополнительный шаг. В этой демонстрации, круглые сообщений 500 мкм в диаметре, были использованы. Отрицательные формы реплика silanized, и временно прикреплены к стеклу использованием двусторонней клейкой ленты. Затвердевший PDMS откладывается, дегазации и спин-покрытием на этот слой сэндвич форму в течение 45 секунд при 1000 оборотов в минуту, уступая срабатывание диафрагмы 60 мкм. Спин-покрытых слоем PDMS частично сушки при 80 ° С в течение ~ 20 минут, или пока PDMS является липким, но не деформирует постоянно при прикосновении.
  5. Предметное стекло и двусторонний скотч, удаляются из частично вылечить PDMS слой, который затем плазмы обращению, переворачивают и помещают в заказных выравниватель. Aligner состоит из вакуумной патрон крепится к микроманипулятора (Сиския; Миссия Viego, Калифорния, США). Первый слой PDMS Затем плазму обращению и помещен на вращающейся сцене (Ньюмарк, Грантс-Пасс, Орегон, США), под вакуумом патрон, и согласованность между двумя слоями наблюдается использовании зум 12x Navitar машинного зрения системы (Navitar; Рочестер, штат Нью-Йорк, США).
  6. Слоев выравниваются использованием манипулятора, и тщательно приводят в контакт. Сэндвич затем удаляется из Aligner, и лечение в духовке при температуре 80 ° C в течение еще 30 минут. Прозрачность и silanized реплики PDMS плесень может быть очищенные от устройства и отбрасывается. Устройство затем полностью вылечены при 80 ° С в течение не менее четырех часов.
  7. В зависимости от типа механического эксперимент проводится стимуляция, дополнительные слои PDMS может быть связан с этой базы устройства, повторяя изложенные процесса. Подробная информация для различных типов механических экспериментов стимуляция приведены в разделах С и D.

Разъемы

  1. После того как устройство завершения иглы могут использоваться для очистки слой PDMS в точке соединения.
  2. Коммерческая разъемы, такие как Nanoport (Апчерч Научно; Oak Harbor, Вашингтон, США) может быть использован для взаимодействия с внешней трубы. Чтобы избежать высоте требований коммерческих разъемы, и таким образом использовать стандартные чашки Петри, как устройство контейнеры, мы изготовлении нашей собственной следующим образом.
  3. Примерно 35 г PDMS будет брошена и лечение в Omni-а лоток (Nunc, Рочестер, штат Нью-Йорк, США). Устройство очищенные, и разрезать на небольшие участки уплотнения, из которых 1 / 8 "отверстия удаляется с помощью штампа.
  4. 18G притупляются иглы используется для основной из раздела со стороны прокладки. Меньше 21G игла используется для удаления центрального ядра до снятия 18G иглу.
  5. Примерно 15 г PDMS будет брошена и лечение в Omni-а лоток крышкой, очищенный и порезанный в тех же размеров раздела. Этот раздел является то чистить скотчем, плазменные связан с верхней части прокладки, и устройство плазмы, связанный с устройством, ударил вниз.
  6. Второй тупой иглой 18G затем отделяется от цветного пластика Луер разъем вставляется в отверстие и порошковой запечатаны в месте с несколькими каплями PDMS. В результате разъем является достаточно эффективным, экономичным и имеет мертвого пространства объем достаточно большой, чтобы предотвратить пузырьков воздуха от входа в каналы во жидкости, заполняющей этапов.

С. Механически активные 2D субстраты культуры

Массив приводом microposts может быть использован для создания различных профилей напряжения в приостановлен полимерной пленки, на которой клетки культивируют. Повышение в должности смазкой фильм причины фильм поскользнуться и деформируют вокруг столба. Использование кругового результаты после загрузки в equibiaxial распределение напряжения, нодизайн является универсальным в том, что различные формы пост может быть использован для создания различных деформаций полей. Чтобы изменить привод массив для 2D экспериментов культуры (схема на рисунке 3):

  1. Бонд третий слой PDMS к устройству, как показано на рисунке 3а. Третий слой PDMS состоит из двухслойной структуры. Нижний круг соответствует размеру срабатывания полости под приводом microposts. Диаметр верхнего круга 100 мкм больше, чем диаметр загрузки сообщений. 200 мкм, микроканальных соединяет эти особенности в связи области, и будет использоваться для смазки загрузки сообщений и культуры фильме.
  2. Изготовление и облигаций разъемы для устройства, как описано выше.
  3. Спиновые пальто 10-15 мкм слой PDMS на гладкую сторону прозрачности (спин параметры: 4000 оборотов в минуту, 120 секунд). Лечение при 80 ° С в течение не менее 4 часов.
  4. Appy низкого уровня вакуума (Barnant кадетского воздуха стремление насос) для приводов, снижение массив сообщений.
  5. Плазменные лечения и связь спина пленка для PDMS приводом микроустройство. Место на плите при температуре 80 ° С в течение 10 минут. Сообщения и культуры фильме останется гидрофильные в течение короткого времени.
  6. Заполнить смазкой каналов с 90% глицерина в деионизованной водного раствора. В дополнение к смазке, эта формулировка утверждает, гидрофильность PDMS на неопределенный срок, снижение коэффициента трения. Пузырьки воздуха будет оставаться в ловушке между пост и культуры фильме. Поставьте устройство на плите при температуре 40 ° С, и продолжают вводить смазку в канал, в результате чего небольшое повышение давления. Через несколько минут, пузырьки воздуха будет диффундировать через PDMS, а все поверхности будут смазаны.
  7. Удалить отрицательного давления, выпуская сообщения.
  8. Использование скальпеля, обвести тонкой пленки PDMS. Тщательно очистите прозрачности отступать от устройства.
  9. Плазменные связь вырезаются вручную PDMS прокладку вокруг области культуры устройства.
  10. Стерилизовать устройства путем замачивания в 70% этаноле в течение 5 минут, а затем под бактерицидные УФ светом в кабинете биологической безопасности в течение 45 минут.
  11. Плазменные лечения поверхностных и инкубировать с 100 мкг / мл коллагена (белка или альтернативные ECM) в течение ночи при температуре 4 ° C.
  12. Вымойте устройство с фосфатным буферным раствором (PBS), и семян клеток 10-15000 клеток / см 2 в соответствии со стандартными протоколами культуре клеток.

Подробная характеристика работы микроустройство и биологических экспериментов, проведенных на этой платформе были опубликованы ранее 7.

Д. Механически активные 3D гидрогелей

Изменения устройство может также использоваться для включения сжатия photopatterned. клетка-Ладена, трехмерных гидрогелей в высокой пропускной образом. В этом примере мы создадим 350 мкм в диаметре полиэтиленгликоля (ПЭГ) цилиндров гидрогель, инкапсуляции C3H10T1 / 2 для мыши мезенхимальных стволовых клеток, а также применять сжатие штаммов в пределах от 5 до 25% по массиву. Этот протокол может быть использован с более продвинутых химических фотополимеризации гидрогеля. Чтобы использовать платформу для экспериментов в трехмерном mechanobiology (схема на рисунке 4):

Устройство модификаций:

  1. Пальто сообщения с толщиной 1 мкм слоя Parylene-C, чтобы уменьшить газопроницаемость и улучшить полимеризации раз в системе гидрогеля ПЭГ. Это позволит снизить цитотоксических эффектов свободных радикалов основе фотополимеризации реакции. Кусочки скотч используется для маскировки областей вокруг поста, и устройство покрытия в PDS 2010 LabCoter 2 системы (Специальные системы покрытий, Индианаполис, Индиана, США).
  2. Покрытием устройство удаляется из системы покрытия, а скотч очищенный прочь, оставив конформных слой Parylene-C по должности.
  3. Покровное стекло является methacrylated 8 погружением в 2% объем / объем раствора 3 - (trimethoxysilyl) пропил метакрилат в 95% этилового спирта в течение 2 минут.
  4. Покровное промывается в 100% этанола и запекать при 100 ° C, в результате чего метакрилат групп на поверхности.
  5. Толщиной 200 мкм Spacer PDMS фильм будет брошена в чашке Петри, и разрезать на небольшие участки. Четыре из этих небольших разделов плазме связаны по краю methacrylated покровное.
  6. Распорки то плазмы связан с PDMS-областей устройства, охватывающие Parylene-C покрытием сообщений.
  7. Устройство стерилизовать мытья в 70% этанола, и воздействия бактерицидным ультрафиолетовым светом в кабинете биологической безопасности в течение 45 минут.

В месте полимеризации:

Cell-Ладена гидрогелей ПЭГ затем были photolithographically узорной в устройствах 8,9 следующим образом:

  1. Подготовка 10% вес / PEGDA (3.4kDa, Лейсан Био, арабские, Алабама, США) и 10% вес / ПЭГ (8kDa, Sigma-Aldrich)решение в средствах массовой информации unsupplmented культуре клеток.
  2. Приготовьте раствор фотоинициатора запас 100 мг / мл Irgacure 2959 (химические вещества Ciba Specialty; Tarrytown, Нью-Йорк, США) в 1-винил-2-pyrolidinone.
  3. Тщательно смешать две подготовленные решения вместе, чтобы получить раствор с концентрацией 0,4% м / о из фотоинициатора. Фильтры смесь через фильтр 0,45 мкм, шприц для стерилизации и удаления твердых частиц.
  4. Trypsinize клеточных культурах и подготовить суспензии клеток в культуре средств массовой информации, в два раза желаемой конечной точки концентрации клеток.
  5. Смешайте суспензии клеток и фильтруется гидрогеля предшественником / фотоинициатора решение в соотношении 1:1.
  6. Inject раствора в микроустройство с помощью длинной иглы 25G. Тщательно избежать захвата пузырьков в устройстве.
  7. Совместите печатные маски прозрачности для выравнивания следов на поверхности устройства. Настройка системы УФ-освещения, чтобы обеспечить дозы УФ на 17,5 мВт / см 2 при устройстве поверхности. Illuminate гидрогеля через маску на 195 s. На этот раз была оптимизирована для нашей системы, и, возможно, должны быть скорректированы.
  8. Смыть Неполимеризованные решение гидрогеля предшественника с PBS, и замены PBS с культурой массовой информации. Нажать загрузки сообщений для сжатия гидрогеля конструкций.

Подробная характеристика работы микроустройство и биологических экспериментов, проведенных на этой платформе были опубликованы в другом месте 10.

Е. Периферийное оборудование

Измененный чашки Петри используются для поддержания стерильности клеточных культур во время срабатывания устройств. Притупляются и лишил 18G иглу epoxied в отверстие в сторону чашку Петри. Трубы (Clay Adams Intramedic PE190, VWR International, Арлингтон-Хайтс, штат Иллинойс, США) пресс-быть установлены на этих разъемов и подключается к контролируемые электромагнитными клапанами и источника давления.

Рабочее давление до устройства обеспечиваются внешние микронасосы. Для 2D эксперименты, положительные значения давления 30-55 кПа были получены с использованием управляемый напряжением эксцентричный мембранного насоса (SP 500 EC-LC 4.5VDC; Schwarzer Precision, Германия). Широтно-импульсной модуляции контроллер напряжения, используемых для изменения приложенного напряжения для контроля выходного давления. Электромагнитные клапаны и коллекторы (S10MM-30-12-3 и MSV10-1; Pneumadyne, Плимут, Миннесота, США), которые используются для создания циклического сигнала давления. Клапаны приводятся в действие с 12 V сигнала, управляемый квадратных генератор функция сигнала.

Ф. характеристики устройства и использования

Изображений на устройстве

Общая проблема с изображениями клеток или частиц на устройство бедных оптическое разрешение из-за конденсации капель под пленкой PDMS поддержкой загрузки сообщения. Это возникает в результате конденсации температура и влажность различия внутри инкубатора и после фиксации или на столике микроскопа. Для решения этой проблемы:

  1. Подключите открытом водоеме в порт давление на входе, и залейте его деионизированной водой. Мы используем открытые шприц Луер разъем блокировки для удобства.
  2. Место устройства и заполнить водохранилище в вакуумной камере, и откачки.
  3. Подождите 5 минут, и принести камеру к атмосферному давлению. Повторите два-три раза. Так как воздух вытесняется из каналов устройства, то он заменяется водой из водохранилищ, устраняя капли конденсата и обеспечивая четкий оптический путь для микроскопии.
  4. Изображение культуры области, используя яркие поле или флуоресцентной микроскопии.

Для живого изображения клетки, эта процедура может быть сделано до посева клеток на устройствах. Тем не менее, каналы должны быть разработаны достаточно большим, чтобы предотвратить любые вязкие потери давления между подразделениями на устройстве.

Штамм характеристику на борт слежения

В 2D системах культуры:

  1. Развести 1 мкм в диаметре флуоресцентные шарики (Bangs лабораторий; Фишер, В) в метаноле к желаемой концентрации. Растворы 1:150 от первоначальной концентрации (1% твердых веществ в бисер буферный раствор) были признаны подходящими для наших нужд.
  2. Плазменные лечения поверхности устройства, а депозит 5-10 мкл из бисера подвески.
  3. Подождите, метанол испаряется. Повторите, если шарик концентрация слишком мала.
  4. Изображение клеточной культуры области в покое, и под нагрузкой.
  5. С открытым исходным автоматизированные алгоритмы слежения частица может быть использован в ImageJ (NIH) для отслеживания перемещений шарик.
  6. Перемещение величина, направление и расположение параметры могут быть использованы в математической модели для описания деформации поля на поверхности устройства.

Аналогичную процедуру можно проследить, чтобы охарактеризовать штаммов в 3D-системах. Смешайте количества флуоресцентного бисера в часРешение ydrogel предшественника. В случае системы гидрогеля PEG, размеры пор намного меньше, чем у 1 бисером мкм в диаметре. Бисер заключены в гидрогель, и система может быть отображены использованием конфокальной микроскопии. Бусы смещения могут быть отслежены, проанализированы и установлены на деформацию модели.

Г. представитель Результаты

Представитель результаты для изготовления устройства, характеристики и эксплуатации приведены в рисунках 5 и 6.

Рисунок 1
Рисунок 1. Сэндвич форму производственного процесса. (А), накладные прозрачности тщательно опускается на неотвержденного PDMS на СУ-8 хозяина. (B) сэндвич помещается в стек пена, стекла и металла, и лечение в духовке при сжатии. (C) стек разобрана и прозрачности очищенный прочь, сохраняя узорной PDMS слой 3. Воспроизводится с разрешения Института Физики.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема вертикально приводом micropost по телефону () отдыха и (б) тогда, когда приводятся. (C) Схема многослойной процесс изготовления требуется сделать массив microposts 3. Адаптировано с разрешения Института Физики.

Рисунок 3
Рисунок 3. Процесс изменить microactuator массив для проведения экспериментов для клеток, культивируемые на деформирующий двумерных подложки 7. Воспроизводится с разрешения Королевского химического общества http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Рисунок 4
Рисунок 4. Процесс изменить microactuator массив для проведения экспериментов для клеток, культивированных в трехмерном photopatterned гидрогеля конструкций 10. Воспроизводится с разрешения Elsevier.

Рисунок 5
Рисунок 5. () Пример устройства для 2D культуры mechanostimulatory. Красная краска, используемая для обозначения исполнительных давление каналов доставки и синего красителя используется для обозначения смазки каналов. (B) Пример образ эксперимента характеристики штамма. Красные пятна представляют недеформированного расположение бусин, в то время как зеленые пятна представляют собой деформированные места 7. Воспроизводится с разрешения Королевского химического общества http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Рисунок 6
Рисунок 6. () Примеры устройств для 3D-сжатие экспериментов. Зеленая краска используется для обозначения каналов управляющих давлений. (B) сверху вниз зрения micropost массив (С) гидрогеля построить по образцу начало поста. (D, E) Побочные восстановленных изображений флуоресцентных бусины в гидрогель построить под (D) и остальные (E) 55 кПа давление срабатывания, продемонстрировав процесс деформации характеристика в 3D-системе культуры 10. Воспроизводится с разрешения Elsevier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя концептуально просты, устройство изготовления требуется некоторое экспериментальных навыков и практики. В частности, в случае 2D культуре клеток, выравнивание несколько слоев в устройстве может быть сложным, особенно на большой площади массива. С практической точки зрения, мы можем надежно достичь 100%-ная ставка выравнивания успех, используя устройства с 50 мкм толерантности в интервал между смежными функциями в несколько слоев. Мы также успешно продемонстрировано соответствие с допусками ниже, чем 15 мкм, а время, необходимое выравнивание значительно больше, и достигается при более низких шансов на успех. Выравнивание маску photopattern биоматериалов на массив так же сложно, но сообщения могут быть предназначены для быть довольно большими, по сравнению с гидрогеля цилиндров, уменьшая этим ограничением.

Другие проблемы связаны с культурой клеток на материалы, описанные в этом протоколе. В 2D растяжение системы, с использованием PDMS как культуру фильм пределы биологических исследований на краткосрочные эксперименты, как клеточная адгезия к подложке начинает быть существенно затронуты через 6 часов после стимуляции. Это можно исправить путем ковалентного связывающих белков матрицы на поверхность PDMS 11, или путем замены культуры PDMS ячейки подложки с более клинически значимых полиуретановый материал, для улучшения адгезии клеток и обеспечивают большую гибкость при проводили биологические эксперименты 12. В описанной системе 3D, гидрогель химии предназначен в качестве иллюстративного примера. Долгосрочные культуры прилипшие клетки требует использования альтернативных природных или синтетических гидрогелей, или включение клей лигандов в ПЭГ матрицы (которая может быть легко достигается с помощью стандартных химических PEGylation) 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы признаем, финансовая поддержка со стороны естествознания и техники Научно-исследовательский совет Канады и Канадского института исследований в области здравоохранения (CHRPJ 323533-06), стипендию Онтарио Высшей программы СМ и Канаде исследования кафедры в микро-и нано-технических систем к Ю.С., и в Mechanobiology в CAS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit Dow Corning
SU-8 masters
Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane United Chemical Technologies
Foam pads Craft supply stores, 1-2 mm thick
Overhead inkjet transparencies Grand Toy
Plexiglass plates
C-clamp hardware store
Micromanipulator system Siskiyou, Inc.
Custom-made vaccum mount
Vision system, Navitar 12x zoom Navitar
Connecting tubes VWR international Clay Adam Intramedic PE190
Blunt 18G needles Small Parts (www.smallparts.com)
Eccentric diaphragm micropump Schwarzer Precision SP 500 EC-LC4.5V DC
Solenoid valves Pneumadyne S10MM-30-12-3
Solenoid manifold Pneumadyne MSV10-1
Function generator
3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate Sigma-Aldrich
Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa Laysan Bio Inc.
Polyethylene glycol 8 kDa Sigma-Aldrich
Irgacure 2959 Ciba Specialty Chemicals
1-vinyl-2-pyrolidinone Sigma-Aldrich
Standard cell culture reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  2. Schaffer, J. L. Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane. J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).
  3. Jo, B., Lerberghe, L. V. an, Motsegood, K., Beebe, D. Three-dimensional micro-channel fabrication in polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer. Journal of Microelectromechanical Systems. 9, 76-81 (2000).
  4. Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography. J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).
  5. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  6. Bongaerts, J., Fourtouni, K., Stokes, J. Soft-tribology: Lubrication in compliant PDMS-PDMS contact. Tribology International. 40, 1531-1542 (2007).
  7. Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).
  8. Liu, V. A., Bhatia, S. N. Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells. Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).
  9. Hahn, M. S. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
  10. Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31, 577-584 (2010).
  11. Wipff, P. J. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).
  12. Moraes, C. Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices. Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).
  13. Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Great thoughts...
    Amazing ideas....

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2011 - 6:38 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats