İndüksiyon ve Kronik Relaps Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Klinik Puanlama

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

DA sıçanlarda kronik relapsing deneysel otoimmün ensefalomyelit: Bu video, multipl skleroz bir hayvan modeli indüksiyonu ve klinik skorlama göstermektedir. Tüm sıçan omurilik ve tam Freund adjuvan içeren bir emülsiyon immunizing fareler tarafından uyarılan hastalık, insan hastalığına benzer klinik belirtiler sunar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multipl skleroz (MS), genç erişkinlerde sık etkileyen santral sinir sistemi (MSS) kronik inflamatuvar bir hastalıktır. Bu, beyin ve omurilikte yaygın alanlarda demiyelinizasyon ve glial korkutuyorsun tarafından karakterize edilir. Bu lezyonlar, sinir iletim değiştirebilir ve CNS (örneğin paraparezi, felç, körlük, inkontinans) demyelinated plakların yerini değişir devre dışı bırakma nörolojik defisit neden.

Deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE), MS için bir model. EAE ilk tavşan omurilik yetişen virüsler kullanarak, insanlarda kuduz aşılama sırasında yanlışlıkla indüklenen oldu. Inaktive virüs omurilik enjekte edilen artıklar, merkezi sinir sistemi hastalığı kaynaklı. Bu gözlemlerin ardından, EAE ilk modeli nehirleri Homojenat ve 1935 yılında Schwenther MSS ile aşılanan insan olmayan primatlar olarak tarif edilmişti. EAE bu yana türlerin çeşitli oluşturulan ve türlerin / zorlanma ve antijen kullanılan immunizing bağlı olarak farklı ders takip edebilirsiniz. Aynı antijen kobay kronik bir hastalıktır neden olur Örneğin, adjuvan ile emülsiyon miyelin temel protein Lewis sıçanlarda immunizing, EAE akut modeli neden olur.

Burada açıklanan EAE modeli tam Freund adjuvan emülsiyon DA DA sıçan omurilik karşı sıçan immunizing tarafından indüklenir. Sıçanlar-bağışıklama sonrası 7-14 gün içinde artan bir flask paralizi gelişir. Klinik belirtiler birkaç hafta içinde bir relapsing-remitting seyir takip etmektedir. Patoloji, CNS ve demiyelinizasyon plaklar büyük immün infiltratlar gösterir. Videonun sonunda EAE ile hayvanların bakımı için özel dikkat edilmesi gereken noktalar açıklanmıştır.

Protocol

Kronik-relapsing EAE indüksiyonu ve izleme

Emülsiyon takviye tam Freund adjuvan eklendi sulu çözelti antijeni 1:1 karışımıdır. Bu antijen adjuvan ve başka bir yol boyunca eklemek için çok önemlidir!

Yapma ve bir emülsiyon enjekte atık bir sürü. 1.5 veya 2 kez her zaman için ihtiyaç duyduğunuz herşeyi daha fazla hazırlamak.

Otoklavlanmış harç, havaneli, cam şırınga, ve köprüler kullanın. Tüm plastik steril olmalıdır. Düzenli bir laboratuvar tezgahı üzerinde hazırlık yapılabilir.

1. Takviye adjuvan hazırlanması

Mycobacterium tuberculosis (Difco katalog # 231.141) ve bir havan topu yerleştirmek 30 mg tartılır. Bakteri kırılma önlemek için çok sert basmadan ince toz haline olun. Freund adjuvan H37Ra (Difco katalog # 231.131) ve karışımı tam 10 ml ekleyin. Bu takviye adjuvan 4 mg / ml, Mycobacterium tuberculosis içerir. Tüpüne aktarın.

2. Spinal kord Homojenat hazırlanması

-80 Dondurulmuş DA sıçan (yaş / cinsiyet kayıtsız) ve mağaza ° C omurilik toplayın Takviye adjuvan: 1:1 (hacim ağırlığı) karıştırmak için yeterli donmuş omurilik tartılır. Bir jilet ile mümkün olduğunca ince olarak omurilik Kıyma, 1. kısımda kullanılan harç transferi ve havaneli bir hamur yapın.

3. Emülsiyon hazırlanması

  1. Place bir tüp Freund adjuvan tam desteklenmiştir. Yüksek hızda karıştırın. Vorteks ise omurilik Homojenat damla damla ekleyin. omurilik Homojenat tüm eklenir, 5 dakika daha karıştırın. Bu karışım hafif pembe açmalısınız.

  2. 5 ml cam şırınga içinde koyun ve emülsiyon (Fisher katalog # 14-825-17L) 18G köprü kullanarak başka bir 5 ml cam şırınga bağlamak. (5-10 dk) sabit hale gelinceye kadar, diğer bir şırınga emülsiyon gönder. Emülsiyon 5 ml 'den fazla hazır ise, birkaç 5 ml şırınga büyük şırınga KULLANMAYIN kullanın.

  3. Emülsiyon şırınga 4 ° C'de 3 hafta süreyle saklanabilir. Ben onu yıkmak değildir kontrol etmek için en az 12 saat önceden hazırlanması tavsiye ederiz. Bu kalın ve 2 faz ayrı kalmalıdır. Rengi sarı veya bej bir ışık gecede değişecektir.

4. Sıçan, Bağışıklama

  1. Birkaç dakika için şırınga emülsiyon karıştırın ve enjeksiyon için kullanılan şırınga transfer. 200 ul, çok kısa süreli anestezi altında 23G iğne ve 3 ml Luer-Lock şırınga kullanarak kuyruk dibinde subkutan enjekte edilir.

  2. Alıcılar 7-9 hafta eski kadın DA sıçan. Harlan Sprague Dawley sıçan olsun.

  3. Sıçanlar günde iki kez gözlenen ve günlük olarak değerlendirilmelidir. Klinik bulgular emülsiyon enjeksiyondan sonra 7-15 gün bekleniyor.

Klinik skorlama:

0: Herhangi bir hastalık

0.5: distal gevşek kuyruk

1: gevşek kuyruk

2: orta şiddette paraparezi, ataksi

3: orta derecede paraparezi, zaman zaman sıçanlarda gezileri

3.5: bir arka bacak felç, diğer hamle

4: tam arka ekstremite paralizisi

5: komple arka bacak felci ve inkontinans

6: can çekişen, nefes alma zorluğu, yemek veya içmek değildir. Hemen Euthanize.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol için birkaç önemli hususlar vardır.

DA sıçanlarda Genetiği satın hangi damızlık bağlı olarak biraz farklı olacaktır. Bu farklılıklar, indüksiyon EAE sıçan yatkınlık artabilir veya azalabilir. Sıçanlarda EAE daha duyarlı iseniz olmayan takviye tam Freund adjuvan hatta eksik Freund adjuvan kullanarak bağışıklama gücü azaltmak istiyorsanız. Ayrıca emülsiyon hazırlarken önce enjekte emülsiyon miktarını azaltarak ya da, tuzlu su ile omurilik Homojenat seyreltilmesi düşünebilirsiniz. Sıçan, emülsiyon, konut tesisin temizliği kontrol immunizing tam gücü kullanarak EAE klinik belirtileri ortaya çıkmaz. Parazitler (kıl kurdu olarak) ile enfekte Sıçanlar EAE geliştirmek. Otoklavlanmış kafeslerde filtre üstleri ile temiz koşullar altında hayvanların barınma ve onları asitlendirilmiş su ad libitum (asitlendirilmiş su hazırlanması için protokol bağlı) vererek düşünebilirsiniz.

Emülsiyon, su-yağ olmalıdır, böylece petrol adjuvan tamamen kat damla damla antijen. Bir emülsiyon (yağ-su) başka bir yol yuvarlak kalın gibi olacak hazırlanmıştır ancak encephalitogenic olmayacaktır.

Sıçanlar dostu hayvanlar onların işleyicisi alışkın iseniz, bu nedenle encephalitogenic emülsiyon enjeksiyondan önce günlük bazda hafifçe bunları işlemek için iyi bir fikirdir. Bu stres ve bir ısırık riskini azaltacaktır.

Animals şiddetli EAE (3 veya daha fazla puan) ile özel bir bakıma ihtiyacı. Sıçanlar kuyruk değil, vücut tarafından toplanan asla. Bu hasta hayvanlarda stres azaltmak için daha da önemli. Bu, bütün hayvanlar, gıda ve jel paketleri yataklar koyarak ve su şişeleri üzerinde uzun sipper tüpler gıda ve suya erişimi olmasını sağlamak için çok önemlidir. Sıçanlar EAE ile bir hayvan durdurmak ya yemek ya da enstitünün veteriner hekimin içme eğer, yeme ve içme devam etme veya hayvan euthanize. Hasta sıçanlarda sağlamak onlar sürekli ayaklar altına değil, ancak tek başına bırakarak sıçanlarda önlemek, sosyal hayvanlardır ve şirketin ihtiyaç sağlıklı hayvanlardan ayrılmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB ve KGC Airmid A.Ş. kurucularından ve danışmanlar

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s Adjuvant Reagent Fisher Scientific DF 311-360-5 Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Reagent Fisher Scientific DF3114-33-8 Manufactured by Difco
DA rat Animal Harlan Laboratories Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml Tool Fisher Scientific 14-823-10 B
Metal bridge - 18G Tool Fisher Scientific 14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml Tool BD Biosciences 309585
Needles - 20G 1 1/2 Tool Fisher Scientific 14-826-5C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

21 Comments

  1. Dear Dr. Beeton,
    I watched your video with great interest.
    I am a researcher at the CEA, Orsay, France, and we are interested in inducing EAE in DA rats. I would kindly like to ask you a few questions in this regard:
    1. Should the meninges be removed prior to the freezing of the spinal cord, to avoid aggregates/ clumps in the emulsion?
    ². Is it possible to reduce the spinal cord into fine powder by using a mortar and pestle in liquid nitrogen rather than using a razor and cutting it over dry ice?
    3. Can the emulsion be prepared by using a polytron or some other homogenisation system rather than the glass syringes and the connecting bridges (we seem to have a problem to obtain some of these tools).
    4. Is it possible to use rats older than 7-9 weeks or dŒs susceptibility decrease with increasing age?
    Thank you in advance.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 5, 2008 - 11:20 AM
  2. We use whole spinal cords, without removing any parts.
    Since we published this video and following advice from Dr. Holmdahl (Lund, Sweden), we have started using fresh spinal cords from ~1² weeks old DA rats. The emulsions give more homogeneous diseases when working with a large group of animals (> 40 recipients). We have not tried using a mortar and pestle. I don't think it would work for fresh cords but might on frozen cords.
    I haven't tried any other methods for preparing the emulsion. As a graduate student in France I was able to buy glass syringes but we had to ask facilities to make metal bridges to connect the syringes by using two metal needles.
    Recipients should be young adults for best susceptibility to EAE. We have never tried using older DA rats but in other rat models of EAE (using Lewis rats) we have found that the older the recipients, the less susceptible to EAE they were. Note that not all DA rats are identical, there are small variations from vendor to vendor so you may want to try rats from several vendors in your area to find which are more susceptible to EAE.
    If you have any more questions you are welcome to contact me by email at beeton@bcm.edu.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    February 5, 2008 - 4:02 PM
  3. Dear Dr. Beeton, thank you for very interesting video. I would like to ask you , if you have any experience with the EAE induction in mice using this protocol. Thank You for the answer. Sincerely Jan Pazour

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 30, 2008 - 9:31 AM
  4. I have never used this protocol in mice. For mice I have only used the MOG 35-55 peptide to induce EAE [in C57BL/6 mice]. Using whole spinal cord should work in mice but the protocol would have to be adjusted. You would first have to ensure you are working with the right strain and then you would have to work out the doses and type of adjuvant. Most protocols in mice also call for an additional injection of pertussis toxin and very often mice need a booster injection to develop EAE. This can be a rather tricky protocol to adapt to mice. Sorry that I could not give you a more helpful answer.

    Reply
    Posted by: Christine B.
    June 30, 2008 - 10:38 AM
  5. Dear all, could there be any difference in using M.butyricum instead of M. tuberculosis H37RA containing adjuvant in inducing EAE in wistar rats (mylein basic protein- MP bio-vendor). I plan to use the former.Please suggest.

    raghul
    toxicologist
    SGS -LSS india

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 25, 2008 - 1:24 PM
  6. Dear Raghul, I have no experience inducing EAE in Wistar rats so am unsure of the results. When inducing acute EAE in Lewis rats with MBP we used CFA made with M. butyricum and supplemented it with 3 mg/ml M. tuberculosis and this worked well with 100% EAE incidence and a homogeneous disease. Best wishes, Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    August 25, 2008 - 5:46 PM
  7. what is the concentration of the HCl for drink wather?

    Reply
    Posted by: Andres Q.
    September 15, 2009 - 2:40 PM
  8. To prepare acidified drinking water, fill a clean carboy with 10 liters of water. Add 5 ml of 1²N (concentrated) hydrochloric acid (HCl) to the water and stir. The pH of the solution should be in the range of ².4-3.0.
    For more safety, ensure that your stock of concentrated acid is not used for anything else but preparing acidified drinking water. This will reduce the risk of accidental contamination with toxic chemicals.
    Do not check the pH directly in your carboy but rather in a sample taken into a beaker.
    This acidified drinking water is not quite as acidic as common sodas many people drink every day. It will not damage the lining of the Œsophagus of the rats.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2009 - 3:03 PM
  9. Dear Dr Beeton,
    I found and watched with great interest you movie about induction and clinical
    scoring of chronic-relapsing EAE in rats and i would like to ask you if
    you have some hystological or/and MRI findings to prove that the major
    pathophisiologycal changes, induced by the immunization, occur in the brain
    and not in the spinal cord? How much this animal model mimics what is
    happening in human brain in MS? I am interested more by demyelination
    which i can observe using DT-MRI.

    Thank you in advance

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 8:32 AM
  10. We have not done any histology the brain of these animals as our focus was on the spinal cord.
    We used the brains to isolate mononuclear cells and found more with a CCR7- differentiated phenotype in EAE rats than controls. This suggest brain-infiltration and therefore a potential for demyelinating lesions, but I can't guaranty it.
    This model is definitely demyelinating in the spinal cord (see figure S6 in the online supplement of the paper Matheu, Beeton et al. Immunity ²008, ²9:60²).
    Christine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 1:54 PM
  11. Dear Dr. Beeton, thank you for very interesting video. Do you have the protocol to induce EAE in mice? Can you please provide injecting protocol for mice. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 12, 2010 - 1:24 PM
  12. The protocol will depend on the mouse strain you are interested in. Some strains are more susceptible to EAE than others. A good place to start is the following protocol: http://www.penningerlab.com/uploads/media/EAE_induction_01.pdf

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 30, 2011 - 11:34 PM
  13. Dear Dr Beeton
    Thanks for the vieo, it is very helpful. I have just one question regarding the part you use as "SPINAL CORD". Is it seperated from spinal column or you just use spinal colum containing spinal cord?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 12, 2011 - 5:01 AM
  14. You want to use the spinal cord itself, removed from the bone. It is pretty easy to collect since you don't need to keep it in a single piece (as you would for histology for example). You can simply scrape it out.
    Hope this helps!
    Christine

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2011 - 4:36 PM
  15. Dear Dr Beeton
    Thanks for the video. Please let me know how to make acidified water and HOW LONG THE ANIMAL SHOUL DRINK SUCH A WATER BEFORE INDUCTION OF EAE?
    Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2011 - 3:58 AM
  16. For preparation of the acidified water, please refer to my answer to a similar question from Andres Quintanar, posted 09/15/²009.
    We put our rats on acidified water as soon as we receive them, which is 4-7 days before we induce EAE.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 27, 2011 - 4:40 PM
  17. Dear Dr Beeton
    Thanks for the video. It is really helpful. Can we use Sprague-Dawley and Wistar Rats. Do we need in your model to use pertussis toxin.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2011 - 6:32 AM
  18. Hello Dear Christine Beeton
    Thanks for your useful video. I would be grateful if you response my question: In this video when you work with Mycobacterium tuberculosis H37RA for making it thin powder, you didn't wear mask, is it safe for you?

    Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 22, 2012 - 5:34 AM
  19. Hello Dear Professor Beeton
    I have another question dear Dr Beeton: Should we perfuse the rat before spinal cord isolation (for EAE induction) or no the perfusion is just necessary when we want to isolate the cells from spinal cord or brain? I want to isolate the guina pig spinal cord for EAE induction and I don't know the perfusion is necessary or no.
    Best Regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 10, 2012 - 7:46 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics