ג'ין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת Non-חדרית electroporation פלסמיד ו

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה שאינה ויראלי מסירת בונה גנטית באזור מסוים של המוח מכרסם החי. השיטה מורכבת הכנה פלסמיד, ייצור micropipette, ניתוח חולדה בילוד הגור, microinjection של לבנות, ואת

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation. J. Vis. Exp. (43), e2244, doi:10.3791/2244 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

יצירת חיות טרנסגניות היא הגישה הסטנדרטית בלימוד פונקציות של הגן של עניין in vivo. עם זאת, רבים בנוקאאוט או חיות טרנסגניות אינם קיימא באותם מקרים שבהם הגן מתבטא שונה או נמחק בתוך האורגניזם כולו. יתר על כן, מגוון של מנגנוני פיצוי לעתים קרובות לעשות את זה קשה לפרש את התוצאות. ההשפעות הפיצוי ניתן להקל על ידי תזמון גם את ביטוי הגנים או להגביל את כמות התאים transfected.

שיטת microinjection חדרית בלתי הלידה והן electroporation vivo מאפשר משלוח ממוקד של גנים, siRNA או מולקולות צבען ישירות באזור קטן של עניין במוח מכרסם היילוד. בניגוד הטכניקה המקובלת חדרית הזרקה, שיטה זו מאפשרת transfection שאינם נודדים סוגי תאים. בעלי חיים transfected באמצעות השיטה המתוארת כאן ניתן להשתמש, למשל, עבור שני הפוטונים in vivo הדמיה או בניסויים אלקטרו על פרוסות המוח חריפה.

Protocol

1. הקדמה

יצירת חיות טרנסגניות היא שיטה רבת עוצמה של חקירה של פונקציות גן חיים בעלי חיים 1 ועל מנגנון נפרמים מחלה 2,3, כמו גם עבור מניפולציה המאפיינים של 4 תאים. עם זאת, ההליך הוא מייגע למדי, מאוד זמן רב ויקר, ולכן התאוששות להשתמש בשיטות חלופיות משלוח הגן כגון הזרקת נגיפי 5, הזרקת חדרית היילודים עם electroporation 6 ו ברחם electroporation 7,8. שיטת הזרקה חדרית ללא electroporation הלידה ויש לו קבוצה ייחודית של יתרונות: שימוש שאינו ויראלי בונה גנטיות; אפשרות ליצור דפוס ביטוי מקומי באזור ריבית; ב transfection באתרו של לא נודדות סוגי תאים, כגון קליפת המוח האסטרוציטים.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את תהליך מפורט של משלוח גן הלידה למוח החולדה הילוד באמצעות פלסמיד קידוד עבור חלבון משופר פלואורסצנטי ירוק תחת מקדם ביתא אקטין עוף עם CMV משפר (pCAG-EGFP) 9. אנו מדגימים את הכנת פתרון פלסמיד המכיל את הזריקה, ייצור של זכוכית דקה pipettes והרכבה של microinjector על מכשיר stereotactic. אז אנחנו מדברים על anaesthetizing גורים עכברוש עם isoflurane, על ביצוע הניתוח, על הליך ההזרקה ועל electroporation באמצעות מלקחיים אלקטרודות ב porator vivo. לבסוף, אנו נדון בקצרה את התוצאות הצפויות, פרספקטיבות קשיים שעלולים להתעורר במהלך ניסויים אלה.

2. הכנה פלסמיד עבור electroporation

  1. בדרך כלל אנחנו מכינים 10 μl של הפתרון הזרקת פלסמיד בצינור קיר μl 200 דק. פתרון זה מספיק עבור מספר ניסויים.
  2. אנו לערבב 8 μl של הפתרון פלסמיד (ראה חומרים וציוד) עם μl 1 של PBS 10X (ראה חומרים וציוד) 1 μl של פתרון מים מהיר 0,1% הירוק (ראו חומרים וציוד).
  3. הריכוז הסופי של פלסמיד בפתרון הזרקה צריך להיות בין 1 ל 3 מיקרוגרם / μl. ריכוז נמוך של ה-DNA פלסמיד תפחית את יעילות transfection, ואילו ריכוז גבוה DNA תהיה צמיגה מדי הזרקה באמצעות קצה דק של זכוכית נימי.

3. זכוכית הכנה מחט

  1. להכנת כוס פיפטה, אנו משתמשים זכוכית בורוסיליקט נימי עם נימה (ראה חומרים וציוד) אלקטרודה אנכי זכוכית חולץ (ראה חומרים וציוד) על מקסימום משיכת וחימום פרמטרים.
  2. לאחר מכן, אנו לשבור את קצה פיפטה בעזרת פיסת נייר כדי להשיג קצה 10-20 מיקרומטר קוטר.
  3. אנחנו בודקים את קוטר קצה ובצורה אובייקטיבית תחת מיקרוסקופ.

4. Microinjector הרכבת

  1. שימוש בפולימר דק נימי (ראה חומרים וציוד) אנחנו ממלאים בערך 1 / 3 של נפח של 10 μl המילטון מזרק (ראה חומרים וציוד) עם שמן מינרלי (ראו חומרים וציוד). הימנע בועות אוויר!
  2. אז אנחנו ממלאים את פיפטה מזכוכית עם שמן מינרלי להכניס את פיפטה לתוך המזרק המילטון. הימנע בועות אוויר!
  3. מזרק עם כוס פיפטה קבוע אז על microinjector המחוברים לבקר (ראה חומרים וציוד).
  4. ההתקנה microinjection קבוע על מכשיר stereotactic (ראה חומרים וציוד) מאפשר לנו בבטחה לטבול את קצה פיפטה זכוכית לתוך הצינור עם פתרון הזרקת פלסמיד.
  5. כאשר קצה נוגע במשטח של הפתרון, לטבול אותו עוד יותר על ידי מ"מ 1 או 2 ולמלא את פיפטה עם μl כ 1 של תמהיל הזרקה באמצעות מזרק מיקרו בקר.

5. Anaesthetizing בעלי חיים

כל הנהלים המוצגים כאן נעשו על פי מאוניברסיטת הלסינקי תקנות ניסויים בבעלי חיים.

  1. עבור כל ניסוי, אנחנו ממלאים מזרק גז הדוק (ראו חומרים וציוד) עם כ 2 מ"ל של isoflurane (ראה חומרים וציוד).
  2. מאשר את המזרק הוא קבוע על יחידת ההרדמה (ראה חומרים וציוד) המחובר למקור זרימת אוויר, תיבת חיות את המסכה קבוע על ההתקנה stereotactic.
  3. על יחידת ההרדמה, אנו להתאים את זרימת האוויר כ 250 מ"ל / דקה ורמת isoflurane ל -4%.
  4. אנחנו שמים את החולדה הגור לתוך תיבת חיה עבור 2-5 דקות.
  5. כאשר הגור מפסיק לנוע, למקם אותו על כרית חימום (ראה חומרים וציוד) מצורף ההתקנה stereotactic.
  6. המקום חלק מקורי של ראשו של הגור לתוך המסכה anaesthetizing.
  7. זה לוקח 5 עד 10 דקות עבורהגור להיכנס הרדמה עמוקה.
  8. בדוק את עומק ההרדמה עם קמצוץ הזנב להקטין את יבוא isoflurane ל% כ 1.5-2.0.

6. , כירורגיה Microinjection ו electroporation

  1. פנקו את העור על ראשו של הגור עם אתנול 70%.
  2. בעזרת מספריים קטנים (ראה חומרים וציוד) מלקחיים דק (ראה חומרים וציוד), לחתוך את העור בעורפו של הגור אל המצח שלה.
  3. בנד חתיכות העור לצדדים ולמשוך ברים האוזן מעט לתוך פתחי שמיעתי של הגולגולת על הראש קיבעון העור.
  4. באמצעות מיקרוסקופ המשקפת, אנחנו לאתר את נקודת גבחת על הגולגולת.
  5. זהה את האזור של עניין באמצעות קואורדינטות stereotactic.
  6. מקם את פיפטה זריקה מעל האזור הזה ולסמן אותו על ידי הטלת 25-50 nl הפתרון הזרקה אל פני הגולגולת.
  7. מקדחה הגולגולת בעדינות ובזהירות בנקודה המסומנת באמצעות מקדחה במהירות גבוהה כירורגי (ראו חומרים וציוד) תחת המיקרוסקופ עד נוזלי מופיע באזור קדח.
  8. תקן מלקחיים electropotation אלקטרודות (ראה חומרים וציוד) בצידי הגולגולת עם ג'ל מוליך זרם (ראו חומרים וציוד) כדי להשיג מוליכות טובה יותר.
  9. הסר את טיפת נוזל מהחור קדח בעזרת טמפון קטן (ראה חומרים וציוד) לטבול את המחט זכוכית אל החור על פי הקואורדינטות של הזריקה.
  10. להשרות 25-100 nl הפתרון הזרקת בשיעור של 5 עד 20 nl / sec.
  11. במהירות להסיר את פיפטה ו electroporate מיד. Electroporation נעשית על ידי יישום בחמש לחיצות מלבן עם משך של 50 אלפיות ו משרעת של V 99 בתדר של 1 הרץ.
  12. הסר אלקטרודות וברים האוזן.
  13. לתפור את העור חתך באמצעות שילוב של מלקחיים אילמת (ראה חומרים וציוד) וחד הנושאים כירורגי (ראו חומרים וציוד).
  14. הנח את הגור לתוך תא חם 15-30 דקות כדי לסייע להחלמה שלו לאחר הרדמה.
  15. לאחר מכן החזיר את הגור לכלוב של אמא שלו.

7. נציג תוצאות

הביטוי של transgene בתאי transfected בהצלחה יופיעו כ -10 שעות לאחר electroporation, והוא יישאר יציב במשך כמה שבועות.

אנו microinjected הפלסמיד גם לשכבות עמוקות או קליפת המוח באזור הסטריאטום של יום הלידה 2 (P2) גורים Wistar חולדה שבוצעו electroporation vivo כמתואר לעיל. פרוסות המוח (400 מיקרומטר עובי) נחתכו לאחר 2-6 ימים (P4-P8) באמצעות vibrotome במדיום חיתוך קר (Hepes שנאגרו תמיסת מלח מאוזן של ארל) 10. הרכישה בוצעה באמצעות תמונה Zeiss Axioplan 2 LSM5 פסקל confocal מיקרוסקופ (Zeiss, גרמניה) במדיום חיתוך בטמפרטורת החדר.

אתרי הזרקה בשכבות קורטיקליים עמוקים בסטריאטום הכיל תאים transfected רבים להביע EGFP שאותרו באזור קומפקטית של כ 200-300 מיקרומטר קוטר (איור 1 א ', ב). בתוך תאים transfected, רמת הביטוי EGFP גבוהה מספיק כדי לאפשר הדמיה של תהליכים תאיים דק (איור 1C) כולל דנדריטים עם הקוצים של צורות שונות (איור 1D) וצרורות האקסון (איור 1E). היציבות החזקה של EGFP וכן כדאיות התא לאחר electroporation מותר התחקות החלקים המרוחקים של אקסונים (עד 1.5-2 מ"מ מגופים התא) כגון מסופים קליפת המוח (איור 1F).

איור 1
באיור 1. (א) transfected בהצלחה תאים באזור הסטריאטום במוח חולדה P4 המגדירה את האתר הזרקת פלסמיד. (ב) תאים transfected בשכבות עמוקות בקליפת המוח (כ 1000 מיקרומטר מתחת לפני השטח קליפת המוח) של המוח עכברוש P5. (ג) תא transfected באזור הסטריאטום במוח חולדה P8. (D) תהליכים דנדריטים של תא transfected באזור הסטריאטום במוח חולדה P8; החצים מצביעים על סוגים שונים של הקוצים הדנדריטים וגם filopodia. (ה) האקסונים של תאים transfected בתוך מסלול בטחונות. (F) האקסונים סיום על פני השטח של pial P8 עכברוש הקורטקס (ראש חץ). ברים הם סולם 100 מיקרומטר על A, B, E ו-F, 10 מיקרומטר על C ו-D

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דרכי המסירה הגן לתוך המוח מכרסם החי מבוססים היטב עבור ברחם electroporation 7,8,11,12, ולאחרונה, עבור electroporation הלידה 6. עם זאת, שיטות אלו מבוססות על הזרקה תוך חדרי של ה-DNA פלסמיד, שיכולה להיות המגביל את מספר יישומים. לדוגמה, שיטות אלו אינן מאפשרות מיקוד תאים באזורים מסוימים במוח כמו ההיפוקמפוס, ולא transfection שאינם נודדים סוגי תאים כאלה האסטרוציטים כמו קליפת המוח. Non-חדרית זריקה בשילוב עם electroporation שימש לראשונה למסירה גן נוירונים לתוך המוח הקטן 13. פרוטוקול שלנו ממחישה את הרחבה של שיטה שאינה חדרית עבור אזורים אחרים במוח חולדה. אנו מציעים גישה מתודולוגית שלנו היא אלטרנטיבה יעילה שיטות ויראלי המסירה הגן לאזורים מוגבלים של עניין בתוך מוח החולדה הלידה 5.

למרות היתרונות של השיטה הנוכחית, קשיים מסוימים עשויים להיות צפויים כפי שנדון בהמשך.

גיל 1.Optimal של חיה

כאשר הדבר אפשרי, גורים צעירים עכברוש בילוד יש להשתמש, כאמצעי להגדיל הן יעילות transfection והישרדות הגור לאחר הניתוח. בידיים שלנו, P0 גורים קטנים מדי כמו שקשה למקד reproducibly אזור מסוים במוח באמצעות קואורדינטות stereotactic המתקבלים אטלס המוח זמין גיל 14 זה. בנוסף, P0 גורים יש עור דק ועדין שעלול לעכב תפירה. P3 ו-P4 נוח ביותר מבחינת מניפולציות כירורגית stereotactic לעומת P0-P2 בעלי חיים, אבל יש להם רגישות יתר isoflurane הרדמה שעלולים לגרום להתקפים והפרעות נשימה במהלך הניתוח. לכן, האפשרות הטובה ביותר היא P1-P2 גורי חולדה אשר צפויים במהלך ניתוח גדול מספיק עבור microinjections לשחזור.

בעיות עם 2.Possible microinjection

כאשר כמויות קטנות של פתרון (25-100 nl) מוזרקים באמצעות טיפ זכוכית דקה לרקמת המוח מפעיל לחצים מנוגדים, זה קריטי, כי בועות אוויר או דליפות נמנעים בקפידה. כדי למנוע אי אלו עלול לגרום לירידה דרמטית יעילות transfection.

3.Precision גבולות קואורדינטות stereotactic

למרות הדיוק של הקואורדינטות stereotactic, יש להם מגבלה על שחזור 0.3 מ"מ 15. מניסיוננו באמצעות בעלי חיים גיל משקל זהה ניתן להקטין את גבול 0.2-0.1 מ"מ אשר מספקת מיקוד לשחזור של אזור CA1 בהיפוקמפוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

אנו מודים יקטרינה Karelina לעזרה עם הקלטת פסקול וידאו, איוון Molotkov עבור 3D אנימציה ד"ר פיטר Blaesse להכנת החטיבה-EGFP פלסמיד.

העבודה נתמכה על ידי מענקים ממרכז הניידות של הבינלאומי של פינלנד, קרן התרבות הפינית האקדמיה של פינלנד.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
2A-sa dumb Tweezers, 115mm equipment XYtronic XY-2A-SA Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad equipment Supertech TMP-5b
Borosilicate tube with filament material Sutter Instrument Co. BF120-69-10 Glass needle
Disposable drills material Meisinger HP 310 104 001 001 008
Dulbeco’s PBS 10X reagent Sigma-Aldrich D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm equipment Fine Science Tools 91150-20 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Ealing micr–lectrode puller equipment Ealing 50-2013 Vertical electrode glass puller
Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c material Johnson & Johnson EH7177H Surgical threads
Exmire micro syringe 10.0 ml equipment Exmire MS*GLLX00 Gas-tight syringe
Fast Green reagent Sigma-Aldrich F7252
Forceps electrodes equipment BEX LF650P3 Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use
Foredom drill control equipment Foredom FM3545 Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Foredom micro motor handpiece equipment Foredom MH-145 Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Gas anesthesia platform for mice equipment Stoelting Co. 50264 Assembled on stereotaxic instrument
Isoflurane reagent Baxter Internationl Inc. FDG9623
Micro dressing forceps, 105 mm equipment Aesculap BD302R Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Microfil material World Precision Instruments, Inc. MF34G-5 Micro syringe filling capillaries
Mineral oil reagent Sigma-Aldrich M8410
NanoFil Syringe 10 microliter equipment World Precision Instruments, Inc. NANOFIL Hamilton syringe
plasmid CAG-EGFP reagent Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml
Pulse generator CUY21Vivo-SQ equipment BEX CUY21Vivo-SQ
Schiller electrode gel reagent Schiller AG 2.158000 Conductive gel
Small animal stereotaxic instrument equipment David Kopf Instruments 900
St–lting mouse and neonatal rat adaptor equipment Stoelting Co. 51625 Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Student iris scissors, straight 11.5 cm equipment Fine Science Tools 91460-11 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm material Kettenbach 31602 Surgical tampons
UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller equipment World Precision Instruments, Inc. UMP3-1 Microinjector and controller
Univentor 400 Anesthesia Unit equipment Univentor 8323001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
  2. McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
  3. Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
  4. Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
  5. Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
  6. Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
  7. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  8. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  9. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
  10. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  11. Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (2007).
  12. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (2007).
  13. Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
  14. Ashwell, K., Paxinos, G. Atlas of the Developing Rat Nervous System. 3rd edition, Academic Press. (2008).
  15. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6th edition, Academic Press. (2007).

Comments

8 Comments

  1. Is it possible to use this technique with adult rats?

    Reply
    Posted by: mandres@bio.puc.cl m.
    September 22, 2010 - 5:47 PM
  2. We tried the method only for rat pups under the age of P8. Also we have found that transfection efficiency (or at least expression efficiency) decreased when we use P5-P8 pups.
    Another factor that should be kept in mind - recovery after electroporation. It means that the brain, as neuronal network, is a kind of electrical nework and if apply electrical shock on mature network consequences might be too critical.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 27, 2010 - 9:17 AM
  3. How did you connect a glass pipette with the syringe? I bought WPI nanofil but its bore did not fit with 1.²mm glass pipette. Is there an adopter to connect them?

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 3:12 AM
  4. We unscrewed a metal fixation cap from WPI's nanofil and also remove a rubber gasket. Then we reamed bores in cap and gasket with 1,3 mm drill and made a chamfer on the front side of the cap using ²,5 mm drill (like on original nanofil but bigger). Then the syringe was assembled. Regarding adaptors, I did not hear about such things for nanofil.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:08 AM
  5. Thank you very much for detailed information.

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 8:36 AM
  6. There are some new features for the method that we introduced after the paper was accepted and I think they will be very helpful:
    1. We now use 5% glycerol (in addition to all other listed components) in injection mix. That improves localization of transfected cells and prevents solution sticking to micropipette tip during manipulations.
    ². For better localization of transfected cells we leave the pipette inside the injection site after injection and during all electroporation cycles. Afterwards, the pipette must be removed slowly.
    3. For labeling of drilling position on skull surface we use ²-3 nl of injection mix now, thus having a tiny dot allows more precise targeting.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:09 AM
  7. Nice method! Do you think it can be implemented in mice?
    Also, what is the transfection efficiency? Is it reproducible?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2011 - 11:24 AM
  8. Thank you for your interest and questions.
    I think it can be implemented in mice as well, you just need to mention that the field intensity should be around 100-1²0 V/cm.
    Transfection effeciency is not very high comparing with viral transduction: if you will inject 100 nl of plasmid (4-6 kb) in concentration 3 micrograms/microliter (total amount 300 ng of DNA) there will be 50-²00 transfected cells. Thus estimated transfection effeciency is around 1 cell per ² ng of DNA. Transfection effeciency is also dependent on brain area and promoter used.
    The method is reproducible if you use the same conditions all the time. My advice is to do firstly several pilot transfections to determine an optimal injection volume, speed and coordinates for your personal case, thus you can get better reproducibility for the method.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 12, 2011 - 10:28 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics