Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação

Neuroscience

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Summary

Este protocolo descreve um método não-viral de entrega de construções genéticas para uma determinada área do cérebro de roedores vivos. O método consiste na preparação de plasmídios, fabricação micropipeta, a cirurgia de rato neonatal filhote, microinjeção da construção, e

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Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation. J. Vis. Exp. (43), e2244, doi:10.3791/2244 (2010).

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Abstract

Criação de animais transgênicos é uma abordagem padrão no estudo de funções de um gene de interesse in vivo. No entanto, muitos knockout ou animais transgênicos não são viáveis ​​nos casos em que o gene modificado ou excluído é expressa em todo o organismo. Além disso, uma variedade de mecanismos compensatórios, muitas vezes dificultam a interpretação dos resultados. Os efeitos compensatórios podem ser atenuadas por qualquer tempo a expressão de genes ou limitar a quantidade de células transfectadas.

O método de microinjeção ventricular não-pós-natal e no eletroporação in vivo permite entrega prevista para genes, moléculas de corante siRNA ou diretamente a uma pequena região de interesse no cérebro de roedores recém-nascidos. Em contraste com a técnica convencional de injeção ventricular, este método permite a transfecção de tipos de células não-migratórias. Transfectadas animais por meio do método descrito aqui pode ser usado, por exemplo, por dois fótons de imagem in vivo ou em experimentos eletrofisiológicos em fatias cerebral aguda.

Protocol

1. Introdução

Criação de animais transgênicos é um poderoso método de investigação das funções dos genes em animais vivos e um mecanismo para desvendar a doença 2,3, bem como para manipular propriedades de células 4. No entanto, o procedimento é bastante trabalhoso, extremamente moroso e caro, portanto, que fundamentam a utilização de métodos alternativos de entrega gene como a injeção viral 5, injeção ventricular neonatal com 6 e eletroporação in utero eletroporação 7,8. O método de injeção ventricular não-pós-natal e eletroporação tem um conjunto exclusivo de vantagens: uso de recursos não-viral construções genéticas; possibilidade de criar um padrão de expressão local na área de interesse, em transfecção in situ de tipos de células não-migratórias, por exemplo, cortical astrócitos.

Neste vídeo, demonstramos o procedimento detalhado da entrega do gene pós-natal para o cérebro de rato neonatal através de um plasmídeo para a proteína verde fluorescente sob maior frango promotor de actina beta com CMV enhancer (pCAG-EGFP) 9. Ilustramos a preparação da solução injectável plasmídeo contendo, fabricação de pipetas de vidro fino e montagem do microinjetor em um instrumento estereotáxico. Então falamos de anestesiar filhotes de ratos com isoflurano, sobre a realização da cirurgia, sobre o procedimento de injeção e sobre o eletroporação usando uma pinça e os eletrodos em porator vivo. Finalmente, discutimos brevemente o antecipado resultados, perspectivas e dificuldades que possam surgir durante essas experiências.

2. Preparação para o plasmídeo Eletroporação

  1. Costumamos preparar 10 ml da solução injectável plasmídeo em uma parede do tubo de 200 mL fina. Esta solução é suficiente para vários experimentos.
  2. Nós misturamos 8 mL da solução de plasmídeo (ver Materiais e equipamentos) com 1 ml da PBS 10X (ver Materiais e equipamentos) e 1 ml de solução 0,1% de água Fast Green (ver Materiais e equipamentos).
  3. A concentração final do plasmídeo na solução injectável deve ser entre 1 e 3 mg / mL. Menores concentrações de DNA plasmídeo irá reduzir a eficiência de transfecção, enquanto a maior concentração de DNA vai ser muito viscoso para injeção através da ponta fina do vidro capilar.

3. Preparação da agulha de vidro

  1. Para a preparação pipeta de vidro, usamos vidro de borosilicato capilar com um filamento (ver Materiais e equipamentos) e um puxador de vidro vertical do eletrodo (ver Materiais e equipamentos) no máximo puxando e aquecimento parâmetros.
  2. Em seguida, quebrar a ponta da pipeta usando um pedaço de papel para conseguir uma ponta de 10-20 m de diâmetro.
  3. Nós verificamos o diâmetro da ponta ea forma sob a objetiva do microscópio.

4. Microinjetor Montagem

  1. Utilização de um polímero finas capilar (ver Materiais e equipamentos) que preencha cerca de 1 / 3 do volume de 10 ml Hamilton seringa (ver Materiais e equipamentos) com óleo mineral (ver Materiais e equipamentos). Evite bolhas de ar!
  2. Então encher a pipeta de vidro com óleo mineral e inserir a pipeta na seringa Hamilton. Evite bolhas de ar!
  3. A seringa de vidro com pipeta é então fixada na microinjetor conectado a um controlador (ver Materiais e equipamentos).
  4. A configuração microinjeção fixo em um instrumento estereotáxico (ver Materiais e equipamentos) nos permite mergulhar de forma segura a ponta da pipeta de vidro dentro do tubo com a solução de injeção do plasmídeo.
  5. Quando a ponta toca a superfície da solução, mergulhá-lo ainda mais milímetros por 1 ou 2 e encher a pipeta com cerca de 1 ml da mistura de injeção usando o micro controlador de injetor.

5. Anestesiar animais

Todos os procedimentos aqui apresentados foram realizados de acordo com a Universidade de Helsinki regulamentação para experimentos com animais.

  1. Para cada experimento, encher uma seringa à prova de gás (ver Materiais e equipamentos), com aproximadamente 2 ml de isoflurano (ver Materiais e equipamentos).
  2. Do que a seringa é fixa na unidade de anestesia (ver Materiais e equipamentos) conectado à fonte de fluxo de ar, a caixa de animais e fixa a máscara sobre a configuração estereotáxica.
  3. Na unidade de anestesia, que ajustar o fluxo de ar para aproximadamente 250 ml / min eo nível de isoflurano para 4%.
  4. Nós colocamos o rato filhote na caixa de origem animal por 2-5 minutos.
  5. Quando o pára filhote em movimento, coloque-a sobre a almofada de aquecimento (ver Materiais e equipamentos) ligados à configuração estereotáxica.
  6. Coloque uma parte rostral do filhote de cachorro da cabeça para a máscara anestesiar.
  7. Ele leva de 5 a 10 minutos para ofilhote de cachorro para entrar na anestesia profunda.
  8. Verifique profundidade da anestesia com uma pitada de cauda e diminuir o fluxo de isoflurano para cerca de 1,5 a 2,0%.

6. Microinjeção cirurgia, e Eletroporação

  1. Tratar a pele do filhote de cachorro da cabeça com o etanol 70%.
  2. Com uma tesoura pequena (ver Materiais e equipamentos) e uma pinça fina (ver Materiais e equipamentos), cortar a pele de um scruff do filhote de cachorro para sua testa.
  3. Dobrar pedaços de pele para os lados e puxe bares ouvido ligeiramente em orifícios aural do crânio para a cabeça e fixação da pele.
  4. Usando um microscópio binocular, localizamos o ponto bregma no crânio.
  5. Identificar a região de interesse usando as coordenadas estereotáxicas.
  6. Posição da pipeta de injeção acima desta região e marcá-lo, largando 25-50 nl da solução injectável sobre a superfície do crânio.
  7. Perfurar o crânio delicadamente e com cuidado no ponto marcado com uma broca cirúrgica de alta velocidade (ver Materiais e equipamentos), sob o microscópio até que o líquido aparece na área perfurada.
  8. Fix forceps uma electropotation eletrodos (ver Materiais e equipamentos) nas laterais do crânio com gel condutor de corrente (ver Materiais e equipamentos) para conseguir uma melhor condutividade.
  9. Remova a queda líquido do furo usando absorvente interno pequeno (ver Materiais e equipamentos) e mergulho da agulha de vidro para o buraco de acordo com as coordenadas do local da injeção.
  10. Infundir 25-100 nl da solução injectável, à taxa de 5 a 20 nl / sec.
  11. Remover rapidamente a pipeta e electroporate imediatamente. Eletroporação é feito através da aplicação de cinco pulsos retângulo com a duração de 50 ms e amplitude de 99 V na freqüência de 1 Hz.
  12. Retire os eléctrodos e bares orelha.
  13. Costurar a pele cortada com uma combinação de um fórceps mudos (ver Materiais e equipamentos) e afiados e fios cirúrgicos (ver Materiais e equipamentos).
  14. Coloque o filhote na câmara quente por 15-30 minutos para ajudar sua recuperação após a anestesia.
  15. Em seguida, coloque as costas filhote gaiola de sua mãe.

7. Resultados representante

A expressão do transgene em células transfectadas com sucesso irá aparecer aproximadamente 10 horas após a eletroporação, e vai permanecer estável por várias semanas.

Nós microinjeção o plasmídeo ou em camadas corticais profundas ou região do striatum dia pós-natal 2 (P2) filhotes de ratos Wistar e realizado em eletroporação in vivo como descrito acima. Fatias de cérebro (400 m de espessura) foram cortados após 2 a 6 dias (P4-P8), utilizando um vibrotome em meio corte a frio (Hepes buffered Earle Solução salina balanceada) 10. Aquisição de imagens foi realizada utilizando Zeiss Axioplan 2 LSM5 Pascal microscópio confocal (Zeiss, Alemanha) no meio de corte em temperatura ambiente.

Os locais de injecção em profundidade as camadas cortical e striatum continha muitas células transfectadas expressando EGFP que foram localizados em uma região compacta de cerca de 200-300 m de diâmetro (Figura 1A, B). Dentro das células transfectadas, o nível de expressão EGFP é suficientemente alta para permitir imagem de thin processos celulares (Figura 1C), incluindo dendrites com espinhos de diferentes formas (Figura 1D) e feixes de axônios (Figura 1E). A estabilidade robusta de EGFP, bem como a viabilidade das células após a eletroporação permitido rastreamento partes distais dos axônios (até 1,5-2 mm de corpos celulares), tais como terminais cortical (Figura 1F).

Figura 1
Figura 1. (A) com sucesso células transfectadas na região striatum de P4 cérebro de rato delinear o local da injeção do plasmídeo. (B) células Transfectados em profundas camadas cortical (aproximadamente 1000 M abaixo da superfície cortical) de P5 cérebro de rato. (C) A célula transfectadas na região do striatum P8 cérebro de rato. (D) os processos de uma célula dendríticas transfectadas na região do estriado cerebral de ratos P8; setas indicam diferentes tipos de espinhas dendríticas e filopodia. (E) Os axônios das células transfectadas dentro via colateral. (F) Os axônios que terminam no superfície pial de P8 rato córtex (cabeça de seta). Barras de escala são 100 mm em A, B, E e F, 10 M em C e D.

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Discussion

Métodos de entrega de gene no cérebro de roedores vivos estão bem estabelecidos no utero eletroporação 7,8,11,12 e, mais recentemente, por eletroporação pós-natal 6. No entanto, esses métodos são baseados em injeção intraventricular do DNA plasmídeo, que pode ser limitante para diversas aplicações. Por exemplo, estes métodos não permitem a segmentação células em certas áreas do cérebro, como hipocampo, nem a transfecção de tais tipos de células não-migratórias como astrócitos corticais. Ventricular não-injeção juntamente com eletroporação foi usado pela primeira vez para a entrega do gene em neurônios do cerebelo 13. Nosso protocolo ilustra a extensão da não-ventricular método para outras regiões do cérebro do rato. Propomos que a nossa abordagem metodológica é uma alternativa útil aos métodos de entrega gene viral em áreas restritas de interesse dentro do cérebro de ratos pós-natal 5.

Apesar das vantagens do presente método, algumas dificuldades podem ser esperados como discutido abaixo.

1.Optimal idade do animal

Quando possível, filhotes de ratos mais jovens neonatal deve ser usado, como um meio para aumentar a eficácia de transfecção e sobrevivência das crias após a cirurgia. Em nossas mãos, o P0 filhotes são muito pequenos, pois é difícil atingir reproducibly uma determinada área do cérebro usando estereotáxica coordenadas obtidas a partir do atlas do cérebro disponíveis para este 14 anos. Além disso, os filhotes têm P0 pele fina e macia que possa impedir de costura. O P3 e P4 são mais conveniente em termos de manipulações cirúrgicas e estereotáxica em relação ao P0-P2 animais, mas eles têm hipersensibilidade a anestesia com isoflurano que podem causar convulsões e interrupções de respiração durante a cirurgia. Assim, a melhor opção é P1-P2 filhotes de ratos que são previsíveis durante a cirurgia e grande o suficiente para microinjeções reprodutível.

Problemas com 2.Possible microinjeção

Quando pequenos volumes de solução (25-100 nl) são injetados através de ponta fina de vidro para o tecido cerebral exerce uma pressão adversária, é fundamental que as bolhas de ar ou vazamentos são cuidadosamente evitados. Não evitar estes podem causar uma diminuição drástica na eficiência de transfecção.

Limites 3.Precision de coordenadas estereotáxicas

Apesar da precisão das coordenadas estereotáxicas, eles têm um limite de 0,3 reprodutibilidade de 15 mm. Em nossa experiência com animais da mesma idade e peso, é possível diminuir este limite para 0,2-0,1 mm, que é suficiente para alvejar reprodutível da área CA1 do hipocampo.

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Acknowledgements

Agradecemos a Ekaterina Karelina ajuda com gravação de trilha sonora para o vídeo, Ivan Molotkov para animação 3D e Dr. Peter Blaesse para CAG-EGFP preparação plasmídeo.

O trabalho foi suportado por concessões do Centro de Mobilidade Internacional da Finlândia, da Fundação Cultural da Finlândia e da Academia da Finlândia.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
2A-sa dumb Tweezers, 115mm equipment XYtronic XY-2A-SA Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad equipment Supertech TMP-5b
Borosilicate tube with filament material Sutter Instrument Co. BF120-69-10 Glass needle
Disposable drills material Meisinger HP 310 104 001 001 008
Dulbeco’s PBS 10X reagent Sigma-Aldrich D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm equipment Fine Science Tools 91150-20 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Ealing micr–lectrode puller equipment Ealing 50-2013 Vertical electrode glass puller
Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c material Johnson & Johnson EH7177H Surgical threads
Exmire micro syringe 10.0 ml equipment Exmire MS*GLLX00 Gas-tight syringe
Fast Green reagent Sigma-Aldrich F7252
Forceps electrodes equipment BEX LF650P3 Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use
Foredom drill control equipment Foredom FM3545 Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Foredom micro motor handpiece equipment Foredom MH-145 Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Gas anesthesia platform for mice equipment Stoelting Co. 50264 Assembled on stereotaxic instrument
Isoflurane reagent Baxter Internationl Inc. FDG9623
Micro dressing forceps, 105 mm equipment Aesculap BD302R Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Microfil material World Precision Instruments, Inc. MF34G-5 Micro syringe filling capillaries
Mineral oil reagent Sigma-Aldrich M8410
NanoFil Syringe 10 microliter equipment World Precision Instruments, Inc. NANOFIL Hamilton syringe
plasmid CAG-EGFP reagent Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml
Pulse generator CUY21Vivo-SQ equipment BEX CUY21Vivo-SQ
Schiller electrode gel reagent Schiller AG 2.158000 Conductive gel
Small animal stereotaxic instrument equipment David Kopf Instruments 900
St–lting mouse and neonatal rat adaptor equipment Stoelting Co. 51625 Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Student iris scissors, straight 11.5 cm equipment Fine Science Tools 91460-11 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm material Kettenbach 31602 Surgical tampons
UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller equipment World Precision Instruments, Inc. UMP3-1 Microinjector and controller
Univentor 400 Anesthesia Unit equipment Univentor 8323001

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References

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Comments

8 Comments

  1. Is it possible to use this technique with adult rats?

    Reply
    Posted by: mandres@bio.puc.cl m.
    September 22, 2010 - 5:47 PM
  2. We tried the method only for rat pups under the age of P8. Also we have found that transfection efficiency (or at least expression efficiency) decreased when we use P5-P8 pups.
    Another factor that should be kept in mind - recovery after electroporation. It means that the brain, as neuronal network, is a kind of electrical nework and if apply electrical shock on mature network consequences might be too critical.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 27, 2010 - 9:17 AM
  3. How did you connect a glass pipette with the syringe? I bought WPI nanofil but its bore did not fit with 1.²mm glass pipette. Is there an adopter to connect them?

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 3:12 AM
  4. We unscrewed a metal fixation cap from WPI's nanofil and also remove a rubber gasket. Then we reamed bores in cap and gasket with 1,3 mm drill and made a chamfer on the front side of the cap using ²,5 mm drill (like on original nanofil but bigger). Then the syringe was assembled. Regarding adaptors, I did not hear about such things for nanofil.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:08 AM
  5. Thank you very much for detailed information.

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 8:36 AM
  6. There are some new features for the method that we introduced after the paper was accepted and I think they will be very helpful:
    1. We now use 5% glycerol (in addition to all other listed components) in injection mix. That improves localization of transfected cells and prevents solution sticking to micropipette tip during manipulations.
    ². For better localization of transfected cells we leave the pipette inside the injection site after injection and during all electroporation cycles. Afterwards, the pipette must be removed slowly.
    3. For labeling of drilling position on skull surface we use ²-3 nl of injection mix now, thus having a tiny dot allows more precise targeting.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:09 AM
  7. Nice method! Do you think it can be implemented in mice?
    Also, what is the transfection efficiency? Is it reproducible?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2011 - 11:24 AM
  8. Thank you for your interest and questions.
    I think it can be implemented in mice as well, you just need to mention that the field intensity should be around 100-1²0 V/cm.
    Transfection effeciency is not very high comparing with viral transduction: if you will inject 100 nl of plasmid (4-6 kb) in concentration 3 micrograms/microliter (total amount 300 ng of DNA) there will be 50-²00 transfected cells. Thus estimated transfection effeciency is around 1 cell per ² ng of DNA. Transfection effeciency is also dependent on brain area and promoter used.
    The method is reproducible if you use the same conditions all the time. My advice is to do firstly several pilot transfections to determine an optimal injection volume, speed and coordinates for your personal case, thus you can get better reproducibility for the method.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 12, 2011 - 10:28 AM

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