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Livraison de gènes au cerveau de rat postnatal par des non-ventriculaire injection Plasmide et électroporation

Neuroscience

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Summary

Ce protocole décrit une méthode non virale de la livraison des constructions génétiques à une certaine zone du cerveau de rongeur vivant. La méthode consiste à la préparation de plasmides, de fabrication micropipette, la chirurgie néonatale chez le rat nouveau-nés, la microinjection de la construction, et

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Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation. J. Vis. Exp. (43), e2244, doi:10.3791/2244 (2010).

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Abstract

Création d'animaux transgéniques est une approche standard dans l'étude de fonctions d'un gène d'intérêt in vivo. Toutefois, de nombreux KO ou des animaux transgéniques ne sont pas viables dans les cas où le gène modifié qui est exprimé ou supprimés dans l'organisme entier. Par ailleurs, une variété de mécanismes compensatoires font qu'il est souvent difficile d'interpréter les résultats. Les effets compensatoires peuvent être atténuées par le calendrier soit l'expression du gène ou de limiter la quantité de cellules transfectées.

La méthode de non-ventriculaire postnatale microinjection et électroporation in vivo permet l'administration ciblée de gènes, siRNA ou des molécules de colorant directement à une petite région d'intérêt dans le cerveau de rongeurs nouveau-né. Contrairement à la technique du ventricule injection classique, cette méthode permet la transfection de types de cellules non-migrateurs. Animaux transfectées au moyen de la méthode décrite ici peut être utilisé, par exemple, pour deux photons en imagerie in vivo ou dans des expériences électrophysiologiques sur tranches de cerveau aigu.

Protocol

1. Présentation

Création d'animaux transgéniques est une méthode puissante d'investigation des fonctions des gènes chez les animaux vivants et pour une maladie de mécanisme de démêler 2,3 ainsi que pour la manipulation des propriétés des cellules 4. Toutefois, la procédure est assez laborieuse, extrêmement longue et coûteuse, ce qui justifie l'utilisation de méthodes alternatives de livraison de gènes viraux tels que l'injection 5, injection ventriculaire néonatale avec électroporation in utero 6 et 7,8 électroporation. La méthode de non-ventriculaire postnatale injection et électroporation a un ensemble unique d'avantages: l'utilisation des non-viraux constructions génétiques; possibilité de créer un profil d'expression locale dans la zone d'intérêt, dans la transfection in situ de types de cellules non-migrateurs, par exemple corticale astrocytes.

Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure détaillée de la livraison de gènes dans le cerveau post-natal chez le rat nouveau-né en utilisant un plasmide codant pour la protéine fluorescente verte améliorée par un promoteur de l'actine de poulet bêta avec CMV Enhancer (pCAG-EGFP) 9. Nous illustrons la préparation de la solution injectable contenant le plasmide, la fabrication de pipettes en verre mince et de montage de l'microinjecteur sur un instrument stéréotaxique. Puis on parle de anesthésiant ratons avec l'isoflurane, sur l'exécution de la chirurgie, au sujet de la procédure d'injection et sur ​​les électroporation en utilisant des électrodes et les pinces de porator vivo. Enfin, nous examinons brièvement les résultats anticipés, des perspectives et des difficultés qui peuvent surgir lors de ces expériences.

2. Préparation de plasmide pour l'électroporation

  1. Nous préparent généralement 10 pl de la solution injectable dans un plasmide de 200 ul paroi du tube mince. Cette solution est suffisante pour plusieurs expériences.
  2. Nous mélangeons 8 ul de la solution de plasmide (voir Matériel et équipement) avec 1 pl de la PBS 10X (voir Matériel et équipement) et 1 ul de 0,1% de solution d'eau vert rapide (voir Matériel et équipement).
  3. La concentration finale du plasmide dans la solution injectable doit être comprise entre 1 et 3 pg / pl. Des concentrations plus faibles d'ADN plasmidique permettra de réduire l'efficacité de transfection, tandis que la concentration élevée d'ADN seront trop visqueux pour être injecté à travers la pointe fine du verre capillaire.

3. Préparation aiguille de verre

  1. Pour la préparation pipette en verre, nous utilisons verre borosilicate capillaire avec un filament (voir Matériel et équipement) et un extracteur électrode verticale en verre (voir Matériel et équipement) sur un maximum de traction et de chauffage des paramètres.
  2. Nous avons ensuite briser la pointe de la pipette à l'aide d'un morceau de papier pour atteindre une pointe de 10 à 20 um de diamètre.
  3. Nous vérifions la diamètre de la pointe et la forme sous l'objectif du microscope.

4. Microinjecteur Assemblage

  1. L'utilisation d'un mince de polymère capillaire (voir Matériel et équipement), nous remplissons environ 1 / 3 du volume d'une seringue de 10 ul de Hamilton (voir Matériels et équipements) avec de l'huile minérale (voir Matériel et équipement). Eviter les bulles d'air!
  2. Ensuite, nous remplir la pipette en verre avec de l'huile minérale et d'insérer la pipette dans la seringue Hamilton. Eviter les bulles d'air!
  3. La seringue en verre pipette est ensuite fixé sur le microinjecteur connecté à un contrôleur (voir Matériel et équipement).
  4. La configuration microinjection fixé sur un instrument stéréotaxique (voir Matériel et équipement) nous permet en toute sécurité Immerger l'embout de la pipette en verre dans le tube avec la solution injectable de plasmide.
  5. Lorsque la pointe touche la surface de la solution, Dip It mm plus de 1 ou 2 et de remplir la pipette avec environ 1 ul du mélange par injection en utilisant les micro-injecteur contrôleur.

5. Animaux anesthésiant

Toutes les procédures présentées ici ont été effectués selon les règlements de l'Université de Helsinki pour les expérimentations animales.

  1. Pour chaque expérience, nous remplissons une seringue étanche au gaz (voir Matériels et équipements) avec environ 2 ml de l'isoflurane (voir Matériel et équipement).
  2. Que la seringue est fixée sur l'appareil d'anesthésie (voir Matériel et équipement) connecté à la source de flux d'air, la cage et le masque fixé sur l'installation stéréotaxique.
  3. Sur l'unité d'anesthésie, nous ajustons le flux d'air à environ 250 ml / min et le niveau de l'isoflurane à 4%.
  4. Nous plaçons le raton dans la case des animaux pendant 2-5 minutes.
  5. Quand le chiot cesse en mouvement, il place sur le coussin chauffant (voir Matériel et équipement) attaché à la configuration stéréotaxique.
  6. Placer une partie rostrale de la tête du chiot dans le masque anesthésiant.
  7. Il faut de 5 à 10 minutes pour lechiot à entrer dans le anesthésie profonde.
  8. Vérifiez profondeur d'anesthésie avec un pincement de la queue et la diminution de l'afflux d'isoflurane à environ 1,5 à 2,0%.

6. La chirurgie, la microinjection et électroporation

  1. Traiter la peau sur la tête de chiot avec l'éthanol à 70%.
  2. L'utilisation de petits ciseaux (voir Matériel et équipement) et des pinces fines (voir Matériel et équipement), coupez la peau d'une peau du chiot à son front.
  3. Bend morceaux de peau sur le côté et tirez légèrement l'oreille barres dans les orifices auditifs du crâne de la tête et la fixation de peau.
  4. L'utilisation d'un microscope binoculaire, nous localiser le point bregma sur le crâne.
  5. Identifier la région d'intérêt en utilisant les coordonnées stéréotaxiques.
  6. Position de la pipette d'injection-dessus de cette région et le marquer par la chute de 25 à 50 nl de la solution injectable sur la surface du crâne.
  7. Percer le crâne doucement et soigneusement au point marqué à l'aide d'une perceuse à haute vitesse chirurgicale (voir Matériel et équipement), sous le microscope jusqu'à ce liquide apparaît dans la zone forée.
  8. Fixer une pince électroporation électrodes (voir Matériel et équipement) sur les côtés du crâne avec un gel conducteur de courant (voir Matériel et équipement) pour assurer une meilleure conductivité.
  9. Retirez la goutte de liquide par le trou percé à l'aide de tampons de petite taille (voir Matériel et équipement) et trempette l'aiguille de verre pour le trou selon les coordonnées du site d'injection.
  10. Faire infuser 25 à 100 nl de la solution injectable au taux de 5 à 20 nl / sec.
  11. Enlever rapidement la pipette et électroporation immédiatement. L'électroporation est effectuée en appliquant cinq impulsions rectangle avec la durée de 50 ms et d'amplitude de 99 V à la fréquence de 1 Hz.
  12. Retirer les électrodes et les barres d'oreille.
  13. Coudre la peau coupée en utilisant une combinaison d'une pince-muets (voir Matériel et équipement) et tranchants et les fils chirurgicaux (voir Matériel et équipement).
  14. Placer le chiot dans la chambre chaude pendant 15-30 minutes à l'aide de sa récupération après l'anesthésie.
  15. Puis remettre le chiot à la cage de sa mère.

7. Les résultats représentatifs

L'expression du transgène dans les cellules transfectées avec succès apparaîtra environ 10 heures après l'électroporation, et elle restera stable pendant plusieurs semaines.

Nous microinjectés le plasmide soit dans de profondes couches corticales ou de la région du striatum jour postnatal 2 (P2) ratons Wistar et exécuté dans l'électroporation in vivo comme décrit ci-dessus. Tranches de cerveau (400 um d'épaisseur) ont été coupées au bout de 2 à 6 jours (P4-P8) en utilisant un vibrotome en milieu de tranchage à froid (Hepes tamponné Solution saline équilibrée de Earle) 10. L'acquisition des images a été réalisée à l'aide Zeiss Axioplan 2 LSM5 Pascal microscope confocal (Zeiss, Allemagne) dans le milieu de tranchage à la température ambiante.

Les sites d'injection dans les couches profondes du cortex et le striatum contient de nombreuses cellules transfectées exprimant l'EGFP qui étaient situés dans une région compacte d'environ 200 à 300 um de diamètre (figure 1A, B). Dans les cellules transfectées, le niveau d'expression EGFP est suffisamment élevé pour permettre l'imagerie des processus cellulaires minces (figure 1C), y compris les dendrites avec des épines de formes différentes (figure 1D) et les faisceaux des axones (figure 1E). La stabilité robuste de EGFP ainsi que la viabilité des cellules après l'électroporation a permis le traçage parties distales des axones (jusqu'à 1,5 à 2 mm du corps cellulaire) tels que les terminaux corticale (figure 1F).

Figure 1
La figure 1 (A). Succès des cellules transfectées dans la région de striatum de cerveau de rat P4 délimitant le site d'injection de plasmide. (B) Les cellules transfectées dans les couches corticales profondes (environ 1000 um dessous de la surface corticale) du cerveau de rat P5. (C) une cellule transfectée dans la région de striatum de cerveau de rat P8. (D) des processus dendritiques d'une cellule transfectée dans la région de striatum de cerveau de rat P8; flèches indiquent les différents types d'épines dendritiques et filopodes. (E) Les axones des cellules transfectées sein voie collatérale. (F) Les axones se terminant à la surface de la pie-mère P8 cortex de rat (flèche). Barres d'échelle sont de 100 um sur A, B, E et F; 10 um sur les C et D.

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Discussion

Les méthodes de livraison de gènes dans le cerveau de rongeurs vivants sont bien établies pour l'électroporation in utero 7,8,11,12 et, plus récemment, par électroporation postnatale 6. Cependant, ces méthodes sont basées sur l'injection intraventriculaire de l'ADN plasmidique, qui peut être limitant pour plusieurs applications. Par exemple, ces méthodes ne permettent pas de cibler des cellules dans certaines régions du cerveau telles que l'hippocampe, ni la transfection de ces types de cellules non-migratoires comme les astrocytes corticaux. Non-ventriculaire d'injection couplé avec l'électroporation a été utilisée pour la livraison de gènes dans les neurones du cervelet 13. Notre protocole illustre l'extension de la non-ventriculaire méthode pour d'autres régions du cerveau de rat. Nous proposons que notre approche méthodologique est une alternative utile à des méthodes de livraison de gènes viraux aux zones réglementées d'intérêt au sein de cerveau de rat postnatale 5.

Malgré les avantages de la méthode actuelle, certaines difficultés peuvent être attendus comme discuté ci-dessous.

L'âge de l'animal 1.Optimal

Lorsque c'est possible, les jeunes ratons nouveau-nés doivent être utiliser, comme moyen d'augmenter l'efficacité de transfection et la survie des petits à la fois après la chirurgie. Dans nos mains, la P0 chiots sont trop petits car il est difficile de cibler de manière reproductible une certaine zone du cerveau en utilisant stéréotaxique coordonnées obtenues à partir de l'atlas du cerveau disponible pour cet âge de 14 ans. En outre, les chiots ont P0 peau fine et tendre qui peuvent nuire à la couture. Le P3 et P4 sont plus pratique en termes de manipulations chirurgicales et stéréotaxique par rapport à P0-P2 animaux, mais ils ont une hypersensibilité à l'isoflurane qui peut provoquer des convulsions et des interruptions de la respiration pendant la chirurgie. Ainsi, la meilleure option est ratons P1-P2 qui sont prévisibles pendant la chirurgie et assez grand pour microinjections reproductibles.

Problèmes 2.Possible avec microinjection

Lorsque les petits volumes de solution (25-100 nl) sont injectés à travers la pointe de verre mince pour les tissus du cerveau exerce une pression adverse, il est essentiel que les bulles d'air ou des fuites sont soigneusement évités. Le défaut pour éviter ceux-ci peuvent causer une diminution spectaculaire de l'efficacité de la transfection.

Limites pour les 3.Precision coordonnées stéréotaxiques

Malgré la précision des coordonnées stéréotaxiques, ils ont une limite à 0,3 reproductibilité de 15 mm. Dans notre expérience dans l'utilisation des animaux du même âge et du poids, il est possible de diminuer cette limite de 0.2 à 0.1 mm d', qui est suffisante pour cibler reproductible de la région CA1 hippocampique.

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Acknowledgements

Nous remercions Ekaterina Karelina de l'aide pour l'enregistrement bande son pour la vidéo, Ivan Molotkov d'animation 3D et le Dr Peter Blaesse d'ACG-EGFP préparation de plasmide.

Le travail a été soutenu par des subventions du Centre de mobilité internationale de la Finlande, le finnois Fondation culturelle et l'Académie de Finlande.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
2A-sa dumb Tweezers, 115mm equipment XYtronic XY-2A-SA Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad equipment Supertech TMP-5b
Borosilicate tube with filament material Sutter Instrument Co. BF120-69-10 Glass needle
Disposable drills material Meisinger HP 310 104 001 001 008
Dulbeco’s PBS 10X reagent Sigma-Aldrich D1408
Dumont #5 forceps, 110 mm equipment Fine Science Tools 91150-20 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Ealing micr–lectrode puller equipment Ealing 50-2013 Vertical electrode glass puller
Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c material Johnson & Johnson EH7177H Surgical threads
Exmire micro syringe 10.0 ml equipment Exmire MS*GLLX00 Gas-tight syringe
Fast Green reagent Sigma-Aldrich F7252
Forceps electrodes equipment BEX LF650P3 Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use
Foredom drill control equipment Foredom FM3545 Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Foredom micro motor handpiece equipment Foredom MH-145 Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom)
Gas anesthesia platform for mice equipment Stoelting Co. 50264 Assembled on stereotaxic instrument
Isoflurane reagent Baxter Internationl Inc. FDG9623
Micro dressing forceps, 105 mm equipment Aesculap BD302R Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Microfil material World Precision Instruments, Inc. MF34G-5 Micro syringe filling capillaries
Mineral oil reagent Sigma-Aldrich M8410
NanoFil Syringe 10 microliter equipment World Precision Instruments, Inc. NANOFIL Hamilton syringe
plasmid CAG-EGFP reagent Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml
Pulse generator CUY21Vivo-SQ equipment BEX CUY21Vivo-SQ
Schiller electrode gel reagent Schiller AG 2.158000 Conductive gel
Small animal stereotaxic instrument equipment David Kopf Instruments 900
St–lting mouse and neonatal rat adaptor equipment Stoelting Co. 51625 Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Student iris scissors, straight 11.5 cm equipment Fine Science Tools 91460-11 Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations
Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm material Kettenbach 31602 Surgical tampons
UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller equipment World Precision Instruments, Inc. UMP3-1 Microinjector and controller
Univentor 400 Anesthesia Unit equipment Univentor 8323001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  15. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6th edition, Academic Press. (2007).

Comments

8 Comments

  1. Is it possible to use this technique with adult rats?

    Reply
    Posted by: mandres@bio.puc.cl m.
    September 22, 2010 - 5:47 PM
  2. We tried the method only for rat pups under the age of P8. Also we have found that transfection efficiency (or at least expression efficiency) decreased when we use P5-P8 pups.
    Another factor that should be kept in mind - recovery after electroporation. It means that the brain, as neuronal network, is a kind of electrical nework and if apply electrical shock on mature network consequences might be too critical.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 27, 2010 - 9:17 AM
  3. How did you connect a glass pipette with the syringe? I bought WPI nanofil but its bore did not fit with 1.²mm glass pipette. Is there an adopter to connect them?

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 3:12 AM
  4. We unscrewed a metal fixation cap from WPI's nanofil and also remove a rubber gasket. Then we reamed bores in cap and gasket with 1,3 mm drill and made a chamfer on the front side of the cap using ²,5 mm drill (like on original nanofil but bigger). Then the syringe was assembled. Regarding adaptors, I did not hear about such things for nanofil.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:08 AM
  5. Thank you very much for detailed information.

    Reply
    Posted by: Sho Y.
    October 13, 2010 - 8:36 AM
  6. There are some new features for the method that we introduced after the paper was accepted and I think they will be very helpful:
    1. We now use 5% glycerol (in addition to all other listed components) in injection mix. That improves localization of transfected cells and prevents solution sticking to micropipette tip during manipulations.
    ². For better localization of transfected cells we leave the pipette inside the injection site after injection and during all electroporation cycles. Afterwards, the pipette must be removed slowly.
    3. For labeling of drilling position on skull surface we use ²-3 nl of injection mix now, thus having a tiny dot allows more precise targeting.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2010 - 8:09 AM
  7. Nice method! Do you think it can be implemented in mice?
    Also, what is the transfection efficiency? Is it reproducible?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 8, 2011 - 11:24 AM
  8. Thank you for your interest and questions.
    I think it can be implemented in mice as well, you just need to mention that the field intensity should be around 100-1²0 V/cm.
    Transfection effeciency is not very high comparing with viral transduction: if you will inject 100 nl of plasmid (4-6 kb) in concentration 3 micrograms/microliter (total amount 300 ng of DNA) there will be 50-²00 transfected cells. Thus estimated transfection effeciency is around 1 cell per ² ng of DNA. Transfection effeciency is also dependent on brain area and promoter used.
    The method is reproducible if you use the same conditions all the time. My advice is to do firstly several pilot transfections to determine an optimal injection volume, speed and coordinates for your personal case, thus you can get better reproducibility for the method.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 12, 2011 - 10:28 AM

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