Veranderingen in de borstklier Morfologie en het risico op borstkanker bij ratten

Biology
 

Summary

Ons protocol wordt beschreven hoe u de rat buik borstklier ontleden en hoe de borstklier hele mounts voor te bereiden. Het beschrijft ook hoe borstklier morfologie met behulp van drie eindpunten (aantal terminale einde knoppen, epitheliale rek en differentiatie) te analyseren en om deze resultaten te gebruiken om borstkanker het risico te voorspellen bij ratten die werden blootgesteld aan de voeding wijzigingen

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

de Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260, doi:10.3791/2260 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Studies in knaagdiermodellen van borstkanker tonen aan dat blootstelling aan de voeding / hormonale factoren bij de in utero en puberteitsstadium perioden, waarin de borstklier uitgebreide modellering en re-modellering ondergaat, minder gevoelig maken voor carcinogeen-geïnduceerde borsttumoren. Soortgelijke bevindingen zijn beschreven in de mens: bijvoorbeeld, een hoog geboortegewicht verhoogt later risico op het ontwikkelen van borstkanker, en de inname van soja tijdens de kinderjaren verlaagt het risico op borstkanker. Het is gedacht dat deze pre-en postnatale dieet wijzigingen blijvende morfologische veranderingen in de uier die op hun beurt te wijzigen het risico op borstkanker op latere leeftijd induceren. Deze morfologische veranderingen die reflecteren epigenetische modificaties, zoals veranderingen in de DNA-methylatie, histonen en miRNA expressie die vervolgens van invloed zijn gentranscriptie. In dit artikel beschrijven we hoe veranderingen in borstklieren morfologie kan borstklier het risico op kanker te voorspellen bij ratten. Ons protocol beschrijft specifiek hoe om te ontleden en te verwijderen van de rat buik borstklier en hoe de borstklier hele mounts voor te bereiden. Het beschrijft ook hoe borstklier morfologie te analyseren op basis van drie end-points (aantal terminale einde knoppen, epitheliale rek en differentiatie) en om de gegevens te gebruiken om het risico van het ontwikkelen van borstkanker te voorspellen.

Protocol

1. Verwijdering van de buik borstklier en de opstelling van een hele berg

  1. Euthanaseren het dier volgens de IACUC richtlijnen. Pin het dier op zijn rug van zijn benen met naalden, of tape de benen op het oppervlak raad van bestuur, en veeg de huid nat met ethanol (EtOH). Til de huid een beetje met een pincet en met scherpe schaar een middellijn incisie in de huid te beginnen tussen de twee # 5 tepels en snijden in de richting van de nek. Maak een omgekeerde Y incisie vanaf de middenlijn richting de achterpoten. Als thoracale borstklieren zijn ook worden verzameld, maken ook een Y incisie vanaf de middellijn tussen de twee # 2 tepels naar de voorpoten.
  2. Ontleden van de huid met een schaar open aan een kant van de omgekeerde Y-incisie aan de buik # 4 borstklier bloot te leggen; de borstklieren zijn bevestigd aan de huid. Pin van de huid met naalden op het oppervlak bord, volledig bloot te leggen van de klier. Werk de ene kant en klier in die tijd.
  3. Ontleden de melkklier, zonder uit de huid hetzij met behulp van scherpe schaar en / of een scalpel, vanaf het proximale gebied dicht bij de tepel en werken aan het distale einde van de klier naar de rug van het dier. (Dit kan enkele minuten duren, vooral bij een oudere rat.)
  4. Onmiddellijk spreiden van de vrijstaande klier op een juiste wijze gelabeld glaasje (gebruik een goede permanent marker pen en / of 'een diamant pen'), en verspreid de klier goed overeenkomt met de oorspronkelijke grootte en vorm in situ. De glasplaatje moet groter zijn dan de klier. Na het verspreiden van de klier op de glijbaan, laat het op de tafel gaan zitten voor een tijdje, zodat de klier stokken op de glijbaan, maar laat het niet droog.
  5. Zet de schuif in een pot met daarin Carnoy's fixatief (75% ijsazijn, 25% absolute ethanol = EtOH), laat het je vast bij kamertemperatuur (RT) in de zuurkast voor 2 dagen of langer. Dia's kunnen ook worden achtergelaten in de fixeermiddel voor een langere periode van tijd.
  6. Was de dia's in 70% EtOH gedurende 1 uur bij RT.
  7. Spoelen in gedestilleerd water gedurende 30 minuten bij RT.
  8. Vlek in Carmine Alum vlek *) voor 2 dagen of langer (tot je ziet dat de lymfeklieren hebben bevlekt door, kijk naar de achterkant van de dia).
  9. Wassen in toenemende reeks van EtOH, 1 uur in elke: 70% -> 95% -> 100%. Na de laatste wasbeurt in absolute EtOH de klieren zetten in xyleen. Laat zitten in de zuurkast in RT althans voor twee dagen. Deze laatste stap is het ruimen van de melkklier betekenis delipidation van het uiervet pad, en de latere toename van de transparantie. Hoe vetter de klier is de langere clearing tijd nodig is.
  10. Mount with cover-slips met behulp van een montage van media zoals Permount. Nou laten we de dia's drogen (enkele dagen) alvorens op te merken onder een stereo-microscoop.
    * Carmine Alum Stain:

    Plaats een g karmijn (Sigma C1022) en 2,5 g aluminium kaliumsulfaat (Sigma A7167) in 500 ml gedestilleerd water en kook ze gedurende 20 minuten. Pas uiteindelijk volume van 500 ml met water. Filter en koelkast. Oplossing kan worden gebruikt voor enkele maanden. Gooi als kleur wordt zwak.

2. Analyse van de borstklier Hele Mount Morfologie

Borstklier hele mounts morfologie wordt geanalyseerd op basis van de volgende eindpunten en de resultaten gecorreleerd met borstkanker risico.

  1. Borstklier whole-mount at PND 21 (pre-puberale leeftijd):
    • Epitheliale groei:
      • Afstand van de tepel tot aan het einde van de epitheliale boom (in millimeters), gemeten met behulp van een liniaal
    • Potentieel voor maligne transformatie:
      • Aantal TEBs (uiteinde knoppen), geteld onder een lichtmicroscoop. TEBs zijn de grootste bolvormige structuren zich pas aan het distale uiteinde van de borstklieren epitheliale boom
    • Differentiatie:
      • AB1 (alveolaire knop) score (0-5). Alveolaire knoppen zijn verspreid over het epitheel.
      • AB2 score (0-5)

    Gehelen mounts worden gescoord onder een lichtmicroscoop. De score waarden van AB1 en AB2 worden toegevoegd voor een laatste differentiatie score.
  2. Borstklier hele-mount verzameld op PND 50 (post-puberale leeftijd):
    • Epitheliale groei:
      • Afstand van de lymfeklieren aan het einde van de epitheliale boom (in millimeters), gemeten met behulp van een liniaal.
      • Afstand tussen het uiteinde van de epitheliale boom aan het einde van vet pad, gemeten met behulp van een liniaal.
    • Potentieel voor maligne transformatie:
      • Aantal TEBs, geteld onder een lichtmicroscoop
    • Differentiatie:
      • AB1 score (0-5)
      • AB2 score (0-5)
      • Melkklieren score (0-5)

    Gehelen mounts worden gescoord onder een lichtmicroscoop. Differentiatie zal worden beoordeelt op twee manieren. Eerst worden de score waarden van AB1, AB2 en lobules toegevoegd voor een laatste differentiatie score. Daarnaast zal de verhouding tussen de melkklieren score en AB1 + AB2 score worden berekend. AB differentiëren naar melkklieren, en hoe hoger de verhouding tussen de melkklieren en ABS, het meer gedifferentieerde de klier is.

3. Palpatie en mammatumor Meting in ratten en correlatie met borstklier Morfologie

  1. Om te beginnen deze procedure, houdt de rat door vast te pakken het hele lichaam met de handpalm over de rug, met wijsvinger achter het hoofd en de duim en de tweede vinger onder het tegenovergestelde oksel. Draai de rat dus het ligt op zijn achterste, en palperen om eventuele borsttumoren op te sporen; voelbare tumoren moeten voelen als een "klomp".
  2. Naast gebruik van een schuifmaat om de breedte, lengte en hoogte van de tumor te meten. Bereken de tumor volume met behulp van de ellipsoïde formule, Volume = 1/6πabc, waar 'een' = breedte 'b' = lengte, en 'c' = hoogte.
  3. Handmatig registreren van de locatie en de grootte van de tumor in een notebook op een wekelijkse basis. Deze gegevens zullen worden overgedragen aan een spreadsheet later.

4. Representatieve resultaten

Zorgvuldige dissectie van het uiervet pad en de verwerking ervan tot wholemount zal beoordeling van de ontwikkeling staat van de borstklier. Wanneer elke stap goed is gedaan, de hele borstklier epitheliale boom is duidelijk zichtbaar in het vet pad, en dit maakt een eenvoudige vaststelling van het aantal TEBs en de berekening van de dichtheid van de alveolaire knoppen en melkklieren. Misstappen bij de voorbereiding van wholemounts kan niet de hele dikke pad, onvoldoende tot vaststelling, en inadequate clearing ontleden.

Beoordeling van de borstklier morfologie zal informatie over het aantal structuren aanwezig zijn die aanleiding kunnen geven tot mammatumoren (TEBs), mate van differentiatie van de epitheliale structuren (alveolaire knoppen en melkklieren), en de mate van groei (ductaal verlenging). Het is belangrijk om TEBs scheiden om uiteinden, de laatste bevinden zich aan het distale uiteinde van het epitheel, vergelijkbaar met TEBs, maar ze zijn kleiner dan TEBs en geen aanleiding geven tot kwaadaardige tumoren. Uiteinden worden ook gezien in de epitheliale boom.

Figuur 1
Figuur 1:. Vertegenwoordiger resultaat van goed voorbereid borstklier hele berg Alle onderdelen van de klier goed zijn ontleed en karmijn kleuring is optimaal.

Figuur 2
Figuur 2:. Vertegenwoordiger gevolg van een slecht voorbereid borstklier ganse berg De klier goed is ontleed (het distale gedeelte van de klier ontbreekt), is niet behoorlijk uitgerekt en delipidation heeft niet volledig plaatsgevonden.

Discussion

Beoordeling van de borstklier morfologische end-points en de groei van de epitheliale boom kan worden gebruikt om te voorspellen of jonge leven dieet manipulaties, of andere manipulaties die veranderen in de baarmoeder of prepuberale hormonale omgeving, later borstkanker het risico te wijzigen. Omdat borstkanker bij de mens is geïnitieerd in borstklieren structuren (terminal ductaal lobulaire eenheden, TDLUs), vergelijkbaar met TEBs bij ratten, kan deze techniek worden gebruikt om het potentieel van het vroege leven blootstelling aan het risico van borstkanker beïnvloeden vast te stellen. Verder, bij vrouwen een hoge mammografische densiteit verhoogt het risico op borstkanker wordt 4-6 vouwen, en de beoordeling van de groei van de mamma-epitheel boom kan worden gebruikt om de factoren die het borstweefsel en de factoren die deze dichtheid verminderen bepalen te identificeren. Voor het verkrijgen van deze informatie moet borstklier volledig worden ontleed, behoorlijk gespannen op een glasplaatje, zodat alle onderdelen kan gevisualiseerd worden onder een microscoop. Daarnaast zal een goede karmijn vlekken en delipidation in xyleen bieden heel mounts die geschikt zijn voor borstkanker risico-evaluatie.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

NCI (U54 CA00100970), NCI (1 R03 CA150040-01), ACS (116602-PF-09-018-01-CNE)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glacial acetic acid Electron Microscopy Sciences AX0073-9 Carnoy’s Fixative
Absolute ethanol The Waner-Graham Co. 64-17-5 Carnoy’s Fixative
Carmine Sigma-Aldrich C1022 Carmine solution
Aluminum potassium sulfate Sigma-Aldrich A7167 Carmine solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasmussen, S. B., Young, L. J. T., Smith, G. H. Preparing mammary gland whole mounts form mice. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. Kluwer Academic / Plenum Publishers. New York. 75-85 (2000).
  2. Consensus statements from Mammary Gland Whole Mount Round Robin meeting. Oakland, CA, (2009).
  3. Hilakivi-Clarke, L., Clarke, R., Onojafe, I., Raygada, M., Cho, E., &, L. ippman, E, M. A maternal diet high in n-6 polyunsaturated fats alters mammary gland development, puberty onset, and breast cancer risk among female rat offspring. Proc Natl Acad Sci. 94, 9372-9377 (1997).
  4. Russo, I. H., Russo, J. Mammary gland neoplasia in long-term rodent studies. Environ. Health Perspect. 104, (9), 938-967 (1996).
  5. Hilakivi-Clarke, L., de Assis, S. Fetal origins of breast cancer. TRENDS in Endocrinol and Metabol. 17, (9), 340-348 (2006).
  6. Hilakivi-Clarke, L. Nutritional modulation of terminal end buds: its relevance to breast cancer prevention. Curr Cancer Drug Targets. 7, (4), 465-474 (2007).
  7. Silva Idos, S., De Stavola, B., Mccormack, V. Collaborative Group On Pre-Natal Risk Factors And Subsequent Risk Of Breast Cancer. Birth size and breast cancer risk: re-analysis of individual participant data from 32 studies. PloS Medicine. 5, e193-e193 (2008).
  8. Warri, A., Saarinen, N. M., Makela, S., Hilakivi-Clarke, L. The role of early life genistein exposures in modifying breast cancer risk. Br J Cancer. 98, 1485-1493 (2008).
  9. Russo, J., Hu, Y. F., Yang, X., Russo, I. H. Developmental, cellular, and molecular basis of human breast cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. 17-37 (2000).
  10. Oza, A. M., Boyd, N. F. Mammographic parenchymal patterns: A marker of breast cancer risk. Epidemiological Reviews. 15, 196-208 (1993).

Comments

3 Comments

  1. Thank you very much

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 1:24 PM
  2. Thank you very much

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 24, 2012 - 1:24 PM
  3. Correction: There is a formulation error in the recipe given for the Carnoy's fixative solution in the protocol section. The correct formulation should be: ²5% glacial acetic acid, 75% absolute ethanol=EtOH. We, the authors, apologize for the error.

    Reply
    Posted by: Sonia d.
    August 23, 2012 - 3:05 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics