Experimentação fisiológicas com o intestino posterior Crayfish: Um Exercício Laboratório de Student

* These authors contributed equally
Neuroscience
 

Summary

Neste relatório, demonstram técnicas que podem ser usados ​​para investigar a biologia do intestino posterior lagostim. Nós mostramos como dissecar um abdômen lagostas e estudar a anatomia associados, fisiologia e modulação da atividade. A atividade peristáltica e força das contrações são medidos através de um transdutor de força.

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Cooper, A. S., Leksrisawat, B., Gilberts, A. B., Mercier, A. J., Cooper, R. L. Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise. J. Vis. Exp. (47), e2324, doi:10.3791/2324 (2011).

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Abstract

O objectivo do relatório é descrever as técnicas de dissecação para a preparação do intestino posterior lagostas e demonstrar como fazer gravações fisiológico com um transdutor de força para controlar a força de contração. Além disso, demonstrar como visualmente monitorar a atividade peristáltica, que pode ser usado como um bioensaio para vários peptídeos, aminas biogênicas e neurotransmissores. Esta preparação é passível de laboratórios de estudante em fisiologia e para demonstrar conceitos farmacológicos para os estudantes. Esta preparação tem sido usado por mais de 100 anos, e ainda oferece muito como modelo para investigar a geração e regulação dos ritmos peristáltica e para descrever os mecanismos subjacentes à sua modulação. Os ensaios farmacológicos e receptor sub digitação que foram iniciados há 50 anos no intestino grosso ainda contribuir para a investigação hoje em dia. Esta preparação robusta é bem adequado para os alunos de formação em fisiologia e farmacologia.

Protocol

1. Introdução

A visão mais recente abrangente do intestino posterior crustáceo foi cumprido em uma dissertação pelo Dr. Barbara E. Musolf (2007, Georgia State University, Atlanta, Georgia, EUA), que concentrou-se principalmente na modulação serotoninérgica e inervação (Musolf et al., 2009 ). Hindguts crustáceo foram primeiramente estudados mais de 100 anos atrás por Alexandrowicz, um pioneiro na anatomia comparativa (Alexandrowicz, 1909), que descreveu os vários aspectos da sua inervação. Pesquisa continuada ao longo dos anos, identificando os tipos de camadas musculares e arquitetura, abordando a função global do intestino grosso na osmorregulação para o animal inteiro, e examinando o controle moduladores da contratilidade hindgut por vários compostos (ver revisão por Musolf, 2007). É interessante notar que a parte anal do intestino posterior age não só para expulsar as fezes, mas também para levar até a água do ambiente para osmorregulação. Esta região do intestino pode sofrer frente ou para trás o peristaltismo, dependendo das necessidades do animal.

Alexandrowicz (1909) identificou dois plexos nervosos que inervam o intestino posterior crustáceo, um plexo interno e um plexo externo, que mais tarde provou ser ricas fontes para a identificação e caracterização de neurotransmissores. Na década de 1950 Dr. Ernst Florey começou uma série de estudos farmacológicos no intestino posterior lagostas e demonstrou que as contrações são modulados pela acetilcolina e seus compostos relacionados e também pela adrenalina e noradrenalina (Florey, 1954). Florey, o descobridor de uma substância inibidora conhecido como "fator-I", estudou os efeitos desta substância em várias preparações, incluindo o sistema GI em lagostas (Florey, 1961). Fator-I foi posteriormente demonstrado ser GABA. Assim, o intestino posterior lagostas desempenhou um papel importante nos estudos iniciais da inibição sináptica.

Após a descoberta do GABA, outros transmissores putativa também foram mostrados para ser associados com os plexos e intestino posterior para provocar respostas fisiológicas. Tais transmissores incluem dopamina (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968.) Proctolin (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) dois peptídeos orcokinin (NFDEIDRSGFGFN e AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000). myosuppressin e um peptídeo (Mercier et al 1997;... pQDLDHVFLRFamide mais provável, cf Stemmler et al 2007). Cada uma destas substâncias modula hindgut contrações espontâneas, e todos, exceto GABA parece ser excitatório. O intestino grosso também responde a glutamato e quisqualato (Jones, 1962;. Errado et al 2003), mas as evidências claras para a inervação glutamatérgica não foi relatado. Mensageiros intracelulares que medeiam os efeitos dos diversos transmissores são em grande parte inexplorado, mas há evidências para o envolvimento de AMPc na capacidade da dopamina para aumentar as contrações (Knotz & Mercier, 1995).

Embora o intestino grosso crustáceos contratos espontaneamente após desnervação, tais contrações são tipicamente fraco e desorganizado (País de Gales, 1982; Winlow & Laverack, 1972a). Movimento peristáltico exige saída do motor coordenado do sistema nervoso central, aparentemente originários do gânglio última abdominal (Winlow & Laverack, 1972a, b, c). Nos lagostins, a saída do motor é transportado para o intestino grosso através da raiz 7 ª abdominal, que contém 75 axônios cujos corpos celulares estão localizados no gânglio última abdominal (Kondoh & Hisada, 1986). Pelo menos alguns dos peptídeos parecem ser fornecido ao plexo hindgut dos neurônios originários da última gânglio abdominal (Dircksen et al 2000;.. Mercier et al, 1991b; Siwicki & Bishop, 1986), mas a dopamina é fornecido pelos neurônios em mais gânglios anterior (Mercier et al. 1991a). Desde a saída do motor através da raiz 7 ª abdominal é necessária para as grandes, as contrações coordenadas, é provável que alguns ou todos os transmissores listados acima suposto contribuir de alguma forma para o peristaltismo. Suas contribuições relativas, no entanto, não são conhecidos. Alguns insights podem ser obtidos através do estudo dos seus efeitos sobre os músculos circulares e longitudinais em separado (Mercier & Lee, 2002).

Além de controlar o movimento de alimento não digerido, o plexo nervoso associado com o crustáceo intestino posterior parece desempenhar um importante função endócrina associada muda. O intestino posterior do caranguejo, Carcinus maenas, contém células endócrinas que liberam hormônio hiperglicêmico crustáceo e sua peptídeo precursor relacionadas durante ecdise (Webster et al. 2000), sugerindo um papel importante na absorção de água e inchaço associado a muda. Assim, o intestino grosso crustáceos, participa em diversos processos fisiológicos importantes.

Este relatório é basicamente uma ferramenta de ensino para o ensino médio avançado e alunos de graduação em cursos de fisiologia que participam na experimentação. O significado, bem como o potencial mecanismo por trás de como os contratos hindgut e funções podem ser abordados pelos alunos. Agentes farmacológicos, os neurotransmissores e neuro-hormônios serão usados, e curvas dose-resposta será construída, que irá envolver os alunos em como adquirir e interpretar os dados fisiológicos e farmacológicos. Um entendimento geral da função do receptor em relação aos agonistas e antagonistas também pode ser alcançado. Os alunos também aprenderão a apresentar os dados em forma gráfica para análise estatística.

É muito fácil para dissecar e registrar as contrações do intestino posterior lagostim. Na preparação dissecado, o intestino é facilmente expostos a substâncias exógenas. A alteração na atividade peristáltica pode ser monitorada visualmente ou com um transdutor de força, o que também pode monitorar a força das contrações. Devido à sua simplicidade e confiabilidade como uma preparação bioensaio, o intestino posterior crustáceo ainda é muito útil para investigar questões muitas pesquisas sobre os mecanismos de peristaltismo, modulação de saída do motor e da contração muscular e função do receptor. O intestino grosso também é útil para testes de inseticidas, crustaceancides e poluentes para os mecanismos específicos de ações.

2. Métodos

2.1) Materiais

  • lagostim
  • lagostas salina
  • instrumentos de dissecção (tesoura grossa e fina, grossa e uma pinça fina)
  • Sylgard de fundo placa de Petri
  • pinos de aço de dissecação
  • copos (para segurar soluções químicas)
  • parafilme (para cobrir a mistura e soluções)

2,2 Dissection)

  1. Lagostim (Procambarus clarkii), medindo 60-10 cm de comprimento do corpo deve ser colocado em gelo por 5 a 10 minutos para anestesiar o animal antes da dissecação começa.
  2. Segure o lagostim anestesiados por trás as garras com uma mão. Rapidamente, corte da tomada de olho no meio da cabeça de ambos os lados, e depois decapitar o lagostim (Nota: o sangue da preparação será pegajoso quando seca, então lave as ferramentas quando concluída).
    Figura 1
    Figura 1: Decapitação de crustáceo
  3. Cortar a chelipeds e pernas andar.
  4. Cortar a tailfins esquerda e direita, deixando apenas o meio tailfin (uropod).
  5. No lado dorsal do crustáceo corte ventralmente, tanto do lado esquerdo e direito da cutícula dorsal.
    Figura 2
    Figura 2: Remoção de Cutícula Dorsal
  6. Cortadas transversalmente no lado dorsal da cutícula, certificando-se que o corte é superficial para evitar danos ao GI Em seguida, retire a parte inferior da cutícula dorsal abdominal.
  7. Coloque o crustáceo dissecado em um prato Sylgard-alinhado.
  8. Pin do crustáceo para o prato na ponta do tailfin. Pode-se usar mais pinos de cada lado do GI, conforme necessário para manter o corpo para baixo.
  9. Encha o prato com solução salina lagostas cobrindo o GI Certifique-se continuamente para apagar o GI com solução salina usando uma pipeta. Salina é uma solução modificada de Van Harreveld (1936), que é feita com 205 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 13,5 mM CaCl 2 2H 2 O, 2,45 mM MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES e ajustada para pH 7.4. O lagostim dissecados deve aparecer como mostrado na Figura 3.
    Figura 3
    Figura 3: lagostas dissecado com GI intacta.

2.3) Experimentos

2.3.1) As contrações no animal

  1. Ter soluções do composto a ser testado pronto e à mesma temperatura como o soro fisiológico banho. Pode usar em soluções individuais de serotonina (100 nM, 1microM), glutamato (1microM) e dopamina (1microM) feita em solução salina lagostas como substâncias começam a ser testados.
  2. Permitir que o lagostim dissecados para sentar-se na solução de lagostas por cerca de 10 minutos para permitir que ele se adaptar ao choque de dissecção e exposição salina. As contrações peristaltismo lento do intestino grosso deve começar a ocorrer.
  3. Uma vez que as contrações começam, registre o número de contrações que ocorrem em trinta segundos (note o tipo de contrações que ocorrem: ou seja, tipo o peristaltismo, ou espástica, ea direção de qualquer ondas peristálticas).
    Tabela 1: Contrações no Crayfish Saline
    Número de contrações Tipo de Contrações
  4. Usando um piPette, retire o soro fisiológico dentro da cavidade do abdômen expostos os lagostins, e aplicar soro fisiológico contém a substância a ser analisada diretamente no intestino grosso.
  5. Imediatamente após a adição da solução, registrar o número de contrações que ocorrem depois de trinta segundos e observe o tipo de contrações que ocorrem (ou seja, peristálticas, ou espástica).
    Tabela 2: Contrações com a exposição a compostos
    Composto testado Concentração Número de contrações Tipo de Contrações
  6. Imediatamente após a gravação a resposta à substância de ensaio, lavar os tempos GI várias lagostas com solução salina normal. Deixe a preparação descansar por 5 minutos, enquanto a lavagem a cada 30 segundos com solução salina lagostim.
  7. Com uma pipeta, colocar algumas salina contendo o composto próximo a ser examinado ou uma concentração variada de a substância última testado diretamente no intestino grosso. É melhor começar com uma concentração mais baixa e uma forma de trabalho para concentrações mais elevadas.
  8. Imediatamente após a adição de cada nova substância ou a cada nova concentração, registre o número de contrações que ocorrem depois de trinta segundos e observe o tipo de contrações.

2.3.2) as forças de contração de gravação em preparações excisadas

Figura 4
Figura 4: Setup

  1. Anexar o transdutor para o pod ponte.
  2. Anexar o pod ponte para o PowerLab 26T.
  3. Anexar o 26T PowerLab à porta USB no computador.
  4. Abra LabChart7, clicando no ícone labchart7 na área de trabalho.
    • A caixa de LabChart Welcome Center vai abrir. Fechá-la.
    • Clique em Setup
    • Clique em configurações de canal. Alterar o número de canais a 1 (parte inferior esquerda da caixa) empurrar OK.
    • Na parte superior esquerda do gráfico do conjunto de ciclos por segundo para cerca de 2k. Definir o volts (eixo y) para cerca de 500 ou 200 mV.
    • Clique no Canal 1 da direita do gráfico. Clique em Amplificador de Entrada. Garantir que as configurações: single-ended, ac acoplado, e invertido (inverte o sinal se necessário), e anti-alias, são verificados.
    • Para começar a começar a gravação, prima.
  5. Pick up a preparação e corte o trato gastrointestinal na junção entre o tórax eo abdômen. Em seguida, corte cuidadosamente em torno da parte telson da cauda. Remova o trato GI do crustáceo dissecados e colocá-lo no prato Sylgard. Há um vaso sanguíneo que corre ao longo do aspecto dorsal do trato gastrointestinal. Puxe cuidadosamente esta longe do trato gastrointestinal. Despeje salina lagostas frescas sobre o preparo.
  6. Coloque o transdutor de força na pinça perto do crustáceo dissecados.
  7. Ligar o transdutor de força no GI lagostas, como mostrado na Figura 5.
    Figura 5
    Figura 5: hindgut isolada da lagosta em soro fisiológico ligado ao gancho do transdutor de força
  8. Aguarde até que o GI começa a se contrair, e empurre começar na LabChart7.
  9. Deixe o programa rodar por cerca de 20 segundos. Push "parar", e adicionar um comentário rotulados ", Saline só". Preencha a Tabela 4.
    Tabela 4: Contrações com o composto de interesse
    Número de contrações Amplitude das contrações (mV)
  10. Adicione o teste de compostos de interesse, e imediatamente pressione "start" na LabChart7.
  11. Deixe o programa rodar por cerca de 20 segundos. Push "stop" e adicionar um comentário diretamente sobre o arquivo gráfico de que substância foi adicionada e sua concentração. Preencha a tabela abaixo.
    Tabela 5: Contrações com composto _________
    Número de contrações Amplitude das contrações (mV)
  12. Enxaguar a preparação com solução salina lagostas utilizando uma pipeta.
  13. Adicionar outras substâncias ou várias concentrações de maneira similar. Imediatamente push "start" na LabChart7.
  14. Deixe o programa rodar por cerca de 20 segundos. Push "parar", e adicionar um comentário e etiqueta diretamente sobre o arquivo gráfico que indica o compound utilizado e da concentração.

3. Análise de Dados

  1. 2.3.1 a partir do experimento, o gráfico do número de contrações de cada solução (serotonina, soro fisiológico, o glutamato) em função do tempo. Explicar todas as tendências.
  2. 2.3.2 a partir do experimento, o gráfico do número de contrações de cada solução (solução salina, a serotonina, glutamato) versus a amplitude das contrações em mV. Explicar todas as tendências.

3.1) A medição da velocidade e força das contrações

Para indexar as taxas de contrações sobre pode medir o tempo desde o início de um desvio para o início do próximo ou contar as deflexões total, durante um minuto ou dois. Os valores podem então ser colocada em termos de contrações por minuto ou por segundo, dependendo de como rápido eles estão ocorrendo.

Para indexar a força das contrações uma medida relativa poderia ser usado para comparar diferentes condições. Sobre o arquivo salvo pode-se usar o marcador "M" e ir para a linha de base. Em seguida, use o cursor e mover-se para o pico da deflexão e anote o valor listado na parte superior direita da tela como um valor de delta (a diferença de M para o pico). Observe o cursor precisa ser mantida estacionária para a medida da mudança. Seguida, mova o M para a forma próxima onda de interesse e repetir a medida.

Discussion

Os detalhes fornecidos no filme e texto associados descrevem os principais passos necessários para registrar a atividade no intestino posterior do crustáceo in situ, assim como in vitro. Um dos objetivos do nosso relatório é aumentar a sensibilização para o potencial desta preparação no aluno executar laboratórios de investigação que ensinam conceitos fundamentais em fisiologia e farmacologia.

Estas preparações podem ser utilizados para investigar uma série de perguntas experimental que levará a uma melhor compreensão das funções fisiológicas do intestino posterior. Os mecanismos subjacentes regulação das ondas peristálticas e sua reversão ainda não são conhecidos. Os mecanismos para maior controle do trato GI todo também não são totalmente compreendidos. A questão de como integrar os centros superiores a sua actividade com a saída autônomo que controla diretamente o sistema GI continua a ser um espaço aberto de investigação (Shuranova et al., 2006). Além disso, as capacidades osmorregulatório do intestino grosso crustáceos e as funções de osmorregulação durante o estresse de muda e ambientais não foram completamente elucidados. Há ainda muitas perguntas à espera de respostas nesta preparação.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Apoiada pela Universidade de Kentucky, Departamento de Biologia, Instituto de Estudos de Graduação e Faculdade de Artes e Ciências.

Materials

  1. Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4. Serotonin, glutamate and dopamine are made in crayfish saline. All chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  3. Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
  4. Sylgard-bottomed Petri dish
  5. Beakers (to hold chemical solutions)
  6. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab 26T interface to a computer (ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  7. Bridge pod for the force transducer (different Bridge pods are required for different types of force transducers).
  8. MLT0402 (2 grams) force transducer is the research grade as shown in the video. MLT 0210/D (10 mg-25 grams) and the MLT 500/A (0-500g) are the educational grades transducers (ADInstruments).

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References

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