Yaşlanma ve Amiloid Patoloji sırasında sinaptik değişiklikler Çalışması Sıçanlar ve Transgenik Farelerde akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması

Published 3/23/2011
30 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience
 

Summary

Bu makale, sıçan ve transgenik farelerin hipokampal dilimler sinaptik değişiklikler, beynin yaşlanma ve Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar, yaşa bağlı ile ilgili çalışma için hazırlamak için prosedürler sıralanıyor.

Cite this Article

Copy Citation

Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology. J. Vis. Exp. (49), e2330, doi:10.3791/2330 (2011).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kemirgen hipokampal dilim hazırlık memeli sinaptik fonksiyon ve plastisite araştırmak için belki de en çok kullanılan araçtır. Hipokampus sıçan ve fareler hızlı ve kolay bir şekilde ayıklanır ve dilim oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı saat canlı kalır olabilir. Ayrıca, temel electrophysisologic teknikleri hipokampal dilimleri sinaptik fonksiyon soruşturma kolayca uygulanır ve bazı bilişsel bozukluklar için en iyi biyobelirteç sağladı. Hipokampal dilim, öğrenme ve hafıza yer sinaptik plastisite mekanizmalarının çalışma için özellikle popüler. Hipokampal dilimleri (veya eksikliği bunların), sinaptik etkinliği uzun vadeli potansiyasyonu ve depresyon (LTP ve LTD) indüksiyon değişiklikler, bilişsel-engelli hayvan ve / nörolojik fenotip tanımlamak için ya da eylem mekanizması değerlendirmek için sık sık kullanılır nootropic bileşikler. Bu makale hipokampal dilim sıçan ve transgenik farelerin beyin yaşlanması ve Alzheimer hastalığı (AH) 1-3 ile ilişkili sinaptik değişiklikler çalışma için hazırlamak için kullanılan prosedürler sıralanıyor. Yaşlı sıçanlarda ve AD modeli fareler kullanımı, araştırma genç sıçan ve / ya da fare kullanarak alışık araştırmacılara özel bir takım zorluklar ortaya çıkabilir. Yaşlı sıçanlarda beyin çekimi ve / veya diseksiyonu gecikme ve dolayısıyla sinaptik fonksiyon ve plastisite gerçek yaşı farklılıklar inkâr veya abartmak genç sıçanlar ve fareler, daha kalın kafatasları ve sert bağ dokusu var. Yaşlanma ve amiloid patoloji yine fizyolojik değerlendirme alınan herhangi bir çıkarımlar komplike diseksiyon işlemi sırasında sürekli hipokampal hasar alevlendirebilir. Burada, biz bu problemleri en aza indirmek için diseksiyon işlemi sırasında atılan adımları tartışacağız. Örnekler, "sağlıklı" ve "sağlıksız" bir dilim sıçan ve fareler elde sinaptik yanıtlarının yanı sıra temsili sinaptik plastisite deneyler sağlanmaktadır. Bu hayvan modellerinde (örneğin, kayıt çözümü bileşenleri, stimülasyon parametreleri) sinaptik fonksiyon diğer metodolojik faktörlerin olası etkileri de tartışılmıştır. Bu makalenin odak noktası, yaşlı sıçanlar ve transgenik fareler, acemiler fizyolojisi dilim kullanımı olsa da, burada çeşitli kemirgen modelleri kullanarak, kendi çalışmalarına başlamak için yeterli detay bulmalısınız.

Protocol

1. Hazırlanması Ice-soğuk Oksijenli Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (ACSF)

  1. ACSF "Ca 2 +-free" 2 L hazırlayın. 2L Erlenmeyer şişesi, yaklaşık 1.5 L steril veya çift distile H 2 O ekleyin ve karıştırın plaka üzerinde şiddetle karıştırarak başlamak. 124 NaCl, 2 KCl, 1.25 KH 2 PO 4, 2 MgSO 4, 26 NaHCO 3 ve 10 dekstroz (bkz. Tablo 1): Aşağıdaki ACSF bileşenleri (mM) ekleyin. Distile H 2 O. ile 2 L hacim getirin .
  2. % 95 O 2 /% 5 CO 2 hava tankı, yaklaşık 20-30 dakika boyunca şiddetle oksijen ACSF bağlı bir akvaryum bubbler ve tüp kullanma. PH kontrol edin ve gerekirse, NaOH veya HCl ile 7.4 'e ayarlamak.
  3. 750 mL oksijenli Ca 2 + ücretsiz ACSF ayrı bir Erlenmeyer şişesinin içine dökün, açılış kapağı parafilm, ve 20-30 dk bir ultrafreezer (-80 ° C) transfer . Bu ortam ve akut beyin hipokampal dilim diseksiyon için kullanılan olacak *. #, Iyice karıştırın, ve% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile oksijenasyon devam ACSF kalan 1.25 L hacmi 2 mM CaCl 2 ekleyin. Bu ortam diseksiyonları sonra ve elektrofizyolojik kayıtlar sırasında dilimleri perfüze beyin dilimleri saklamak için kullanılacaktır.
    * Buz gibi soğuk Ca 2 + ücretsiz medya metabolizmasını yavaşlatır ve Ca 2 + bağımlı eksitotoksisitesi Diseksiyon sırasında en aza indirmek için kullanılır.
    Ca 2 # Changes yaşlanma sırasında disregülasyon ve AD, Ca 2 +-bağımlı sinaptik plastisite 4-9 indüksiyonu üzerinde önemli bir etkisi olabilir . Mg2 + oranları dilim kayıtları sırasında (2,4,10): LTD yaş farkı konusunda çelişkili raporlar farklı ACSF Ca 2 + kullanılması kısmen kaynaklanıyor olabilir. Ca 2 önemi + düzenleme ve ACSF Ca 2 + yaşlanma çalışmalarda düzeyi Tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak ele alınmaktadır.
  4. Ca 2 + ücretsiz ACSF donma olmakla birlikte, elektrofizyolojik kayıtlar öncesinde ve sırasında beyin dilim bakım için bir holding odası hazırlamak *. Biz, dört ayrı microchambers (bkz. Şekil 2) içeren bir özel makro tutma haznesi kullanın. Macrochamber steril ile doludur, H 2 O oksijenli ve microchambers aslında su yüzeyi üzerinde çıkıntı adalar. Her microchamber içinde, dilim oksijenli ACSF sığ bir havuz netleştirilerek eklemek bekletin. Dilimleri tamamen sular altında, ancak nemlendirilmiş hava ile bir arayüz oturmak değildir. Macrochamber içinde yalıtımlı bir gözü sıcaklık ayarı için sağlar.
    * Holding odaları pek çok çeşidi de piyasada bulunan (örneğin, Warner Instruments bir dalma-stili "Ön Odası # BSC-PC yapar) ve yaşlanma ve transgenik fare dilim çalışmalarında kullanılmak için uygun olmalıdır. Bir tutam, dilimler korunabilir ACSF ile dolu küçük bir petri birkaç saat, bir oksijen teslim tüpü için küçük bir delik Petri kapağı olun. oksijen baloncukları fiziksel dilim ajitasyon yok dikkatli olun. teslim tüp sadece ortaya Dilimleri yeterli oksijen alacak ACSF yüzeyi üzerinde (gaz dağılımı, sıvı yüzeyinde bir girinti neden olmalı).

2. Yaşlı Beyin Kaldırma ve Hipokampal Diseksiyon (> 20-aylık-sıçan)

  1. Büyük bir lavabo (bkz. Şekil 1 ve Tablo 2) yanındaki diseksiyon alanı * hazırlayın. Lavabo küçük bir hayvan giyotin yerleştirin ve katlanmış bir kağıt havlu da dahil olmak üzere beyin kaldırma ve hipokampal diseksiyonu, # 11 neşter bıçak, beebee makas, kemik rongeurs, bir "Hippocampus aracı" (özel bir çift spatula için cerrahi aletler ve malzemeler yattı Güzel Cerrahi Araçları), küçük cerrahi makas, ince bir çift uçlu spatula, plastik Pasteur pipeti, 110 mm çapında whatman Filtre kağıdı, buz dolu bir kapaklı 100 mm cam petri ve plastik bir kaşık. Ayrıca, karkas imhası için bir plastik torba yakın tutun.
    * Beyin çıkarma kısa sürede tamamlanması gerektiğini, bu nedenle zihinsel prosedürü "ile yürüyüş" ve araçların kullanım amacıyla düzenlemek için iyi bir fikirdir.
  2. Ca 2 + ücretsiz ACSF dondurucuya kaldırın. Medya tamamen, dondurulmuş, kısmen olmalıdır. Parafilm ile kapağı, bir cam behere ACSF yaklaşık 50 ml dökün ve diseksiyon alanı yanında yer. Bu ortam, beyin çıkarıldıktan sonra kısa bir süre saklamak için kullanılır. Kalan Ca 2 + ücretsiz medya dilim hazırlanması için Vibratome rezervuar doldurmak için kullanılır. Bu ortam reoxygenated olabilir, ya da sadece parafilm ile kaplı ve 4 buzdolabı yerleştirilen ° C
  3. Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış yöntemler kullanarak sıçan Euthanize. Bizim hayvanlar yavaş yavaş% 100 CO 2 ile dolu küçük bir pleksiglas odasında yerleştirilir . Bilinç kaybı genellikle beş dakika içinde ortaya çıkar ve refleks aktivite yokluğu tarafından onaylandıktanBir ayak tutam.
  4. Birinci servikal vertebranın hemen rostral sıçan başını kesmek ve katlanmış bir kağıt havlu üzerine kafa yerleştirin. # 11 bistüri kullanarak, hızlı bir şekilde burun kemiği yakınında başlayan ve oksipital kemik kaudal kafa derisi ortasında bir kesi yapmak. Sütür kafatasının dorsal yüzeyi tamamen açığa, deri kas yoluyla tamamen kesmek için emin olun.
  5. Kafatası plakaları beebee makasla kesti. Genç sıçanlar ve fareler, kafatası tek başına kemik rongeurs kullanımı ile hızlı bir şekilde kaldırılabilir. Ancak, yaşlı sıçanlarda bu yordamı zorlaştırabilir genç erişkin sıçan ve fareler daha kalın kafatasları var. Biz kafatası ile kesme rongeurs ile büyük ölçüde kemik kaldırma kolaylaştırır beyin yaralanması azaltır ve değerli saniye kaydeder bulduk. Rat sıkıca karşı üst başlığı ile, kafatasının arka kısmı foramen magnum üstün bölgeye beebee makas alt katıksız kesme kenarına yerleştirin. Oksipital plaka kesti kafatası iç yüzeyi (ve beyin uzak) *, düşük katıksız sıkıca tutmak, ve daha sonra parietal plakaların, orta hat dikiş boyunca. Rostrally frontal kafatası plakaları kesti kadar devam edin.
    * Basınç yanlışlıkla ölçüm önlemek için beyinden kritik önem taşımaktadır.
  6. Oksipital, parietal ve beynin temporal kafatası plakaları ayırın. Istikrar ve kaldıraç için tezgah baş sıkıca tutmaya devam edin ve alt çene kafatasının iç yüzeyi karşı sol parietal plaka korumak basınç altında rongeurs slayt. Sonra, birlikte rongeurs çeneleri sıkmak ve uzak beyin parietal ve oksipital plakaları çekmek için bileğinizin yukarı ve kendinize doğru döndürün. Bu çoğu sol hemisfer dorsal yüzeyi göstermelidir. Gerekirse rongeurs, hem de sol frontal plaka kaldırmak için kullanın. Diğer yarımkürede için bu işlemi tekrarlayın. Plakalar yerinden sonra, temporal plakaları takılı ve beynin yüzeyine yayılmış olabilir herhangi bir dura konuda hızlı bir şekilde kontrol edin. Yavaşça rongeurs bu çekin ya da makasla kesip *. Şimdi, tekrar kafatası doğru ve beyin uzak tutmak basıncı, beyin ve sağ temporal plaka arasındaki rongeurs üst çene kaydırın. Beynin temporal plaka sıkıştırın ve bükün. Bunu gibi bir "crunch" duymak / hissetmeniz gerekir. Sol taraf için tekrarlayın.
    * Dura hayvan transcardially ACSF ile perfüze olmuştur, özellikle eğer fark etmek zor olabilir. Ancak dura kaldırıldı değilseniz, bunlar geçici tabak kaldırılır bir jilet gibi beyin (ve büyük olasılıkla hipokampus) aracılığıyla dilim olacaktır. Temporal plakaları yakın uzak dura Snipping beyin bıçaklama olasılığını en aza indirecektir.
  7. Beyin Özü *. Ca 2 + ücretsiz ACSF "ıslak" parafilm hızla çıkarın. Şimdi, beyin ve alt kafatası plakaları ventral yüzeyi arasındaki Hipokampal aracı geniş spatula baş beyin altında tamamen kadar kaydırın. Bozulmadan kranial sinirler koparmaya spatula yanal yan-yan ve daha sonra birkaç kez ileri ve geri hareket ettirin. Şimdi, Ca 2 + ücretsiz ACSF ve parafilm kapak Hipokampal aracı ve batığın beyin kepçe . Yaklaşık bir dakika boyunca beyin soğuk olsun. Bu kapalı temiz, giyotin, karkas imha ve disseksiyon alanında yeniden bir fırsat.
    * Adımlar 2,3-2,7 için, hız özü. 30-35 sn (dekapitasyon ACSF altında kalma, beyin) bu prosedürü tamamlamak için deneyin. Deneyimlerimize göre, ekstraksiyon, özellikle yaşlı sıçanlarda hipokampal dilim sağlığı olumsuz etkileyecek bir dakika daha uzun sürüyor. Bu prosedürleri kullanarak, ekstraksiyon zamanlarda çalışmalar için yaşlı ve genç sıçanlar arasında hiçbir fark gözlemledik.
  8. Hippocampi ayıklayın. Whatman filtre kağıdı buz petri kapağının üzerine koyun ve plastik transfer pipet kullanarak ACSF kağıt nemlendirin. Nemlendirilmiş whatman kağıt yer ve bir kaşık kullanarak ACSF beyin al. Neşter bıçak kullanarak, rostral frontal lob, beyincik ve yaklaşık dörtte biri çıkarın. Tamamen ayrı iki yarımküresinin intrahemispheric fissür yoluyla neşter bıçak çalıştırın. ACSF ıslak ve içine geri yerleştirin yarımkürede bir "stand" frontal lob koronal düzlemde aşağı baktığından emin gibi diseksiyon sahnede kadar. Beyin sapı ve orta beyin (ki beyaz) üstteki korteks (grimsi / pembe) açık bir şekilde ayırt etmek gerekir. Orta beyin superior ve inferior colliculi bulun; bu iki beyaz "düğme" gibi görüneceğini ve bu yönde beyin "top" olacak. Cerrahi makas kullanarak, yavaşça yerine Ortabeyin tutun ve boşluğu tartım spatula slaytarasında colliculi ve neokorteks. Çok spatula yavaşça aşağıya doğru kaymaya devam edecek ve orta beyin, beyin sapı / / uzak lateral ventrikül ve hipokampus medial yüzeyi iç ifşa talamus çekin. Sorunsuz forniks koparmak için keskin kenar spatula kullanın; hipokampus ön / sırt kısmı bulunan beyaz bir elyaf demeti. Makasla hafifçe orta beyin, beyin sapı / / uzakta talamus beynin geri kalanından tamamen kesilmesinin olmadan çekmeye devam edin. Hipokampus ile korteks beyin serbestçe geri koymak gerekir *. Sonra, sagital bir bölümü (eksi talamus) sanki medial hipokampus ve örten korteks bakarak böylece diseksiyon sahne açmak. Artık bu düzlemde hipokampüsün altındaki sığ bir Hiperbol oluşturan beyaz fimbria lifleri göreceksiniz. Korteks, hipokampus ayrı fimbria altındaki boşluğa plastik transfer pipet, hafifçe fışkırtma bazı ACSF kullanma. Spatula bu boşluğu içine yavaşça kaydırın spatula uzun kenarı hipokampus uzun ekseni ile paralel çalıştığından emin. Spatula hipokampus altında tamamen sonra makas ile orta beyin, beyin sapı / / talamus sıkıca basılı tutun, fiziksel beynin geri kalanı hipokampus ayrı vücudunuzdan uzakta spatula rulo. Hipokampus sonra, kalan tüm korteks, kan damarları, ve beyaz cevher hafifçe kırpın. Diseksiyon sahne uzak yüzüne ACSF ıslak küçük bir miktar Scoop. Plastik transfer pipet kullanarak ACSF birkaç mililitre slush ve söndürmeye yanında hipokampus yavaşça yerleştirin. Sonra, diğer yarımkürede çıkarın ve diseksiyon tekrarlayın.
    * Makas, beyin sapı, korteks ayrımı önleyen ek bağ dokusu, beyaz cevher, ya da damarsal uzak snip gerekebilir. Makas noktaları hipokampus çok yakın olacak, bu yüzden çok hassas snips (keskin bir makas gerekir) teslim etmek için emin olun.

3. Yaşlı Transgenik Farelerde Beyin Kaldırma ve Hipokampal Diseksiyon

  1. Euthanize ve başını kesmek fare ve bölüm 2.3 'de açıklandığı gibi, kafa derisi üzerinde orta hat kesi yapmak. Fareler büyük ölçüde beyin çıkarma kolaylaştırır sıçanlardan daha çok ince kafatasları var. Kafatası makasla kesen bu nedenle gereksiz. Oksipital, parietal ve temporal kafatası plakaları çekmek için, küçük çeneleri (Tablo 2) ile kemik rongeurs kullanın. Sıçan gibi, kontrollü hareketleri ve plakaları kaldırmak gibi sıkıca beyinden uzak rongeurs alt çene kafatasının iç yüzeyi içine çekin ve hatırlıyorum. Plakalar kaldırıldıktan sonra, kalan kraniyal sinirlerin sever ve buz Ca 2 + ücretsiz ACSF beyin kepçe Hipokampal aracı dar ucu kullanın.
  2. Beyin dilimleri hazırlayın. Sıçan kullanarak daha hippocampi diseksiyon fare beyni küçük boyutu nedeniyle biraz daha zor olabilir ama kesinlikle yapılabilir. Yani, şeyleri kolaylaştırmak için, serebellum ve frontal loblar rostral ipuçları kaldırmak, ancak hippocampi teşrih yok. Bunun yerine, beyin hemisferlerin fiziksel bir neşter bıçağı ile ayrılmış ve (bkz. Bölüm 4) Vibratome kesit değişmeden kalır.

4. Bölüm Beyin Into Titreşimli Mikrotom (Vibratome) kullanarak Dilimleri Doku ve Holding Odası * Transfer

  1. Kesme aşamasında ve bıçak tamamen sular altında olduğunu buz Ca 2 + ücretsiz ACSF, Vibratome rezervuar doldurun. Sıçan dilim yapmak için her hipokampus rostral ve kaudal ipuçları, bir neşter bıçağı ile kesti. Bu kesimler, dikey iki sütun gibi yakından birlikte hippocampi konumlandırmak için izin verecektir. Bu her hipokampus, dentat girus birbirleriyle karşı karşıya olduğu ve CA3 bölgeler aynı yönde odaklı eğer iyi çalışır. Fare dilim yapmak için, dikey frontal lob aşağı bakacak yakından birlikte her yarımkürede pozisyon. Tutkal bir montaj blok ve Vibratome kesit sahne transfer üzerine beyin dokusu. Biz genellikle ~ 400 UM bölümleri sinaptik fizyolojisi deneyleri için hazırlar. Tiner bölümleri, floresan görüntüleme (örneğin soruşturma Ca 2 + düzeyleri ve geçici) yapılacaktır eğer hazırlıklı olmalıdır . Geniş ağızlı bir pipet veya # bir boya fırçası ile dilimleri toplayın ve buz gibi Ca 2 + ücretsiz ACSF içeren küçük bir petri aktarmak .
    * Dilim alt ve üst yüzeylere Vibratome en aza indirir hasar kullanın ve kesinlikle dilim yüzeyi (örn. gerilim kelepçe ve Ca 2 + görüntüleme çalışmaları) yakınındaki hücrelerin analizi gerektiren çalışmalar için tavsiye edilir. Ancak, daha ucuz alternatifler mevcuttur ve ekstrasellüler fizyolojisi deneyleri için dilimleri oluşturmak için uygundur. Biz küçük bir ağırlık kontrollü kıyıcı 2,11 ve iyi bir başarı ile McIlwain Doku Chopper 12 kullandık . Thi içins prosedürü hippocampi dikey bir kıyıcı ile sahnelenen ve kesitli yerleştirilir. Bir fırça, buz Ca 2 + ücretsiz ACSF dolu küçük bir holding çanak dilimleri (bir kerede bir) aktarmak için kullanılır . Bir sorun bu yaklaşım ile hippocampi düzensiz bölümlerde çıkan pirzola arasında taşıyabilirsiniz. Ayrıca, fazla beyaz madde, özellikle doğrama önce mümkün olduğunca çok damarsal gibi kaldırmak için dikkatli olun. Bu malzeme fırçası, tıraş bıçağı, ya da, dilim transferi çok zor ve doku germe veya zarar verme olasılığını artırarak hem sopa olacak.
    # Zaman bir fırça kullanarak, kıllar karşısında dilim boy-bilge dinlenmek için deneyin. Fırça ucu çevresindeki dilim Sarma gereksiz doku germe neden olabilir.
  2. Oksijenli Ca 2 + içeren ACSF yıkandığı tutarak odasına beyin dilimleri aktarın. Yavaş yavaş 32 ° C (+1 ° her beş dakikada bir) 27 ° 'den oda sıcaklığına getirmek. İzin dilimleri elektrofizyolojik deneylerde önce 1-1,5 saat süreyle inkübe.

5. CA3-CA1 Synaptic tepkiler ve Kayıt

  1. Uyarıcı, kayıt, ve topraklama elektrotları; bir perfüzyon sistemi;> 4X büyütme özelliğine sahip bir mikroskop bir kayıt odasına makro ve mikromanipülatörler; sert bir titreşime dayanıklı: akut dilimleri temel ekstraselüler kayıtlar için, elektrofizyoloji istasyonu * dahil etmek gerekecektir masa üstü ve Faraday kafesi; stimülatörü, amplifikatör ve analog-dijital (A / D) çevirici, uygun satın alma yazılımı ile ve kişisel PC osiloskop (tercihen).
    * Kerr Scientific Instruments, bir dizi temel dilim elektrofizyoloji deneyleri yürütmek için bir fantastik ve ucuz elektrofizyoloji sistemi (yani Kerr Doku Kayıt Sistemi) sunmaktadır. Bu sistem, küçük bir ayak izi, taşınabilir uyarıcıları ve amplifikatörler ve hantal bir Faraday kafesi ihtiyaç duymadan standart bir laboratuvar tezgahı üzerinde kullanılabilir.
    Tabii ki, beyin dilimleri de ek ekipman ve malzeme gerektiren çok sayıda ayrıntılı elektrofizyolojik ve görüntüleme teknikleri, gerçekleştirmek için kullanılır. Örneğin, ana elektrofizyoloji istasyonu hızlı voltaj ve akım kelepçe yetenekleri, floresan aydınlatma sistemi ve bir dijital fotoğraf makinesi ile bir amplifikatör içerir. Bu istasyon yanı sıra beyin dilimleri, yama klemp kayıtları ve dilimleri ve hücre kültürleri 3,12,13 floresan görüntüleme ekstrasellüler alan kayıtları için kullanılır. Tablo 3, teçhizat ve bileşenlerin tam bir liste için Bkz.
  2. Geniş ağızlı bir pipet veya küçük boya fırçası kullanarak, kayıt odasına * stimülasyon / kayıt 10-15 dakika önce gelmesini sağlayan bir veya birden fazla dilim transferi. Çalışmalar için, dilimler (bkz. Şekil 3), Warner Instruments tarafından bir RC-22 odasına yerleştirilmiş file ACSF ve dinlenme batmış. ACSF ağırlık akış hızını ayarlamak için bir regülatör ile beslenen ve 32 prewarmed ° C kayıt odasına ulaşmadan önce bir satır içi mikro-ısıtıcı. Bir merkezi vakum hattı ASCF kaldırmak için kullanılır.
    Dalgıç ve tarzı arabirim kayıt odaları * Birçok farklı çeşitleri piyasada mevcut. Biz dilimleri (yani dilim nemlendirilmiş hava ve ACSF bir arayüz oturur) 2,11 daha güçlü bir arayüz odasında sinaptik tepkiler sergilediklerini gözlemledik. Ancak, cevap verebilen dilim ACSF batık zaman genellikle daha istikrarlı. İlaç perfüzyon dalma odaları da daha verimli olur.
  3. Pozisyonu uyarıcı ve elektrotlar kayıt. Stimülatörü veya uyaran izolatör açık, ancak çıkış konumu CA3 sınırına yakın CA2 stratum radiatum bölgesi (bkz. Şekil 4) dilimin üzerinde uyarıcı bir elektrot, 0 aşağı aranan. Biz CA3 Schaffer teminat (SC) lifleri 50-100 uS difazlı bakliyat teslim etmek için bir bükülmüş platin iridyum tel kullanıyoruz. Platin iridyum tel ve difazlı bakliyat kullanımı minimize elektrot kutuplaşma yardımcı olabilir. CA1 stratum radiatum içine bir kayıt elektrot Alt dilim çatlatabilir. Bizim kayıt elektrot Ag / AgCl ACSF dolu bir cam mikropipet (M ~ 7 ucu direnci) tel. Stimülatör çıkış orta düzeyde (~ 150 uA uyaran izolatör) açın ve uyaran bakliyat yönetmek ve yavaş yavaş küçük uyarıcı elektrot düşük Axon Instruments, Inc Clampex olarak satın alma yazılımı kullanarak faaliyet satın başlamak bir uyarıcı artificact kadar aralıklarla CA1 kaydedilir. Sonra, fiber voleybolu (FV) ve genlikleri (bkz. Şekil 4B) maksimum seviyelere ulaşmak eksitatör postsinaptik potansiyel (EPSP) kadar CA1 yanıtları elde edilirken aralıklarla yavaş yavaş ve kayıt uyarıcı elektrotlar hem düşük devam etmektedir.
  4. Sinaptik gücü eğrisinin oluşturulması ve sinaptik plastisite araştırmak. Sinaptik gücü eğrisi oluşturmak için, giderek artan yoğunluğu ve kayıt inci SC uyaran bakliyat teslimCA1 e karşılık gelen aktivite. Kullanılan uyaran yoğunluğu seviyeleri aralığı ve sayısı değişebilir ama FV veya EPSP değerleri (Şekil 5) ya karşı çizilen bir sigmoid eğri oluşturmak için yeterli olmalıdır. EPSP eğim monosinaptik CA3 CA1 akımları kirlenmemiş bir önlem sağlar FV genlik, aktif presinaptik liflerin oranı güvenilir bir tahmin sağlar. Bu nedenle uyaran yoğunluğu seviyeleri arasında FV karşı EPSP yamacında plotlama aktif afferentleri numarası başına EPSP boyutunu yansıtır ve CA3-CA1 sinaptik gücü mükemmel bir tahmin sağlar. Tipik olarak, örneğin 4,14 görmek genç sıçanlar ve yaş eşleştirilmiş wild-tip farelerden göre yaşlı sıçanlar ve APP/PS1 fareler, alan CA1 sinaptik gücü düzeyleri önemli ölçüde azalır.
  5. Sinaptik gücü eğrisi sırasında kötü sağlık işaretleri (yani maksimum bir EPSP genlik <1 mV) ya da (yani, 2 ya da daha fazla nüfus ani bir görünüm) hipereksitabilite göstermektedir Dilimler, istatistiksel analiz (bkz. Şekil 4C) dışındadır. Biz bu dilim nadiren 60 dk süre ve / veya sinaptik plastisite indüksiyonu sonrasında son derece değişken tepkiler karşısında kararlı tepkiler gösterirler bulduk. "Sağlıksız" kayıt odasına transfer edilen tüm dilim dilim sadece yaklaşık% 10-20 makyaj dikkati hak ediyor. Ayrıca, deneyimlerimiz, sağlıksız bir dilim tanımlayan sıklığı, yaş, cins, ve genotip karşısında çok benzer.
  6. Dilimler halinde uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) veya uzun süreli depresyon (LTD) uyarır. LTP ve LTD sinaptik aktivasyon farklı desen yanıt sinaptik fonksiyonu kalıcı artışlar (LTP) ve düşüşler (LTD). Süreçlerinin her ikisi de yaygın öğrenme ve memory15 için kritik mekanizmalar yansıtacak ve sinir fonksiyon bozukluğu ve / hücresel mekanizmaları araştırmak için ya da bellek kusuru ve nörodejenerasyon 16 iyileştirmede farmakolojik stratejileri değerlendirmek için yararlı sonuç önlemleri sağlamak için inanılıyor .
    Sinaptik plastisite deneyler için, her dilim için 1 mV * stimulus sıfırlamak ve 0.033 Hz frekansta bazal stimülasyon başlar. EPSP eğim değerleri LTP veya LTD indüksiyon önce en az 20 dakika süreyle sağlam olmalıdır. Bu süre boyunca yakından EPSPS izlemek ve eğimi% 10'dan fazla dalgalanır ve yeni bir temel başlangıç ​​stimulus sıfırlamak. Verilen her 200 ms, 100 Hz stimülasyon 100 Hz stimülasyon veya birden çok kısa patlamaları (~ 10 bakliyat) ikinci bir tren kullanarak LTP neden. LTD indüksiyonu için, 1 Hz hızında 900 uyaran bakliyat sunar. LTP ve LTD indüksiyonundan sonra, ek bir 60 dakika veya daha fazla sinaptik tepkiler toplamak. LTP ve LTD varlığını belirlemek için, öncesi ve yüksek / düşük frekanslı stimülasyon 60 dk sonra elde edilen EPSP eğim değerleri karşılaştırıldı.
    Yaşlı sıçanlar ve APP/PS1 fareler, eksik LTP ve gelişmiş LTD (bkz. Şekil 5) gösterme eğilimindedir ve bu değişikliklerin, bu hayvan modelleri 6,16 Bozulan algı katkıda bulunmak için öne sürülmüştür. Ancak, yaşlı sıçanlarda LTP / LTD değişikliklerin, APP/PS1 farelerin aksine laboratuarları boyunca değişkendir. Yaşlı sıçanlarda genellikle yetişkinler için "yoğun" (yani 100 Hz) stimülasyon yanıt benzer LTP seviyeleri gösterirler, ancak hafif stimülasyon parametreleri kullanılmıştır gösterisi açıkları (yani düşük uyaran frekansları veya daha az uyaran bakliyat) (inceleme için 4,6 bkz. 16). Ayrıca, bazı laboratuvarlar, bizimki de dahil olmak üzere, diğer gruplar, yaşlı hayvanlarda herhangi bir fark ya da azalmış duyarlılık bulduk, yaşlı sıçanlarda 2,17-19 LTD indüksiyon artmış duyarlılık gözlemledik. Gibi (Tartışma) aşağıda kısaca ele, deneysel protokol ince ama kritik farklılıklar, bu farklılıklar hesaba olabilir.
    * Stimülasyon yoğunluğu ve EPSP genlik LTP indüksiyon etkisi ve literatürde çelişkili sonuçlar önemli bir neden olabilir. Tartışma bölümünde de dikkate alınacaktır.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bizim işimiz, ve diğer grupların çalışmaları, astrosit tabanlı inflamatuar sinyalizasyon değişiklikleri tetikleyebilir ve / veya yaşlanma ve AD 13,20,21 sırasında nörolojik disfonksiyon acele olduğunu göstermektedir. Son zamanlarda, etkinliği ve (bu model açıklamasına için 22), orta yaşlı APP/PS1 farelerde birkaç roman anti-inflamatuar reaktifler eylem mekanizmaları araştırmak için uç nokta önlemler olarak sinaptik gücü, LTP ve LTD kullanılan ve Fischer yaş var 344 sıçan. Bu makalede açıklanan protokolleri kullanarak aşağıda verilen sonuçlar elde edilmiştir.

Yeni anti-inflamatuar adeno-ilişkili laboratuvarı tarafından geliştirilen viral (AAV) reaktifler (sinaptik gücü önemli ölçüde artış (p <0.05) ve orta yaşlı LTP açıkları (p <0.05) engellemek için pilot çalışmalarda gösterilmiştir olmuştur 16 aylık) APP/PS1 fareler (n = 4-6 dilim tedavi durum başına). Iki farklı dilim, argo Temsilcisi sinaptik gücü eğrileri ve LTP deneyleraynı 16 aylık APP/PS1 fare Seniyye, Şekil 5A-C gösterilmiştir. Bir dilim, diğer dilim kontrol AAV reaktifi (kontrol) ile tedavi edildi, (Reaktif A) romanı AAV ile tedavi yarımkürede ekstrakte edildi. LTP 100 Hz stimülasyon (10 sn intertrain aralık) iki 1 sn trenleri kullanan her iki dilim indüklenen. Reaktif A ile tedavi edilen dilim sinaptik gücü eğrisi daha fazla sinaptik gücü gösteren kontrol dilim sol kayar unutmayın. Ayrıca LTP APP/PS1 orta yaşlı fareler için tipik kontrol dilim (örneğin 23) başlangıca hızla çürümesi dikkat edin. Tersine, LTP roman reaktifi ile tedavi dilim az çürümüş bir.

İkinci bir çalışmada, araç-tedavi edilen yaşlı sıçanlarda (pre-LTD bazal, p <0.05% 85) önemli LTD gözlemledi. Buna karşılık, hiçbir LTD yeni anti-inflamatuar "İlaç" (% 97 ön LTD bazal, anlamlı değil) ile tedavi edilen yaşlı sıçanlarda gözlendi. Sinaptik gücüne hiçbir ilacın etkileri gözlenmiştir. Bu veri seti (n = 8-10 sıçanlar grup başına) Temsilcisi LTD deneyler Şekil 5D-F gösterilmiştir.

Şekil 1
Şekil 1. Beyin diseksiyon için kullanılan araç ve gereçleri, kağıt havlu. B, neşter bıçak. C Beebee makas. D, kemik rongeurs (sıçan). E, kemik rongeurs (fareler / sıçanlar için). F, Plastik kaşık. G, plastik transfer pipet. H Hipokampal aracı. Ben, spatula. J, cerrahi makas. K, cam petri.

Şekil 2
Şekil 2. Özel beyin dilim odasına sahip. Macrochamber. B, kapağı. C, H 2 O delikli silikon tüp rezervuar. D, microchamber. E ACSF teslim tüp (polietilen). F, O 2 teslimat tüp. G, sıcaklık kontrolü için port. H düşülmektedir microchamber eklemek.

Şekil 3
Şekil 3. RC22 dalma odası, Kayıt odasına. B, Zemin elektrot. C Aspirasyon iğne.

Şekil 4
Şekil 4. Hipokampal dilim illüstrasyon ve ekstrasellüler dalga şekilleri. Elektrofizyoloji deneylerde kullanılan enine hipokampal bölümü, Çizgi Film. CA = cornu Ammonis. DG = dentat girus. SC = Schaffer teminatlar. S radiatum = stratum radiatum. B, SC (CA3 akson yolu) Elektrik stimülasyon, bir uyarıcı artifakı ortaya çıkarır, bir presinaptik nüfus artış, ya da fiber voleybolu (FV) ile neredeyse hemen sonra. FV genlik aktif SC liflerin sayısı ile doğru orantılıdır. Devam eden negatif faz alanında eksitatör postsinaptik potansiyel (EPSP) eğim SC terminallerinden serbest glutamat yanıt CA1 piramidal nöronlarda sinaptik akımları depolarizan aktivasyonu ile doğrudan ilişkilidir. C, bir "sağlıklı" (sol panel) dokuz farklı uyaran yoğunluğu düzeyleri (3-50 uA) yanıt CA1 stratum radiatum kaydedildi Çakışan temsilcisi ekstrasellüler dalga, "sağlıksız" ve "hyperexcitable" dilim. Beş dalga şekilleri seviye başına ortalamaları alındı. Sağlıklı dilimleri bu uyaran aralığında dinamik cevap ve tek bir olumlu devam eden nüfus başak (CA1 nöronal deşarjı yansıtan) yüksek teşvik düzeyde sergilemek. RC22 dalma kamara, maksimum EPSPS genellikle 1.5 genlik 3 mV arasında değişmektedir. Sağlıksız dilim (orta panel), genellikle büyük bir FV, ancak küçük bir maksimal EPSP (<1 mV) sergi ve genellikle kötü plastisite gösterir. Hyperexcitable dilimleri (sağ panel) iki veya daha fazla EPSP artan uzuv rejeneratif nüfusun ani göstermektedir. Hyperexcitable dilimleri tepkiler çoğu labil ve değişken LTD / LTP stimülasyon tarafından etkilenir.

Şekil 5
Şekil 5. Temsilcisi elektrofizyoloji deneyleri akut dilim orta yaşlı (16 ay) APP/PS1 fareler ve Fisher 344 sıçanlarda (22 ay) yaşlı üzerinde yapılan bir kontrol adeno-ilişkili (AAV) viral tedavi APP/PS1 fareler toplanan Panelleri AB gösteren veriler inşa (Kontrol) ya da bir roman AAV reaktif (Reaktif A) laboratuar grup tarafından geliştirilmiştir. Daha fazla sinaptik gücü göstergesi FV eğrisi (A): Bağıl> kontrol dilim dilim, bir sergiler Reaktif EPSP belirgin bir sola doğru bir kayma tedavi. Reaktif-A-tedavi dilim de, (B) iki 1 sn, 100 Hz uyaran trenler tesliminden sonra, sağlam ve istikrarlı LTP gösterirken, bu hayvan modelinde tipik kontrol dilim sergiler eksik LTP. Paneller, araç ya da bir roman anti-enflamatuar ilaç (İlaç) kronik (4 hafta) intrahippocampal perfüzyonları alan iki ayrı yaşlı sıçanlarda toplanan gösteren veriler DF. Bazal sinaptik gücü ilaç tedavisi nispeten etkilenmemiş(D). Ancak, İlaç LTD (E) indüksiyon önlemede çok etkili oldu. Paneller C ve F gösterisi temsilcisi EPSP önce tek tek dilimler kaydedilen dalga şekilleri (ön) ve 60 dk sonra (post) LTP / LTD stimülasyon teslim. Uyaran eser gösterilir unutmayın.

Discussion

Bu protokolde belirtilen adımları beyin diseksiyonları, yaşlı, genç erişkin sıçan gibi en azından hızlı ve verimli bir şekilde yapılmaktadır sigorta yardımcı olacaktır. Biz de LTP ve LTD kendi dilim çalışmalar kurmak için yeni başlayanlar için yeterli ayrıntı sağlar. Yaşlanma ve sinaptik fonksiyon ve plastisite AD değişiklikleri daha fazla arama hedeflerinden biri ise, bir daha görüşülmek hak yukarıda ima en az iki metodolojik konular, vardır. İlk olarak, çeşitli laboratuvarlar gösterilen Ca 2 +: Mg2 + ACSF hipokampal dilim 2,10,24,25 indüksiyon sinaptik plastisite üzerinde belirgin bir etkisi olabilir kayıt oranı. Memeli BOS, Ca 2 +: Mg2 + oranı yaklaşık biri (örneğin 26 görmek). Ancak, ACSF Ca 2 +: Mg2 + yakın 2 oranları sinaptik fonksiyon ve plastisite dilim çalışmaları yaygın olarak kullanılmaktadır. Erken çalışmalarda, bu uygulama muhtemelen LTP indüksiyon optimize etmek için adapte oldu, ardından tüm plastisite çalışmaları için bir rutin haline geldi. Ancak, bu uygulama nöronal Ca 2 + düzenleme iyi karakterize farklılıklar nedeniyle yaşlanma ve AD çalışmaları sorunlu olabilir. Özellikle, Ca 2 + akını ve / veya Ca 2 +-indüklenen Ca 2 +-sürüm 3,27-31 nöronal aktivasyon sırasında yaşlı sıçan ve / veya AD modeli fareler yüksek. LTD İndüksiyon ACSF Ca 2 + düzeyleri ince değişiklikler özellikle duyarlıdır. Mg2 yakın iki + oran, erişkinlerde sağlam LTD gözlenen var içinde: 2mm Ca 2 + ve 2 mM Mg2 +,, yaşlı, ama 2 yetişkin hayvanların genç değil LTD yaygın sonuçları ise bir Ca 2 kullanarak çalışmalar + kullanan Bizim protokol, 32 yaşlı sıçanlarda azaltılmış LTD ile birlikte bir yaş farkı 2,10 ya da yokluğu. Bu gözlemler, yaşlı ve genç erişkin hayvanlarda Ca 2 + bağımlı plastisite karşılaştırırken dikkatle ACSF Ca 2 + ve Mg2 + düzeyleri dikkate almak gerektiğini vurgulayın.

Ikinci metodolojik sorunu postsinaptik depolarizasyon 33 ve sinaptik gücü yaşlanma / genotip farklılıklar LTP güçlü bağımlılık ilgilidir. Tipik bir LTP deney, temel ve LTP stimülasyon yoğunluğu, genellikle bir buçuk maksimal (veya üç çeyrek) EPSP maksimum genlik üretmek için ayarlanır. Potansiyel bir sorun, yaşlı sıçanlar ve APP/PS1 fareler, genellikle bazal EPSP değerleri de yaşlı sıçanlar ve APP/PS1 fareler daha küçük olacağı anlamına, genç ve / veya yabani tip meslektaşları göre sinaptik gücü azalır göstermektedir. Daha küçük EPSPS LTP 33 indüklemesi için daha düşük bir olasılık, LTP stimülasyon sırasında daha az depolarizasyon çevirmek olabilir . Çünkü bu potansiyel bulandırabilir, bu hayvanların verim açığı, bir plastisite açığı ya da her iki sergi belirlemek zordur. Yani, yaşlı ve / veya APP/PS1 fareler LTP indüksiyon mekanizmaları (hayır plastisite açığı) işlevsel sağlam olabilir, ama yetersiz, bu koşullar altında (verim açığı) uyarılır. Bu ayrım, hacmi ve plastisite mekanizmaları mekanizmaları belirli bir farmakolojik tedavi çok farklı tepki olarak kritik öneme sahiptir. Biz LTP stimülasyon öncesinde tüm dilimleri boyunca aynı seviyede (örneğin 1 mV) EPSP genlik normalleştirilmesi LTP indüksiyon azaltılmış throughput etkisini en aza indirmek için çalışıyoruz. Diğer stratejiler de etkili olabilir (örneğin, voltaj ya da akım kelepçe kullanımı LTP stimülasyon sırasında gruplar arasında membran potansiyeli eşitlemek için) ve bu hayvan modellerinde LTP soruşturma zaman düşünülmelidir.

Disclosures

Bu video-makale üretim Leica Microsystems tarafından sponsor oldu.

Acknowledgements

NIH hibe AG027297, bir ödül Kentucky Omurilik ve Kafa Travması Araştırma Güven, ve hediye Kléberg Vakfı tarafından desteklenen çalışın.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific BP358-1
KCl Fisher Scientific BP366-500
KH2PO4 (monobasic) Sigma-Aldrich P5379-100G
MgSO4 Sigma-Aldrich M2643-500G
CaCl2 (dihydrate) Sigma-Aldrich C3306-250G
NaHCO3 Fisher Scientific S233-500
C6H12O6 (dextrose) Fisher Scientific BP350-1
Table 1. Reagents required
Erlenmeyer Flasks Fisher Scientific FB-500-2000 FB-500-1000
Aquarium Bubbler Used for oxygenating media. Available at most pet stores
50 mL Glass beaker Fisher Scientific 02-540G For brain storarge in ACSF
Parafilm Fisher Scientific 13-374-10
Small Animal Guillotine World Precision Instruments, Inc. DCAP-M
Flat paper towel
#11 Feather surgical blade Fisher Scientific 08-916-5B
Beebee bone scissors Fine Science Tools 16044-10
Lempert Rongeurs Roboz Surgical Instruments Co. RS-8321 Use for rats
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16020-14 Use for mice or rats
Hippocampus tool Fine Science Tools 10099-15
Spoon A plastic teaspoon will do
Spatula Fisher Scientific 21-401-25A Spatula
Surgical iris scissors Fine Science Tools 14058-09
plastic transfer pipets Fisher Scientific 13-711-43
110mm Whatman filter paper Fisher Scientific 09-805E Whatman cat. 1001-110
Glass petri dish Fisher Scientific
Leica VT1000P Manual Vibrating Microtome Vibratome VT1000P
0.1mm FA-10 Feather S blade Ted Pella, Inc. 121-9 0.1mm FA-10 Feather S blade
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (with rubber bulb) Fisher Scientific 13-678-20A For transferring slices: Tip is broken off and heat-polished for larger opening
35 mm Polysterine Culture dish Corning 430588 Used for collecting slices after dissection
Table 2. Tools and materials for dissection
Holding chamber Custom Made
P-97 Horizontal Pipette Puller Sutter Instrument Co.
Vibration isolation table Technical Manufacturing Corp.
Faraday cage Custom Made
Pyrex Aspirator Bottle with Bottom Sidearm Corning 1220-1L
Gravity-contolled IV set with regulator Baxter Internationl Inc. 2C8891
Central Vacuum Line Available in most modern labs
95% O2 / 5% CO2 Gas Mix Scott-Gross Co.
TygonTM Lab tubing For O2/CO2 delivery Fisher Scientific Non-toxic, non-oxidizing, comes in a variety of sizes.
Eclipse E600FN Microscope Nikon Instruments with 10x and 40x objectives, near infared filter, and GFP,DS-Red2 filters
Cool Snap ES Digital Camera Photometrics Cool Snap ES Digital Camera
X-Cite Fluorescent Illuminator EXFO X-Cite Fluorescent Illuminator
Microscope Platform Siskiyou, Inc. Custom assembled
RC-22 Submersible recording chamber Warner Instruments 64-0228 Requires P-1 platform and stage adaptor (Product # 64-0277 From Warner)
TC2BIP 2/3Ch Temperature controller Cell Microcontrols
4 Axis Manual Miniature manipulator Siskiyou, Inc.
Platinum Iridium Wire (0.002 in) World Precision Instruments, Inc. PTT0203
A365 Stimulus Isolator World Precision Instruments, Inc. A365 Stimulus Isolator
Multiclamp 700b Amplifier Axon Instruments
Digidata 1322A A/D converter Axon Instruments
PClamp software Axon Instruments
Personal Computer (Pentium 4) Dell
Table 3. Electrophysiology equipment and materials

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging. J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).
  2. Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging. J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).
  3. Norris, C. M. Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging. Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).
  4. Burke, S. N., Barnes, C. A. Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics. Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).
  5. Foster, T. C. Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain. Aging Cell. 6, 319-325 (2007).
  6. Foster, T. C., Norris, C. M. Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity. Hippocampus. 7, 602-612 (1997).
  7. Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store. Aging Cell. 6, 307-317 (2007).
  8. Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease. J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).
  9. Green, K. N., LaFerla, F. M. Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease. Neuron. 59, 190-194 (2008).
  10. Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1. J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).
  11. Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels. J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
  12. Norris, C. M., Scheff, S. W. Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury. J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).
  13. Sama, M. A. Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity. J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).
  14. Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice. Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).
  15. Bear, M. F., Malenka, R. C. Synaptic plasticity: LTP and LTD. Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).
  16. Foster, T. C. Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline. Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).
  17. Foster, T. C., Kumar, A. Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats. Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).
  18. Hsu, K. S. Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation. Hippocampus. 12, 787-802 (2002).
  19. Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. 17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats. Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).
  20. Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. NFATs and Alzheimer's Disease. Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).
  21. Abdul, H. M. Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling. J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).
  22. Anantharaman, M. Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease. Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).
  23. Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice. PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).
  24. Stringer, J. L., Lothman, E. W. In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses. Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).
  25. Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats. J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).
  26. Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE. J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).
  27. Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release. J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).
  28. Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity. J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).
  29. Thibault, O., Landfield, P. W. Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging. Science. 272, 1017-1020 (1996).
  30. Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability. J Neurosci. 24, 508-513 (2004).
  31. Stutzmann, G. E. Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).
  32. Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats. Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).
  33. McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents. Brain Res. 157, 277-293 (1978).

Comments

30 Comments

  1. A great protocol and discussion. What kind of stimulating electrode do you use?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 3, 2011 - 12:16 PM
  2. Thank you Louise. We use platinum iridium wire to make a bipolar electrode. The last time we purchased this wire we used World Precision Instruments (cat # ptt050²). Let me know if you need any other info

    Reply
    Posted by: chris n.
    May 3, 2011 - 12:54 PM
  3. Great protocol. However, I have got a problem. I can observe huge fiber volleys but with small or no EPSPs. Do you know what could be the problem? Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 11, 2011 - 10:57 AM
  4. Hi Olivier. Thanks for the kind words. In re to huge FVs and small EPSPs...Sometimes the fix can be as simple as tweaking the placement of your stimulating and recording electrodes (e.g. adjusting the depth and distance between trodes). However, if you've tried this and are still having problems there are a few possibilities. It could be that the tissue is being damaged and/or mishandled during the dissection/slicing procedure. As we mentioned in the protocol above, tissue from old animals and amyloidogenic animals tends to be a little more vulnerable to damage caused by the slicing procedure. If you haven't already, you may try dissecting a young adult mouse/rat (31 C). EPSPs are generally smaller at colder temperatures. 3)Make sure the pH of the incubation/recording medium is between 7.35 and 7.45. In the past, I've found that slices tend to exhibit big FVs and small EPSPs when they're sitting in media with a low pH (<7.3). 4) Make sure the slices are getting oxygenated efficiently DURING incubation, else they will die :). Usually, if oxygenation is good during incubation, but poor during the recording, the slices start off looking good but then become hyperexcitable as the experiment progresses. I hope this info helps. If you've tried all these fixes with no luck, feel free to email me.

    Best,

    Chris

    Reply
    Posted by: chris n.
    October 11, 2011 - 12:52 PM
  5. Hi Chris,

    Thank you very much for your response but I think still need to bother you again. Indeed, it dŒs not seem to be related to the age of the animals. I think my slice are ok even if I use a McIlwain slicer. Indded, I had some responses last week (from 0.² to ² mV with immerged slices). Artefacts and fiber volleys were small compared to the responses. Now I can't see anymore proper responses (or very rarely) and as I said before, the amplitude of the fiber volley is huge (0.5-² mV) even for small stimulations. Moreover, it has two components a positive and a negative one. The artefact of stimulation became incredibly huge e.g 35 mV for a 100 us stimulation at 500 uA. Would you have any suggestion? I will test my headstage with the model cell. Thank you very much.

    Best regards,

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2011 - 2:42 PM
  6. Hi Olivier, sorry for the late response. If you wanted to send me a picture of your EPSP waveforms to my email address (should be listed somewhere above or on the .pdf), I'd be happy to take a look at them. If you send this to me, please include information on the type of stimulator unit and electrodes your using as well as your ACSF composition.
    Best,
    Chris

    Reply
    Posted by: chris n.
    October 18, 2011 - 12:12 PM
  7. Dear Chris,

    I have finally found the solution. Everything is working perfectly now. It was an issue with the glue I used for my holding chamber. Thank you again for your precious help.

    Kind regards,

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 19, 2011 - 5:18 AM
  8. Dear Olivier,
    I am having the exact same problem as you. Would you please be more specific about how you were able to correct it? It would be so helpful!
    Best regards,
    Cristiane

    Reply
    Posted by: Cristiane T.
    July 12, 2012 - 11:58 AM
  9. Dear Cristiane,

    As explained in me previous message my problem of poor viability and small responses was related to the holding chamber to keep the slices at 35°C before experimenting. However, low viability can be due to many other reasons. You should work fast, in presence of AMPA and or NMDA blocker (or low sodium solution). You should avoid to fold the hippocampal tissues etc....

    Hope it will help.

    Reply
    Posted by: Olivier P.
    July 16, 2012 - 4:12 AM
  10. Hi every body, i was really so glad when i see your web site, and i want offer my thanks for your great site.
    i am from shefa neuroscience research center in iran where managed by proff. ALI GORJI who one of the first person worked on spreading depression in the world.
    i am working on Spreading Depression too and use LTP technique.
    please contact with me by e-mail for Future cooperation.
    Best Regard
    ahmad ali

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2011 - 10:56 AM
  11. Hi, I got a problem with my hippocampal slice recording. When I just transferred my slices from that incubation beaker into recording chamber, a large fEPSP response can be recorded, but after sitting in that chamber for a while, the response tended to become smaller even disapper compared with that when slices were just put in chamber. I have tried to adjusted the rate of oxygenation and temperature to ensure sufficient oxygen supply and correct temperature. I can garantee that oxygen supply has no problem and temperature is in normal range (²6 -30 C). But the problem is still there. Somebody told me that is cause by a "heat shock" when slices are transferred to a warmer enviornment. Can you help to resolve this problem?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 13, 2012 - 7:03 PM
  12. hi, you should put your slice in chamber(²8- 30c) for 1 hour after you get slice. And after that you should transfer your slice to second chamber( LTP chamber) in 3²c.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 3, 2012 - 11:48 AM
  13. Hi,

    I suppose you can't record at 35°C, don't you? May be the problem is that your slice moves slightly during the recording. Did you try to change the position of your recording electrode to see if you can recover a response with the initial amplitude?

    Olivier

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 1:21 PM
  14. Yes, I did. I move the recording electrode to several different positions trying to elicite a good amplitude. But the problem is still there. I have noticed that after sitting in the recording chamber for a while, the slices tended to lost activity. No matter where you put the recording electrode, you cannot recover a good amplitude as the initial one. I suspected that was caused by a slow flow rate, which is 1.5-² ml/min in my chamer. My chamer is different from others, because I currently use a blind method to record fEPSPs and eEPSCs. So my chamber is bigger than others with approximately 1-² ml volume for fluid exchange. I am trying to increase that flow rate to ².5-3 ml/min to see what will happen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 17, 2012 - 3:26 PM
  15. Hi, sorry to hear about the problems you're having. Are your slices submerged in the recording chamber or at an interface with the air? Is your stimulus artifact changing, or just the synaptic response? What about the fiber volley, dŒs it die too? How do you know that the oxygen levels in your media are adequate? If your recording chamber is wide and your bath shallow, that would provide quite a bit of surface area for the oxygen to escape. Testing the bath pH with a micro pH meter would help determine if O² levels are stable. If you're worried about heat shocking the slice when you transfer it to the recording chamber, you could try slowly bringing the temperature of the media in your holding chamber up to recording temperature during the incubation period (maybe raising it 1 or ² degrees every 10-15 min).

    Reply
    Posted by: chris n.
    January 17, 2012 - 3:56 PM
  16. Hello again, I want to know the distance between stimulating electrode and recording one in your experiments. Some people put them in a very short distance (²00-300 micrometers). In my experiments, I usually put the stimulating electrodes at the initial part of the schaffer collateral fibers in CA1 area, and put that recording ones at a site as far as possible to avoid the large artifacts, but sometimes I was unable to get a stable LTP after HFS. I believe the reasons for that might be that many neural circuits are activated during HFS including inhibitory ones, because more circuits can be activated simultaneously with the increased distance. Is that correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 25, 2012 - 5:03 PM
  17. I need more detail, since I am still facing some problem.

    Reply
    Posted by: Zaman K.
    February 9, 2012 - 2:38 AM
  18. Finally, I found out the problem that leads to loss of viability of the hippocampal neurons in my experiment. It was caused by my chamber, which is so different from others. It has a very large volume, with a large surface. So I was assuming that my problem was caused by the anoxia resulted by rapid diffusion of ACSF into the large shallow surface. I already increase the flow rate to ².5 ml/min in my previous chamber, but still had that problem. So I made a polycarbonate slice chamber according to Warner company's criteria. Now I can get a pretty stable response throughout my experiment.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 2:02 PM
  19. What is the significance of air interface vs. submerged slices, is one better than the other?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 2:38 PM
  20. BTW, the criteria to judge the anoxia is the production of bubble in the chamber. If you see the bubble present in the chamber, that means the ACSF is oxygen-saturated. Heating makes the extra oxygen escape from the solution. If not, the ACSF is not saturated by oxygen.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2012 - 3:10 PM
  21. Good for morale to read that I'm not the only one having problems with acute slices. Due to the comments above I'm going to try a few new things with my set-up. It MIGHT just be the oxygen-saturation, since I pre-heat the ACSF to 4² Celsius, trying to record at ~34 Celsius AND have a relative large chamber. Temperatures are experimental variables of the design.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 28, 2012 - 11:15 AM
  22. Increasing the perfusion rate to 4 ml/min and changing to a bath that is diamond shaped and has a far lower volume were the solution. Getting a decent signal is still something of a black magic. =/

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 13, 2012 - 7:14 AM
  23. Thank you for sharing your protocol - excellent video.

    Is there an advantage to dissecting out the hippocampus before slicing, as opposed to slicing the whole brain (or one hemisphere of the brain)?

    If I am not mistaken, you cite "netting" in the bottom of the recording chamber. DŒs that mean that the slice is suspended off of the bottom of the chamber?

    Is the resistance of the recording pipette a critical factor?

    Thank you,

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 24, 2012 - 5:33 AM
  24. Hi Chris, sorry for the late reply. For rats, whole hemisphere slices are fairly large and can be a bit of a problem if you have small recording and holding chambers. Also, the hippocampus in an adult rat is fairly easy to dissect away. For mice, on the other hand, the hippocampus is very small and a little trickier to dissect out (though it can certainly be done effectively). You can therefore save time by simply slicing the whole mouse hemisphere into sections. And unlike the rat, whole hemisphere mouse slices aren't so big that they are difficult to work with and store. In re to netting: yes we do use netting, which raises the slice off of the bottom of the dish. In re to the recording pipette resistance: we typically use smaller tip diameters to minimize damage to the recording region of the slice.

    Reply
    Posted by: chris n.
    June 19, 2012 - 4:36 PM
  25. Hi, Prof. Norris:
    Great protocol to follow and precious comments to refer to. As a beginner to this tech, I have a few questions in my mind.
    1. Some papers claimed that they used sucrose-ACSF(0 Na 0 Ca) as the dissection medium, some even put AMPAR/NMDAR blocker(i.e. Kynurenic acid) and/or ascorbic acid in. According to your experiences, is there any difference btw sACSF and normal ACSF to the slice health? Is postsynaptic blocker and/or ascorbic acid necessary?
    ². In some literatures, they used different ways of anesthetization, such as barbiturates, TCA, ether, isoflurane, halothane etc. DŒs anesthetizing method affect the slice quality and the electrophysiological results? In this paper, you used CO², were there any possibility that the brain might get some anoxia-like influence or damage?
    3. For holding and recording temperatures, I found variable ways in different papers, is there any general principle of how to set the proper temperatures? In your paper, after slicing all the brain sections(put in ice cold 0Ca ACSF temporally), and tranfering them to ²7degree and gradually elevating temperature, is my understanding correct? Could you please tell me how much time will each step take(i mean, "cutting"->"temporally storage"->"recovery solution")?
    4. What are the proper cutting speed (mm/min) and vibrating frequency for hippocampal slices?
    5. what cutting direction is proper? longitudinally from CA3 corner to DG corner or the opposite, or laterally across hippo? or it dŒsn't matter?
    Thanks so much!
    sincerely,
    Hang

    Reply
    Posted by: Hang Z.
    January 30, 2013 - 8:13 PM
  26. I have another question:
    6. In re to literatures, some used bipolar twisted electrodes and some used concentric electorde, do you have some comments to these two types?

    Reply
    Posted by: Hang Z.
    January 30, 2013 - 8:21 PM
  27. i am very interesting the custom brain slice holdiing chamber, would you mind sharing the supplier?
    Thank you.

    Reply
    Posted by: CHIA S.
    March 26, 2013 - 3:23 AM
  28. Hi,

    I was very excited when I came across this video/article today, since my Masters project is going to be entirely based on recording after LTP induction on adult mouse hippocampi in vitro.

    I have just started trying to obtain decent slices, and have only gotten so far as extracting the brain from the mouse with acceptable quality. All that comes after has been a little bit frustrating so far. So, I have a few questions regarding the slicing step itself (we have the very same vibratome at our lab, which makes things easier, I guess!):

    - Every time I try to slice the brain, the blade actually pushes the brain away instead of cutting through it! This leads to either a completely useless slice or not even that, as the blade will only cut the last few milimiters of the brain and yield something not even worth calling a slice! The blades are brand new, but I bought them at a drugstore and they were intended to be shaving blades. Might that be the issue, a blade not sharp enaugh?

    - I haven't yet tried separating the hemispheres. Maybe I should do that!

    - I see you use this little block onto which you glue the brain (hippocampus, in your case). I've been using a sort of plate attached to the vibratome, which gŒs in the same place as the block. Do you reckon the block is a better call?

    - Do you have a better method for drying the cutting chamber after using it than letting the ice thaw and then sucking it up with vacum?

    If there are any remarks you should think of that haven't been shown in the video regarding the actual slicing step, I'd apreciate if you could share!

    Best regards,

    Thomaz Dias
    UFMG - Brazil

    Reply
    Posted by: Thomaz L.
    March 28, 2013 - 5:16 PM
  29. Great information here. I have a quick question about the aCSF containing bottle; would you keep it at room temperature or in a water bath at 34 degrees C?

    I will be recording at 34 degrees with a recording chamber heater and was wondering what would be the best way to hold the aCSF that is coming into the chamber?.

    I know there is an inverse relationship with dissolved oxygen and temperature in water, but would it be better to have it constant in the bottle and chamber or best to have it room temperature in the bottle and warm upto 24 degrees in the chamber?

    Any advice would be much appreciated.

    Minos

    Reply
    Posted by: Minos K.
    July 12, 2013 - 11:50 AM
  30. Hi
    Your projects are amazing. Oh here I can’t help sharing some experience of fabrication after designs done.
    We are working with a OverMolding vendor in China the name is Zetar Industry (http://www.zetarmold.com), Located in Shanghai China (a very big modern city). They are really good.Moving fast and very professional. They helped me with my new design. I asked them to do the injection mold, then Injection Moldingmass production. I was surprised by their rich experience in Insert Molding
    and punched lead time. Guys in Zetar deserve every good word just as you are.

    Reply
    Posted by: info z.
    September 2, 2013 - 11:16 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats