Индукция и мониторинг активных гиперчувствительность замедленного типа (DTH) у крыс

Published 7/19/2007
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Замедленного типа гиперчувствительности (DTH) является воспалительная реакция опосредована CCR7-эффекторные лимфоциты памяти T. Здесь показано, как вызвать активный DTH у крыс Льюиса и контролировать воспалительную реакцию.

Cite this Article

Copy Citation

Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and Monitoring of Active Delayed Type Hypersensitivity (DTH) in Rats. J. Vis. Exp. (6), e237, doi:10.3791/237 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Замедленного типа гиперчувствительности (DTH) является воспалительная реакция опосредована CCR7-эффекторные Т-лимфоциты памяти, что проникнуть в месте введения антигена, против которого иммунная система была загрунтовать. Воспалительная реакция характеризуется покраснением и отеком сайт антигенный вызов. Это удобная модель для определения в естественных условиях эффективность иммунодепрессанты. Кожные DTH могут быть вызваны либо приемных передачи антиген-специфические Т-лимфоциты или активной иммунизации с антигеном, и последующие внутрикожные проблема с антигеном, чтобы вызвать воспалительную реакцию в данной области кожи. DTH реакции могут быть вызваны на различные антигены, например, яичный альбумин, туберкулин, столбняка, или замочную скважину блюдечко гемоцианин (KLH).

Здесь показано, как вызвать активную реакцию в DTH Льюис крыс. Мы сначала подготовить водно-нефтяной эмульсии из KLH, наш антиген представляющих интерес, в полном адъюванте Фрейнда и придать этой эмульсии подкожно крыс. Это будет премьер иммунной системы, чтобы развить память Т-клеток, направленных на KLH. Семь дней спустя мы будем вызов крыс внутрикожно на спине с KLH с одной стороны и с овальбумина, не имеет значения антиген, с другой стороны. Воспалительная реакция будет виден 16-72 часов спустя и красные и опухшие области будет оцениваться как указание DTH тяжести.

Protocol

1. Подготовка эмульсии

  1. Эмульсия смеси 1:1 антигена (DTH могут быть вызваны на различные антигены: яичный альбумин, столбняка, замочную скважину блюдечко гемоцианин ....) в водном растворе добавляется полный адъювант Фрейнда. Это очень важно, чтобы добавить антигена адъювантной а не наоборот!

  2. Существует большое количество отходов при принятии и потребителей инъекционных эмульсии, поэтому всегда готовятся 1,5 или 2 раза больше, чем то, что вам нужно.

  3. Растворите антигена в физиологическом растворе для подготовки 2 мг / мл раствора. Не фильтровать, а вы не хотите потерять агрегатов!

  4. Положите Фрейнда адъювантной H37Ra (Difco, каталог # 231131) в трубку и вихря на высокой скорости. Добавить антигена по капле в то время как вортексе. Когда все антиген добавил, вихревые еще 5 минут. Смесь должна стать белым.

  5. Положите эмульсии в стеклянный шприц и связать его с другой стеклянный шприц использованием моста 18G (Fisher Каталог № 14-825-17L). Отправить эмульсии из шприца в другой, пока не становится трудно (5-10 мин). Лучше всего использовать два 5 мл шприцев. Если более 5 мл эмульсии необходимо, использовать несколько наборов 5 мл шприцев.

  6. Эмульсии могут быть сохранены в шприцах при 4 ° С в течение 3 недель.

2. Иммунизация крыс

  1. Смешайте эмульсии в шприцы в течение нескольких минут и трансфер в шприц для инъекций. Inject 200 мл подкожно в течение 1-2 сайтов в основании хвоста использованием 23G иглы и Луер-Лок наконечник 3 мл шприца.

3. Вызов с антигеном в спину

  1. Семь дней после иммунизации, бриться два пятна на спине крысы и вводят внутрикожно 20 мл 1 мг / мл раствора антигена в одном месте и физиологического раствора (или не имеют отношения антиген) в другое место. Не фильтровать антигену решение, как вы можете потерять агрегатов, которые усиливают воспалительные реакции.

  2. Крысы должны быть anesthesized, чтобы избежать движения. Inject решение внутрикожно использованием 27G ½ иглы и шприцы 1 мл. Изменение иглы между инъекциями.

    Примечание: эта задача может быть сделано в ушной раковины из ушей вместо того, чтобы вернуться к более точные измерения. Смотрите видео на http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=325

4. Измерение DTH

  1. Инъекции начнет становится красным и отек как признак воспаления. Измерьте диаметр воспаленной области с помощью линейки или, еще лучше, суппорта. Максимальное набухание должно произойти между 24 и 72 часов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для более точного измерения DTH реакцию мы рекомендуем сложных крыс с антигеном в ушной раковины из уха. Реакция может быть измерена как разница в ухе опухоль между соответствующим антигеном оспаривается уха и ухо оспаривается ни с солевым в одиночку или с антигеном не имеет значения. Демонстрация проблемой в ухо показано на рисунке 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы соучредителей и консультантов для Airmid ООО

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s adjuvant H37Ra Reagent Difco Laboratories 231131 Distributed by Fisher under catalog # DF 311-360-5
Keyhole Limpet hemocyanin Reagent Sigma-Aldrich H-5654
Ovalbumin Reagent Sigma-Aldrich A-5503
5 ml glass syringes Tool Fisher Scientific 14-823-10 B Need two 5 ml syringes for each batch of 5 ml of emulsion
18G metal bridge Tool Fisher Scientific 14-825-17L
Lewis rats Animal Harlan Laboratories Female rats 7-9 weeks old
23G 1" needles Tool Fisher Scientific 14-826 AA It is best to change needles between rats
3 ml Luer Lock syringes Tool Fisher Scientific 05-561-63
DPBS Reagent GIBCO, by Life Technologies 14040-182
1 ml regular tip syringes Tool Fisher Scientific 22-257-154
27G 1/2" needles Tool Fisher Scientific 14-826-48
Electric cordless trimmer Tool Braintree Scientific, Inc. CLP-32130 To shave the rats before antigen challenge in the back.
Use sterile solutions reagents and syringes. The glass syringes and 18G bridges can be autoclaved. Read material data sheet before handling a reagent for the first time and wear appropriate protective equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forthcoming.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats