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小鼠神经嵴干细胞的培养鸡胚提取物的生产

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Neuroscience

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Summary

要在体外培养的神经嵴干细胞(NCSC),一种特殊的介质(NCSCM)是必需的。 NCSCM的重要组成部分,是鸡胚提取物(CEE)。在这里,我们描述准确的技术,生产的纯正和高品质的中欧和东欧的最大数额,包括隔离,浸渍,离心,过滤过程的详细信息。

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Pajtler, K., Bohrer, A., Maurer, J., Schorle, H., Schramm, A., Eggert, A., Schulte, J. H. Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells. J. Vis. Exp. (45), e2380, doi:10.3791/2380 (2010).

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Abstract

来自神经外胚层神经嵴的胚胎发育过程中,仍然存在只是暂时的。早期的实验已经隔音多潜能的祖细胞神经嵴1是一个不可分割的一部分。表型,神经嵴干细胞(NCSC)的定义,同时表示在他们从神经嵴迁移 2,3,4,5的P75(低仿射神经生长因子受体,LNGFR)和SOX10。这些祖细胞,能分化成平滑肌细胞,嗜铬细胞,神经元和神经胶质细胞,以及黑色素细胞,软骨骨6,7,8,9。要培养非公务员合约雇员在体外实验中 ,一个特殊的神经嵴干细胞的培养基(NCSCM)是必需的10。 NCSCM最复杂的部分是编制鸡胚提取物(CEE)的代表的非公务员合约雇员,以及其他类型的神经植生长因子的重要来源。旁边的中欧和东欧的其他NCSCM成分均为市售。生产的CCE使用实验室标准的设备,它的高度重视是了解隔离,浸渍,离心,过滤过程中具有挑战性的细节。在这个协议中,我们描述了准确的技术,生产的纯正和高品质的中欧和东欧的最大数额。

Protocol

作者状态,对动物的实验是根据欧洲共同体理事会指令(86/609/EEC),美国国立卫生研究院的机构动物所规定的实验程序和法规的动物护理和使用准则保养和使用委员会(IACUC)在杜伊斯堡 - 埃森大学(德国)。

第1部分:设置(视频所示)

准备材料和解决方案(前鸡蛋孵化器)

  • 鸡蛋必须在培养箱培养11天,于37℃(100℉)。
  • 70%的乙醇喷雾,洁净板,精确的清洁钳,4 ° C(40 ° F)的冷无菌冰DMEM和60毫升无菌注射器
  • 50 ml无菌康宁管必须有4个半满° C冷DMEM培养液以1:1的比例(浸渍质量:DMEM)混合浸渍胚胎。只要鸡蛋是鸡胚的孵化器清扫已经开始。
  • 消毒的高压灭菌器或一天清扫的清扫工具,沉浸在70%乙醇20分钟的工具。

第2部分:夹层鸡胚(视频演示)

  1. 湿至少30秒,用70%乙醇喷雾的孵化鸡蛋,干后用干净的软纸巾仔细而不是晃动鸡蛋过分。
    注意:我们建议不超过60鸡胚同时解剖。
  2. 打开鸡蛋仔细横飞对锋利的边缘,并采取了谨慎不破坏胚胎的黄麻袋或鸡胚本身。
  3. 脐带迅速开始搜索和明确的包装不破坏蛋黄麻袋或任何一个小的船只开放。然后解剖精确的清洁钳的脐带。
  4. 以胚胎蛋黄麻袋。
    注:胚胎应迅速断头(在视频中未显示) 。
  5. 收集胚胎在最短的重要介质,在4 ° C。

第3部分:浸渍鸡胚

  1. 以60毫升无菌注射器的柱塞。
  2. 约10胚胎转移到一个60毫升注射器。
  3. 小心把柱塞进入注射器,为了不失去浸渍材料的风险。
  4. 浸渍倒推柱塞。
  5. 康宁用DMEM半满的比例1:1(浸渍群众:DMEM培养)管在准备收集浸渍质量。使用约25毫升的体积是10胚胎生产。
  6. 在4 ° C为45分钟的混合物放置在摇床

第4部分:离心鸡胚 - DMEM培养液暂停

  1. 传输鸡胚 - 到离心管的DMEM悬浮。
  2. 添加无菌透明质酸酶浓度1毫克每25毫克的胚胎。
  3. 皮的离心管非常精确。
    注意:这一步,应谨慎进行离心运行在非常高的G - Force和材料或离心机可能发生,如果使用不平衡管损坏。一个高准确度称重机按照关于三个所有管的小数点后应该用DMEM调整失踪金额收到的职位。
  4. 离心机的温度降低到4 ° C。
    注:离心转子也应存放在一个冷却室或冰箱过夜。
  5. 离心机6个小时,至少为每小时180.000 xgx注:对于单相分离的骄人业绩,使用266.000 xgx H.如果可能的话,使用真空调整。

第5部分:鸡胚提取物过滤

离心后,三个阶段可以注意到:上灰溜溜的脂肪片段在中间,明确液相和颗粒在离心管底部的液相注意 :摇晃或移动轻快的离心混合物严格避免,因为这将破坏,失去了明确的中央液相的离心步骤的结果。

注:以下所有步骤都必须在无菌条件下使用空气层流替补执行:

  1. 移液器0.45微米的孔进入过滤系统,明确的液相。然后交换机上连接的真空泵。
    注意:请勿触摸底部的沉淀。这将导致提取物的污染和堵塞过滤系统。
  2. 转移到0.22微米和交换机连接真空泵再次毛孔与过滤系统的预提取。
  3. 分装的取得鸡胚提取物在无菌15毫升康宁管。
  4. 快速的分装保存于-80 ° C(-62 ° F)。注:中欧和东欧的最后两年,如果保存于-80 ° C。

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Discussion

该协议是基于已在过去的10,11中所述的程序进行修改。除了前出版物,我们在这里展示个人更加扩大的过程中不同步骤。支持重要的细节,确保正确的程序和可靠的结果,实验者。此外,由于解剖过程是中欧和东欧提取的重要组成部分,我们描述蛋黄麻袋的胚胎中的每一个细节的过程。有几个重要的点要注意下面讨论。

解剖鸡胚孵化结束后应尽快开始。胚胎死到清扫前,不应该用于本议定书作为酶的活化和蛋白降解的任何步骤,可能会造成不利影响。

在开始之前有些手培训,应作为解剖过程的所有步骤进行快速,准确地执行。重要的是整个过程的成功,避免污染是伴随着一个值得注意的负面干扰蛋白质与蛋黄。后胚胎蛋黄麻袋,他们应该迅速断头(在视频中未显示)。

温度以及Celerity的转子是非常重要的的。为了避免酶的活化和减少NCSCM需要因素的质量和数量的离心机转子的温度应减少到4 ° C。明确中央液相后离心步骤是重要的先决提取物含有的NCSCM增长的基本因素。要达到一个相当大的不同组分的分离和富集的因素,需要我们建议Celerity的不低于180.000 xgx H.

由于之间的透明液体相,离心管顶部灰溜溜的液相密度差异并不妨碍混音两部分,要避免任何晃动。灰溜溜液相的组成部分,不能用0.45微米的过滤系统过滤掉,因为它的脂肪部分会很快导致过滤系统堵塞。离心机的底部还沉淀在不应该在所有被感动,因为它的某些部分会导致过滤系统堵塞。

在最后一步中东欧NCSCs种植的潜力已被验证。这种干细胞的多能的流动人口,而无需添加足够的生产中东欧失去​​其在媒体的可行性迅速。因此,它表达了一个基因的活性依赖性早期的非公务员合约标记和用于非公务员合约雇员的生物学研究转基因小鼠线(JoMa1)是种植在新获得的每一个东欧10负责。培育成功的NCSCs代表中欧和东欧的一个适当的验证。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

马库斯Pajtler和罗伯特Bohrer的支持和意见,对本议定书的可视化,是具有非常重要的价值。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11 days incubated chicken eggs Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Alcoholic disinfection spray Schülke Mayr GmbH
DMEMGlutamax GIBCO, by Life Technologies
Syringe sterile (60 ml) BD Biosciences
Tubes sterile (50; 15 ml) Greiner Bio-One
Pipet tips sterile Starlab GmbH
Hyaluronidase typeIV-S Sigma-Aldrich
Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) Fisher Scientific
Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) Greiner Bio-One
Centrifuge L5-50 Rotor type Ti-45

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References

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Comments

2 Comments

  1. Has anyone systematically tested CEE from different ages of embryo, and dŒs this effect cell behaviour in any major way?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 8:07 PM
  2. Dear Dr. Newgreen,

    thank you for your comment!
    We have regularly obtained CEE from eggs being incubated for 11 days. Subsequent cultivation of NCSCs mostly confirmed a successful preparation of CEE. However, we have not systematically tested CEE from different ages of embryo.
    Kind regards
    Kristian

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2011 - 6:39 AM

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