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La producción de extracto de embrión de pollo para el Cultivo de murino crestas de células neurales madre

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Neuroscience

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Summary

Para cultivar las células troncales de la cresta neural (NCSC) in vitro, un medio especial (NCSCM) es necesario. Parte esencial de NCSCM es el extracto de embrión de pollo (CEE). Se describen las técnicas precisas para producir una cantidad al máximo de calidad en estado puro y de alta CEE, incluyendo detalles como el aislamiento, la maceración, la centrifugación, y los procesos de filtración.

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Pajtler, K., Bohrer, A., Maurer, J., Schorle, H., Schramm, A., Eggert, A., Schulte, J. H. Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells. J. Vis. Exp. (45), e2380, doi:10.3791/2380 (2010).

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Abstract

La cresta neural nace de la neuro-ectodermo durante la embriogénesis y persiste sólo temporalmente. Los primeros experimentos ya prueba de las células progenitoras pluripotentes a ser una parte integral de la cresta neural 1. Fenotípicamente, las células troncales de la cresta neural (NCSC) se definen por la vez que expresa p75 (bajo afín crecimiento de los nervios del receptor del factor, LNGFR) y SOX10 durante su migración desde la cresta neural, 2,3,4,5. Estas células progenitoras pueden diferenciarse en células musculares lisas, células cromafines, neuronas y células gliales, así como los melanocitos, cartílago y hueso 6,7,8,9. Para cultivar NCSC in vitro, un especial de madre de la cresta neural medio celular (NCSCM) se requiere 10. La parte más compleja de la NCSCM es la preparación del extracto de embrión de pollo (CEE), que representan una fuente esencial de los factores de crecimiento para el NCSC, así como para otros tipos de explantes neural. Otros ingredientes NCSCM lado CEE están disponibles comercialmente. La producción de CCE de laboratorio con equipamiento de serie es de gran importancia para conocer los detalles difíciles como el aislamiento, la maceración, la centrifugación, y los procesos de filtración. En este protocolo se describen las técnicas precisas para producir una cantidad al máximo de calidad en estado puro y de alta CEE.

Protocol

Los autores afirman que los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo (86/609/CEE), siguiendo las directrices de los NIH sobre el cuidado y uso de animales en los procedimientos experimentales y los reglamentos establecidos por el Comité Institucional la atención y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Duisburg-Essen (Alemania).

Parte 1: Configuración (no se muestra en el vídeo)

La elaboración de materiales y soluciones (antes de tomar los huevos de la incubadora)

  • Los huevos que se incuban en una incubadora humidificada durante 11 días a 37 ° C (100 ° F).
  • 70% de etanol en aerosol, placas limpias, precisas pinzas limpias, 4 ° C (40 ° F) en frío estéril DMEM en hielo y 60 ml jeringas estériles
  • Tubos de 50 ml estéril Corning tiene que ser a medio llenar con 4 ° C frío DMEM para mezclar los embriones macerado en una proporción de 1:1 (en masa macerada: DMEM). Tan pronto como los huevos se sacan de la disección de la incubadora de los embriones de pollo tiene que ser iniciado.
  • Esterilizar las herramientas de disección en el autoclave o en el día de la disección, sumerja los instrumentos en el 70% de etanol durante 20 minutos.

Parte 2: La disección de los embriones de pollo (demostrado en el vídeo)

  1. Húmedo los huevos se incuban con un spray de etanol al 70% por lo menos durante 30 segundos y secarlos cuidadosamente con toallas de papel suave, mientras que los huevos no sacudir demasiado.
    Nota: Se recomienda la disección no más de 60 embriones de pollo al mismo tiempo.
  2. Abrir los huevos con cuidado por estrellarse contra un borde afilado y sacar el embrión con cuidado de no destruir el saco vitelino del embrión de pollo o de sí mismo.
  3. Busque el principio de que el cordón umbilical de forma rápida y abrir el envoltorio transparente, sin destruir el saco vitelino o pequeños vasos. A continuación, analizar el cordón umbilical con unas pinzas limpias precisa.
  4. Tome el embrión fuera del saco vitelino.
    Nota: Los embriones deben ser decapitados rápidamente (no se muestra en el video).
  5. Recoger los embriones en medio esencial mínimo a 4 ° C.

Parte 3: Maceración de los embriones de pollo

  1. Tome el émbolo de una jeringa de 60 mL estéril.
  2. Transferencia de aproximadamente 10 embriones en una sola jeringa de 60 ml.
  3. Ponga el émbolo con cuidado en la jeringa con el fin de no arriesgarse a perder el material macerado.
  4. Macerar por empujando el émbolo.
  5. Recoger la masa macerada en los tubos preparados Corning llenó medio con DMEM en una proporción de 1:1 (en masa macerada: DMEM). Con 10 embriones de un volumen aproximado de 25 ml se produce.
  6. Coloque la mezcla en un agitador durante 45 min a 4 ° C.

Parte 4: La centrifugación del embrión de pollo - Suspensión DMEM

  1. Transferencia de embrión de pollo - DMEM suspensión en los tubos de centrifugación.
  2. Añadir hialuronidasa estéril a una concentración de 1 mg por cada 25 mg de embrión.
  3. Tara de los tubos de centrifugación de manera muy precisa.
    Nota: Este paso debe realizarse con precaución, ya que la centrifugación se ejecuta en muy alto g-fuerza y el daño material o una centrifugadora, podría ocurrir si se utilizan tubos de desequilibrio. Con una alta precisión de pesaje de la máquina acuerdo con respecto a las tres posiciones después del punto decimal para todos los tubos deben ser recibidos por el ajuste de la cantidad que falta con DMEM.
  4. Reducir la temperatura de la centrífuga a 4 ° C.
    Nota: Además, el rotor de centrifugación deben ser almacenados en una cámara de refrigeración o refrigerador durante la noche.
  5. Centrífuga 6 horas por lo menos para 180.000 xgx h. Nota: Para obtener mejores resultados con respecto a la separación de las fases de un solo uso xgx 266.000 h. Si es posible, utilice el ajuste de vacío.

Parte 5: Filtración del extracto de Embrión de Pollo

Después de la centrifugación de tres fases se puede notar: La fase superior de líquido sucio con fragmentos de grasa, la fase líquida en el centro y el sedimento en el fondo del tubo de centrifugación. Nota: Temblor o movimiento rápido de la mezcla se centrifuga tiene que ser estrictamente evitados, ya que esto destruiría el resultado de la etapa de centrifugación por la pérdida de la fase líquida y clara central.

Nota: Todos los pasos siguientes deben llevarse a cabo en condiciones asépticas utilizando un banco de flujo laminar de aire:

  1. Pipeta de la fase líquida en un sistema de filtros con poros de 0,45 micras. A continuación, encienda la bomba de vacío conectada.
    Nota: No toque la bolita en la parte inferior. Esto daría lugar a una contaminación de la extracción y un bloqueo del sistema de filtro.
  2. Transferir el extracto pre-en un sistema de filtros con poros de 0,22 micras y el interruptor de la bomba de vacío conectada de nuevo.
  3. Alícuota del extracto obtenido de embrión de polloen tubos estériles de 15 ml Corning.
  4. Rápidamente almacenar las alícuotas a -80 ° C (-62 ° F). Nota: La duración de hasta dos años de Europa central y oriental, si se almacena a -80 ° C.

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Discussion

Este protocolo se basa en modificaciones de los procedimientos que se han descrito en el pasado 10,11. Además de las publicaciones anteriores que aquí muestran los distintos pasos diferentes del proceso de ampliación más. Esto apoya el experimentador con detalles importantes asegurando los procedimientos correctos y los resultados fiables. Además, como el proceso de disección es una parte esencial de la extracción de Europa central y oriental se describe el procedimiento de toma de los embriones fuera del saco vitelino en cada detalle. Hay varios puntos importantes que tenga en cuenta como veremos a continuación.

La disección de los embriones de pollo se debe iniciar tan pronto como sea posible después de la incubación ha terminado. Embriones estar muerto antes de la disección no debe ser utilizado para cualquier paso de este protocolo como la activación enzimática y la degradación de proteínas pueden influir negativamente en el resultado.

Antes de empezar una mano-en el entrenamiento se debe realizar como todos los pasos del proceso de disección que se llevará a cabo rápida y precisa. Es importante para el éxito de todo el procedimiento, para evitar la contaminación con la yema de huevo, que fue acompañado por una cantidad notable de interferir negativamente en las proteínas. Después los embriones fueron sacados de las bolsas de la yema deben ser decapitados rápidamente (no se muestra en el video).

Temperatura, así como la celeridad del rotor son muy importantes, también. Con el fin de evitar la activación enzimática y una reducción de la calidad y cantidad de los factores necesarios para la NCSCM la temperatura de la centrífuga y el rotor se debe reducir a 4 ° C. Después de la centrifugación de la fase líquida central es el paso importante antes de extracto que contiene los factores de crecimiento esenciales para la NCSCM. Para lograr una separación considerable de las diferentes fracciones y un enriquecimiento de los factores necesarios se recomienda no una celeridad menor de 180.000 xgx h.

Como la diferencia de densidad entre la fase líquida y la fase líquida sucia en la parte superior del tubo de centrifugación no impide que una remezcla de las dos partes cualquier temblor se debe evitar. Los componentes de la fase líquida sucia no puede ser filtrada a través de un sistema de filtro de 0,45 micras, ya que las partes grasas de los que muy pronto conducir a una obstrucción del sistema de filtro. También la bolita en la parte inferior de la centrífuga no se debe tocar en absoluto, como partes de la misma llevaría a la obstrucción del sistema de filtro.

En el último paso el potencial de la Europa central y oriental para el cultivo de CTCN tiene que ser validado. Esta población multipotentes transitoria de las células madre pierden su viabilidad rápidamente en los medios de comunicación, sin haber añadido adecuada producida Europa central y oriental. Por lo tanto, una línea de ratones transgénicos (JoMa1), que expresa marcadores tempranos de NCSC de manera transgénica-dependiente de la actividad y se utiliza para estudiar la biología NCSC se cultiva en todos los cargos nuevos obtenidos de Europa central y oriental 10. El cultivo exitoso de CTCN representa una validación adecuada de la CEE.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgements

El apoyo y asesoramiento de Markus Pajtler Bohrer y Robert fueron de gran valor para la visualización de este protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11 days incubated chicken eggs Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Alcoholic disinfection spray Schülke Mayr GmbH
DMEMGlutamax GIBCO, by Life Technologies
Syringe sterile (60 ml) BD Biosciences
Tubes sterile (50; 15 ml) Greiner Bio-One
Pipet tips sterile Starlab GmbH
Hyaluronidase typeIV-S Sigma-Aldrich
Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) Fisher Scientific
Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) Greiner Bio-One
Centrifuge L5-50 Rotor type Ti-45

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References

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  11. Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).

Comments

2 Comments

  1. Has anyone systematically tested CEE from different ages of embryo, and dŒs this effect cell behaviour in any major way?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 8:07 PM
  2. Dear Dr. Newgreen,

    thank you for your comment!
    We have regularly obtained CEE from eggs being incubated for 11 days. Subsequent cultivation of NCSCs mostly confirmed a successful preparation of CEE. However, we have not systematically tested CEE from different ages of embryo.
    Kind regards
    Kristian

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2011 - 6:39 AM

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