Expansão ex vivo de células tumorais T-reativa por Meios de 1/Ionomycin Bryostatin eo Common Gamma Cadeia Formulação Citocinas

JoVE Journal
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Um protocolo eficiente para a

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Foi relatado que pacientes com câncer de mama têm pré-existentes respostas imunes contra os seus 1,2 tumores. No entanto, tais respostas imunes não fornecem proteção completa contra o desenvolvimento ou a recorrência de câncer de mama. Para superar esse problema aumentando a freqüência de células tumorais T-reativa, a imunoterapia adotiva tem sido empregado. Uma variedade de protocolos têm sido utilizados para a expansão das células tumorais T específicas. Estes protocolos, no entanto, estão restritos ao uso de antígenos de tumor in vivo ex para a ativação de células T antígeno-específicos. Muito recentemente, citocinas gama comum cadeia, tais como IL-21 IL-2, IL-7, IL-15, e têm sido usados ​​sozinhos ou em combinação para o reforço da anti-tumor respostas imunes 3. No entanto, não está claro o que a formulação seria melhor trabalhar para a expansão das células tumorais T-reativa. Aqui apresentamos um protocolo para a ativação seletiva e expansão de tumor reativa as células T a partir do modelo de camundongo transgênico FVBN202 de carcinoma de mama HER-2/neu positivo para uso em terapia adotiva de células T de câncer de mama. O protocolo inclui a ativação de células T com bryostatin-1/ionomycin (B / I) e IL-2, na ausência de antígenos tumorais durante 16 horas. B / I imita a ativação de sinais intracelulares que resultam na ativação de células T através do aumento da atividade da proteína quinase C e cálcio intracelular, respectivamente 4. Este protocolo especificamente ativa as células tumorais T específicas ao matar células T irrelevante. As células B / I-T ativadas são cultivadas com IL-7 e IL-15 por 24 horas e, em seguida, pulsadas com IL-2. Após 24 horas, as células T são lavados, dividir e cultivados com IL-7 + IL-15 por mais 4 dias. Eficácia do tumor especificidade e anti-tumor do ex vivo células T expandida é determinada.

Protocol

1. Isolamento de linfócitos 5

  1. Nós isolar tumor de drenagem linfática ou baços de portadores de tumor FVBN202 camundongos transgênicos e preparar a suspensão única célula na gelada RPMI1640 suplementado com 10% de SFB. B / I ativação no resultado de polipropileno de 50 ml cônico tubos em um maior rendimento das células T em comparação com tubos de poliestireno. Quetamina e xilazina são injetados ip para anestesia. Deslocamento cervical é usada como um método de eutanásia.
  2. Cultura das células (10 6 células / mL) em meio completo contendo 15% FBS com bryostatin-1 (5 nM) e ionomicina (1 mM), juntamente com 80 U / mL de IL-2 (Peprotech) por 16 h.
  3. Lave as células três vezes com meio quente (37 ° C) e cultura em 10 6 células / mL em meio completo com IL-7 (10 ng / mL) e IL-15 (10 ng / mL) (Peprotech) por 24 h .
  4. Pulso as células com IL-2 (40 U / mL) por 24 h.
  5. Dividir as células e cultura-los com IL-7 e IL-15 (10 ng / mL) durante 4 dias. Alterar médio e dividir as células se necessário a cada 2 dias.

2. Determine Expansão de Células T Fold pela contagem de células e Análise de Citometria de Fluxo 5

  1. Contagem de células por microscopia de luz
    1. Prepare a diluição célula apropriada (1:100) em azul de tripano e adicione alguns mL em hemocitômetro
    2. Contagem de 9 quadrados e determinar o número total de células contagem de células através da divisão do número de câmaras, multiplicado pelo fator de diluição. Os resultados apresentarão um número x 10 4 células / mL.
  2. Determine proporção de CD8 + e células T CD4 + nas células expandidas por citometria de fluxo
    1. Bloco de ligação não específica de anticorpos para receptores Fc através da cultura as células com anticorpos anti-CD16/CD32 (Biolegend) por 20 min em gelo e em seguida, lave as células duas vezes com 2 mL de PBS gelado suplementado com azida de sódio a 1% .
    2. Mancha as células através da cultura com FITC-CD4 e CD8-PE anticorpos por 20 min em gelo e em seguida, lave as células duas vezes com 2 mL de PBS gelado suplementado com 1% FBS e azida sódica a 0,1%.
    3. Fixar as células com paraformaldeído 1% e executar amostras em um Beckman Coulter FC 500 e analisar usando a versão Summit 4,3 software.

3. Determine Tumor especificidade da Vivo ex Expanded Células T

  1. Cultura da expandidas ex vivo de linfócitos em meio completo em uma razão de 10:1 com irradiados neu células tumorais positivas MMC (15.000 rad) por 24 h. 5
  2. Sobrenadantes colher e armazenar a -80 ° C até sua utilização. 5,6
  3. IFN-γ detectar usando um mouse IFN-γ ELISA Set (BD PharMingen) de acordo com protocolo do fabricante. 5,6

4. Determine Anti-tumor Função do ex Vivo Células expandidas T 5,6

  1. Células T incube com células tumorais em um efetor 10:01: rácios-alvo por 48 horas em meio completo, 3 ml de meio completo (RPMI-1640 suplementado com 100U / mL de penicilina, 100μg / mL estreptomicina, 10% FBS, glutamina e β - mercaptoetanol) e 20U / mL de IL-2 (Peprotech) em 6 placas de cultura de bem 37 CO ° C / 5% 2.
  2. Realizar três manchas de cor para anticorpos neu (anti-c-Erb2/c-neu, clone-4, Calbiochem), seguido de IgG anti-rato PE, anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI), de acordo com o protocolo do fabricante (BD PharMingen)
  3. Portão em células tumorais neu positiva e analisar a viabilidade (anexina V-/PI-) das células tumorais

5. Modelo do rato do cancro da mama

FVBN202 transgênicos camundongos fêmeas (Charles River Laboratories) pode ser usado para a fonte de células tumorais T-reativa. Estes ratos superexpressam uma unactivated rato neu transgene sob a regulação do promotor MMTV e como resultado o desenvolvimento espontâneo carcinoma mamário entre 40-10 meses de idade 7. Estes ratos desenvolvem hiperplasia mamária pré-malignas semelhante ao carcinoma ductal in situ (DCIS) antes do desenvolvimento de carcinoma8 espontânea. Espontânea camundongos portadores de tumor são usados ​​como doadores de células T.

6. Resultados representativos:

Ativação de células T com B / I para 16 horas, resulta em morte de células T ingênuo que não estão sensibilizados com o tumor in vivo. Após a seletividade B / I de células tumorais T-reativa que se expandem até 2,8 vezes dentro de uma cultura de 6 dias com as citocinas cadeia gama (Figura 1). Ambos os CD8 + e células T CD4 + são igualmente expandida com as citocinas cadeia gama (Figura 2). O ex-vivo de células T expandida mostrar a capacidade de resposta elevada contra os tumores que ratos doadores foram sensibilizados para, avaliada pela produção de IFN-γ na presença de neu carcinoma mamário positivo do mouse (MMC) de células tumorais (Figura 3). O ex vivo células T expandida pode induzir a apoptose no tumor neu cel positiva MMCls que tal viabilidade das células tumorais cai de 92% para 61% dentro de 48 horas (Figura 4).

Figura ausente
Figura 1. Expansão Fold de linfócitos em diferentes momentos seguintes B / I ativação (dia 1) e expansão ex vivo com as citocinas cadeia gama (dias 3, 5 e 7)

Figura ausente
Figura 2. Percentual total de CD4 + e CD8 + T antes e depois de uma expansão de 7 dias com a cadeia gama citocinas.

Figura ausente
Figura 3. Tumor-IFN-γ estimulada a produção de células T isolados de camundongos portadores de tumor antes e depois de uma expansão de 7 dias com a cadeia gama citocinas, IFN-γ utilizando ELISA

Figura ausente
Figura 4. Citotóxicos função da expandidas ex vivo células T com as citocinas cadeia gama contra neu carcinoma mamário positivo do mouse (MMC) de células tumorais

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Expansão seletiva das células tumorais reativa T com função anti-tumor efetoras pode ser alcançado através do protocolo proposto utilizando B / I ativação e expansão ex vivo com a cadeia gama citocinas IL-2, IL-7 e IL-15. Enquanto IL-2 é um fator de crescimento de células T que podem apoiar a diferenciação e expansão de células T antígeno-específicos, IL-7 pode inibir a apoptose das células T e apoiar a sua viabilidade durante a expansão. IL-15 pode suportar células T de memória que são importantes para a geração de longo prazo anti-tumor respostas sobre terapia celular adotiva T 11/09. Alterando a ordem ea combinação dessas citocinas podem afetar a diferenciação das células T expandidas que por sua vez pode melhorar ou reduzir os seus 12 eficácia anti-tumoral. O protocolo proposto não vai exigir a identificação de antígenos de tumor. Expansão seletiva das células tumorais reativa T resulta na produção de um elevado número de células T anti-tumor, que pode ser utilizada para terapia celular adotiva T de pacientes com câncer. Nós temos mostrado previamente que o expandidas ex vivo células T animais protegidos contra o câncer de mama após terapia com células T adotivos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili). Agradecemos o apoio de VCU Massey Cancer Center e da Fundação Commonwealth para Pesquisa do Câncer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bryostatin 1 Sigma-Aldrich B7431-10ug
Ionomycin Calbiochem 407950
Mouse IL-7 PeproTech Inc 217-17
Mouse IL-15 PeproTech Inc 210-15
Human IL-2 PeproTech Inc 200-02
RPMI1640 Invitrogen 11875
FBS Gemini Bio Products 100-106
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-CI
L- glutamine Invitrogen 25030081
β- mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522
anti-CD16/32 antibody Biolegend 101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit BD Biosciences 556547
FITC-CD4 Biolegend 100406
PE-CD8 Biolegend 100708
anti-c-Erb2/c–Neu Calbiochem OP16
PE- anti mouse IgG Biolegend 405307
formaldehyde Polysciences, Inc. 04018
Hemocytometer Hycor 87144
Light microscope VWR international V200073
Mouse IFN-γ ELISA set BD Biosciences 555138
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
  2. Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
  3. Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
  4. Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
  5. Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
  6. Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
  7. Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
  8. Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
  9. Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
  10. Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
  11. Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics