MRNA परमाणु निर्यात कैनेटीक्स के Microinjection द्वारा स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण

Biology
 

Summary

यहाँ हम एक परख है कि microinjection फ्लोरोसेंट के साथ मिलकर की शक्ति को रोजगार का वर्णन

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Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection. J. Vis. Exp. (46), e2387, doi:10.3791/2387 (2010).

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Abstract

Eukaryotes में, दूत शाही सेना (mRNA) के नाभिक में लिखित है और cytoplasm में निर्यात अनुवाद मशीनरी का उपयोग किया जाना चाहिए. हालांकि mRNA की परमाणु निर्यात Xenopus 1 oocytes और 2 खमीर और ड्रोसोफिला व्युत्पन्न S2 सेल लाइन 3 के रूप में आनुवंशिक विनयशील जीवों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, कुछ अध्ययनों स्तनधारी कोशिकाओं में आयोजित किया गया था . इसके अलावा स्तनधारी दैहिक कोशिकाओं में mRNA निर्यात के कैनेटीक्स ही परोक्ष रूप से 4,5 inferred किया जा सकता है. आदेश में स्तनधारी टिशू कल्चर कोशिकाओं में mRNA की परमाणु निर्यात कैनेटीक्स को मापने के लिए, हम एक परख है कि microinjection स्वस्थानी संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट के साथ मिलकर की शक्ति को रोजगार विकसित किया है. ये assays कि स्तनधारी कोशिकाओं में mRNAs का बहुमत एक splicing निर्भर 6,7 तरीके में निर्यात कर रहे हैं, या तरह से है कि संकेत अनुक्रम कोडन क्षेत्र (SSCR) 6 के रूप में विशिष्ट शाही सेना दृश्यों की आवश्यकता है में प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस परख में, कोशिकाओं के साथ या तो इन विट्रो में संश्लेषित mRNA या प्लाज्मिड हित के जीन युक्त डीएनए microinjected हैं . microinjected कोशिकाओं विभिन्न समय फिर से तय की और शाही सेना के उप सेलुलर स्थानीयकरण मछली का उपयोग करने के लिए मूल्यांकन अंक के लिए incubated हैं. अभिकर्मक, जहां प्रतिलेखन nucleic एसिड के अलावा कई घंटे के बाद होता करने के लिए इसके विपरीत में, डीएनए या mRNA की microinjection तेजी से अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है और सटीक गतिज डेटा की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है.

Protocol

दो microinjection - आधारित विधियों है कि स्तनधारी कोशिकाओं में mRNA निर्यात के कैनेटीक्स को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इन विट्रो में संश्लेषित mRNA, या डीएनए प्लाज्मिड, जो mRNA में vivo में लिखित है के इंजेक्शन हैं. प्रत्येक तकनीक के अपने फायदे और कमियां है. यहाँ हम दोनों तकनीकों का वर्णन है और दो दृष्टिकोणों के बीच अंतर पर चर्चा.

1. इंजेक्शन के लिए सामग्री तैयार करना

  1. इन विट्रो लिखित mRNA में
    1. mRNA या तो plasmids या पीसीआर उत्पादों है कि उपयुक्त शाही सेना पोलीमरेज़ प्रमोटर (यानी T7 या SP6 प्रमोटरों) के द्वारा अपस्ट्रीम flanked ब्याज की जीन होते से लिखित है. ट्रांसक्रिप्शन उपयुक्त nucleotides और अधिक टोपी एनालॉग के साथ इन विट्रो उचित एंजाइम (T7 या SP6 शाही सेना पोलीमरेज़, Invitrogen) का प्रयोग करने में किया जाता है .
    2. देखिए इन विट्रो में polyadenylated निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार (Invitrogen) पाली एक पोलीमरेज़ और एटीपी का उपयोग कर.
    3. mRNA तो या तो Invitrogen या Qiagen से स्तंभों का उपयोग कर शुद्ध होता है.
    4. Eluted mRNA तो एक 30min के लिए 13,000 जी में 4 बजे centrifugation ° सी द्वारा पीछा घंटे के लिए 1/20th मात्रा 3M पोटेशियम एसीटेट और -20 ° सी में 2 100% इथेनॉल की मात्रा को जोड़कर उपजी हैं. यदि अतिरिक्त तरल मौजूद है, गोली बर्फ के ठंडे 70% इथेनॉल के साथ धोया जा सकता है.
    5. परिणामस्वरूप mRNA गोली हवा तो इंजेक्शन बफर (140mm KCl और 10mm HEPES, 7.4 पीएच) में solubilised सूखे. ध्यान दें कि किसी भी contaminant इथेनॉल microinjected सेल करने के लिए विषाक्त हो सकता है. solubilized mRNA ° -80 पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए सी में रखा जा सकता है.
    6. Microinjection के लिए, mRNA इंजेक्शन बफर में 200μg/ml पतला किया जाता है और ओरेगन 488 ग्रीन (ओग) संयुग्मित 70kDa dextran (1mg/ml, Invitrogen) के साथ मिश्रित. चूंकि dextran ओग - संयुग्मित भी परमाणु ताकना भर में फैलाना बड़ी है, यह न केवल (इंजेक्शन कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, लेकिन यह भी निर्धारित करने के लिए कितना तरल पदार्थ के नाभिक में इंजेक्ट किया गया था और कितना cytoplasm में लीक करने में मदद के लिए सक्षम हो जाएगा 4.1.2 देखें). वैकल्पिक रूप से, किसी भी फ्लोरोसेंट, उच्च आणविक भार अणु है कि परमाणु ताकना को पार करने में असमर्थ है इस्तेमाल किया जा सकता है.
    7. नमूने सुई लोडिंग के क्रम में गोली किसी भी बात कण है कि संभावित सुई टिप में बाधा डालती कर सकते हैं कम से कम पहले 20min के लिए तेरह हज़ार छ 4 ° C पर centrifuged हैं.
  2. प्लास्मिड डीएनए
    1. प्लाज्मिड हित के जीन युक्त डीएनए Qiagen से मानक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है. आम तौर पर बड़े डीएनए की तैयारी करने के लिए उच्च गुणवत्ता के होते हैं और इस प्रकार और अधिक कुशलता से इंजेक्शन के बाद लिखित हैं.
    2. प्लास्मिड डीएनए 50 200μg/ml पतला है ओग संयुग्मित 70 केडीए dextran (1mg/ml) युक्त इंजेक्शन बफर में.
    3. सुई लोड हो रहा से पहले, इंजेक्शन तरल पदार्थ 13,000 जी 4 ° C पर कम से कम 20min के लिए centrifuged है.
  3. Microinjection के लिए सुइयों
    1. एक 2.5mm फिलामेंट के साथ p97 Sutter ज्वलंत / ब्राउन micropipette डांड़ी का उपयोग कर, सुई 1.0mm borosilicate ग्लास (विश्व प्रेसिजन उपकरण इंक # 1B100F आइटम 3) केशिका ट्यूब से गढ़े हैं.
    2. इंजेक्शन सुई एक तीन कदम खींच 2.5x4.5 मिमी बॉक्स फिलामेंट (# FB245B आइटम, Sutter उपकरण कं) का उपयोग कर कार्यक्रम का उपयोग उत्पन्न कर रहे हैं. इस प्रयोग में इस्तेमाल किया प्रोग्राम मापदंडों के नीचे सूचीबद्ध हैं, लेकिन वे प्रत्येक फिलामेंट के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
      कदम # गर्मी खींचें वेग समय दबाव
      1 740 100 8 250 500
      2 740 100 8 250 500
      3 740 100 10 250 500

      (रैंप तापमान = 740)
  4. सेल तैयारी
    1. आम तौर पर किसी भी स्तनधारी सेल लाइन microinjected किया जा सकता है, लेकिन सेल प्रकार है कि अच्छी तरह से फैल रहे हैं और इंजेक्शन के लिए उत्तरदायी होते हैं. सेल लाइन का चुनाव भी अन्य कारकों पर निर्भर हो सकता है. उदाहरण के लिए, mRNAs है कि secreted प्रोटीन के लिए कोड endoplasmic जालिका की सतह को लक्षित कर रहे हैं और इस COS-7 कोशिकाओं में दिखाई है के रूप में NIH 3T3 fibroblasts की तुलना में 6 (3 आंकड़ों में स्थानीयकरण टी FTZ - Δi mRNA की तुलना और 4).
    2. कक्ष एसिड धोया 30mm petridishes में वर्ग (25x25mm) 24hrs कम से कम microinjection से पहले के लिए coverslips पर वरीयता प्राप्त होना चाहिए. कुछ सेल लाइनों में फैल fibronectin लेपित 6,8 coverslips पर चढ़ाना कोशिकाओं द्वारा प्रेरित किया जा सकता है . आदर्श रूप में सेलुलर monolayer मोटे तौर पर 70-90% मिला हुआ इंजेक्शन के समय पर किया जाना चाहिए.
    3. इंजेक्शन कोशिकाओं की आसान पहचान के लिए अनुमति देते हैं, सेल monolayer इंजेक्शन के लिए पहले एक 200μl प्लास्टिक विंदुक टिप का उपयोग करके घायल है. आम तौर पर एक क्रॉस घाव coverslip (चित्रा 1) पर etched है और कोशिकाओं को कम से कम टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में इंजेक्शन से पहले 15min के लिए ठीक करने के लिए छोड़ दिया जाता है.
    4. Microinjection के दौरान, टिशू कल्चर मीडिया धीरे धीरे प्रसार करने के लिए सीओ 2 खो देता है और एक परिणाम के रूप में क्षार हो जाता है. इंजेक्शन के दौरान एक तटस्थ पीएच बनाए रखने में मदद करने के लिए, मीडिया 10mm 7.4 पीएच HEPES के साथ पूरक हो सकता है. अतिरिक्त बफर microinjection दिन पहले मीडिया के लिए जोड़ा जा सकता है है.
  5. माइक्रोस्कोप और micromanipulator
    1. कक्ष एक उलटा माइक्रोस्कोप है कि एक हवाई मेज पर अलग है का उपयोग करने के लिए कंपन है कि microinjection प्रक्रिया को विघटनकारी हो सकता है कम से कम microinjected हैं. माइक्रोस्कोप दो उद्देश्यों के साथ सुसज्जित है, एक सूखी 10x टुकड़ा, जो कोशिकाओं और सुई की स्थिति के लिए प्रयोग किया जाता है, और एक सूखी 40x अतिरिक्त लंबे समय तक काम दूरी चरण उद्देश्य है, जो microinjection प्रक्रिया छवि के लिए प्रयोग किया जाता है.
    2. ऑप्टिकल aberrations coverslip और petridish भर देखने कोशिकाओं द्वारा कारण अगर उद्देश्य सुधार कॉलर है समाप्त किया जा सकता है. यह सुनिश्चित करना कि खुर्दबीन brightfield कोहलर 9 रोशनी के लिए ठीक से गठबंधन किया है, यह भी इंजेक्शन सुई (2.2.4 देखें) से बिखरे हुए किया जा रहा है प्रकाश के कारण aberrations के लिए सही में मदद करेगा.
    3. सुई एक तीन अक्ष फांसी जोस्टिक micromanipulation डिवाइस (NT-88-V3MSH, Narishige) द्वारा नियंत्रित किया जाता है. मोटे जोड़तोड़ खुर्दबीन के पीछे स्तंभ के लिए सुरक्षित है सुई आसानी से उठाया जा करने के लिए और डिश में उतारा अनुमति जबकि अपनी मूल स्थिति को बनाए रखना है.
    4. सुई एक छड़ी है कि मोटे जोड़तोड़ clamped है के लिए सुरक्षित है. , जो इंजेक्शन microinjection सुई की नोक से तरल पदार्थ को बेदखल करना आवश्यक दबाव उत्पन्न करता है, एक ट्यूब एक 5cc गिलास सिरिंज (Becton Dickinson # 512311 आइटम) के लिए छड़ी से जोड़ता है. दबाव स्तर को नियंत्रित करने के लिए, सिरिंज बैरल और पिस्टन की स्थिति में जो दो stoppers, एक पाइप क्लैंप (किसी भी हार्डवेयर की दुकान में उपलब्ध) और दो धातु clamps (चित्रा 2) के होते हैं एक सिरिंज नियामक द्वारा आयोजित कर रहे हैं. सिरिंज सवार करने के लिए सुनिश्चित करें कि सिरिंज उच्च दबाव, निर्वात तेल (डॉव Corning) का कहना है लागू किया जाता है.
  6. फ्लोरिसेंट संकरण जांच
    1. इंजेक्शन न्यूक्लिक एसिड का प्राथमिक अनुक्रम शाही सेना जैसे 10 4.6 RNAstructure माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर, का उपयोग करने के लिए जोड़ रहा है.
    2. mRNA सिलवटों नेत्रहीन के बारे में 50 nucleotides कि लंबी डबल किस्में जैसे उच्च पिघलने तापमान के साथ माध्यमिक संरचनाओं से मुक्त हो जाता है के एक क्षेत्र की पहचान के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं.
    3. इस क्षेत्र के रिवर्स पूरक एक Alexa546 fluorophore जांच के 5 'अंत करने के लिए संलग्न के साथ संश्लेषित है (इन एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज से खरीदा जा सकता है).
    4. जांच 100μM के एक एकाग्रता के लिए पानी के साथ पतला है और 2-3 साल के लिए -80 ° सी में संग्रहीत.

2. Intranuclear Microinjection

  1. Microinjection खुर्दबीन पर इंजेक्शन द्रव लोड हो रहा है
    1. इंजेक्शन तरल पदार्थ के लगभग 1μl centrifuged डीएनए या mRNA नमूना का उपयोग करने से तैयार हैGELoader युक्तियाँ (आइटम ०२,२३,५१,६५६ #; Epindorff). तरल नमूना के ऊपर से aspirated होना चाहिए गोली जो बात कण है कि सुई रोकना कर सकते हैं शामिल में खलल न डालें से बचने के.
    2. विंदुक टिप सुई के पीछे के अंत में डाला जाता है और तरल निकली है. तरल केशिका कार्रवाई द्वारा सुई टिप करने के लिए तैयार हो जाएगा और टिप के निकट एक meniscus 5-30sec के भीतर दिखाई जानी चाहिए.
    3. तरल पदार्थ से भरे सुई छड़ी, जो फिर एक 45 ° कोण पर है micromanipulator के लिए clamped में डाला जाता है.
    4. सुई 10x उद्देश्य के साथ कल्पना है और फोकल मोटे micromanipulator knobs का उपयोग विमान के पास देखने के विमान के केंद्र में तैनात है. सुई तो कुछ मिलीमीटर से रोकने के बाद के चरणों (2.2.2) में क्षतिग्रस्त किया जा रहा है और फिर खुर्दबीन वापस स्तंभ पीछे धकेल दिया है उठाया है.
    5. दबाव सवार 0.5 2cc निराशाजनक की वृद्धि हुई है.
  2. Microinjection
    1. एक घायल monolayer के साथ एक कवर पर्ची युक्त petridish देखने के मंच पर रखा गया है.
    2. खुर्दबीन वापस स्तंभ आगे एक ईमानदार स्थिति में खींच लिया है, कंडेनसर करने के लिए गठबंधन किया जाना और सुई तरल प्रवेश करने के लिए कारण. यह सावधानी से किया जाना चाहिए सुई coverslip पर तोड़ने से रोकने के (2.1.4 देखें).
    3. 10x उद्देश्य का प्रयोग, पार घाव के केन्द्र की पहचान है और सुई इंजेक्शन जा कोशिकाओं के ऊपर तैनात है.
    4. बढ़ाई 40x उद्देश्य के लिए स्विचन और सुई उतारा है और केन्द्रित जोस्टिक पर ठीक समायोजन knobs का उपयोग कर की वृद्धि हुई है. अगर छवि को ध्यान से बाहर है, एक है कि घटना प्रकाश ठीक से गठबंधन किया है (यानी Kölher रोशनी 9) सुनिश्चित बर्ट्रेंड लेंस का उपयोग कर ( 1.5.2 देखें).
    5. इंजेक्शन घाव पार के एक कोने में शुरू और दृश्य के दौरान इंजेक्शन कोशिकाओं (चित्रा 1 देखें) की आसान पहचान के लिए एक बढ़त के साथ जारी रखा जाना चाहिए.
    6. सुई नाभिक के साथ संपर्क बनाने के लिए कम है. एक आसानी से बता सकते हैं कि एक सेल चरण चमक में उल्लेखनीय परिवर्तन है कि इंजेक्शन के साथ द्वारा अंतःक्षिप्त किया गया है सकते हैं.
    7. यदि द्रव पूरे सेल भरता यह संकेत हो सकता है कि दबाव बहुत अधिक है और कम होने की जरूरत है.
    8. यदि चरण चमक में कोई परिवर्तन नहीं पाया जाता है, इस का संकेत हो सकता है कि या तो microinjection दबाव पियर्स कोशिका झिल्ली काफी मजबूत नहीं है, या कि सुई टिप भरा हुआ है. अपर्याप्त दबाव, सुई में खामियों, और छोटे कण बात के साथ सुई टिप की रुकावट: यह सहित कई मुद्दों का एक नंबर का परिणाम हो सकता है. Micromanipulator में लोड हो रहा है एक सुई के बाद से समय लगता है, और इंजेक्शन सब्सट्रेट के बाद से अक्सर बहुत ही मूल्यवान है, यह महत्वपूर्ण है कि प्रभावी ढंग से इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सुइयों के प्रतिशत को अधिकतम. नीचे है एक के लिए एक भरा सुई टिप अनवरोधित करने की कोशिश कर रहा करने के लिए कदम गाइड द्वारा कदम. हर कदम के बाद, एक 2 - 3cells इंजेक्षन करने के लिए आकलन है कि क्या बाधा हटा दिया गया है की कोशिश करनी चाहिए:
      कार्य उद्देश्य और लक्ष्य
      1 ध्यान केंद्रित समायोजित सुई टिप की लंबाई को देखने के. पता लगाएँ कि क्या वहाँ सुई या टिप अवरुद्ध कण का एक बड़ा टुकड़ा है कि क्या एक स्पष्ट दोष है.
      2 डिश में एक कण के अस्थायी टुकड़ा के बगल में सुई टिप रखें. यदि द्रव टिप निकल है यह यह सुई के साथ सीधे संपर्क में आने के बिना कण आंदोलन चाहिए.
      3 सिरिंज के बहुत अंत करने के लिए सवार दबाना दबाव में यह अस्थायी वृद्धि नोक पर किसी भी बाधा को स्पष्ट करना चाहिए. सवार को रिहा करने के बाद, यह अपने स्वयं के समझौते पर उठना चाहिए, अगर यह नहीं है, इस का मतलब दबाव सिरिंज में निर्मित अप नहीं किया जा रहा है और आप के लिए कनेक्शन और / कस या अतिरिक्त वैक्यूम तेल जोड़ने की जरूरत है.
      4 सुई सेल मेड के बाहर उठाएँआइए जलीय मीडिया के बाहर ड्राइंग सुई के बल की मदद कर सकते हैं सुई की नोक पर अवरोधों को हटाना.
      5 सिरिंज से सवार पूरी तरह से निकालें और यह reinsert. दबाव में यह अतिरिक्त वृद्धि करने के लिए सुई की नोक को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
      6 Coverslip की एक साफ हिस्से पर सुई टिप स्क्रैच यह आगे सुई के भीतर कण विरोध नहीं है और इसका स्थान बदलना नोक पर बाधा को दूर करने में मदद करता है. मजबूत scratching के टिप के अंत बंद चिप, सुई से बाहर निकलें बाधा सक्षम हो सकता है.
      7 लोड एक नई सुई


      एक अन्य आम समस्या सुई के भीतर दबाव के क्रमिक नुकसान है, आगे सिरिंज में सवार निराशाजनक द्वारा लगातार मुआवजा की आवश्यकता है. अक्सर, सिरिंज सवार करने के लिए अतिरिक्त वैक्यूम तेल जोड़ने अधिक सुसंगत दबाव बनाए रखने में मदद कर सकते हैं. हालांकि इस समस्या सिरिंज और ट्यूब, ट्यूब और छड़ी, या छड़ी और सुई के बीच कनेक्शन लीक की वजह से हो सकता है. अधिकांश हवा लीक (फिशर) Parafilm या यदि आवश्यक तेल का उपयोग कर बंद किया जा सकता है, हालांकि केवल छड़ी और सुई के बीच लीक छड़ी में रबर गैसकेट बदलकर सही किया जा सकता है.
    9. घाव बढ़त के साथ समय की एक निश्चित अवधि (10-15min) के लिए एक घाव बढ़त के साथ कक्ष microinjected हैं. अभ्यास के साथ कई सौ कोशिकाओं को इस अंतराल के दौरान इंजेक्शन जा सकता है.
    10. Microinjection के बाद, कक्षों 37 में incubated हैं ° सी निर्धारण करने के लिए पहले समय के वांछित राशि के लिए एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में. विकास मीडिया में भंग, यदि डीएनए इंजेक्शन, प्रतिलेखन (सिग्मा Aldrich 1μg/ml) α-amanitin के साथ कोशिकाओं के इलाज से 20min बाद समाप्त होता है. यह एकाग्रता microinjected प्लाज्मिड (चित्रा 3) से प्रभावी ढंग से प्रतिलेखन रोकता.
    11. एक एकल सुई कई coverslips इंजेक्षन करने के लिए reused किया जा सकता है, हालांकि सुई जब एक परिवर्तन डीएनए या शाही सेना के प्रकार microinjected है कि जगह की जरूरत है. एक बार सुई छड़ी से निकाल दिया जाता है चाहिए का निपटारा हो सकता है और नहीं reused किया.
    12. मृत या अस्थायी कोशिकाओं कभी कभी सुई टिप करने के लिए छड़ी और microinjection के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. सुई से इस मलबे को निकालने के लिए, सुई बढ़ा बाहर वापस स्तंभ धक्का द्वारा तरल के और फिर धीरे से तरल में ईमानदार स्थिति स्तंभ readjusting द्वारा सुई वापस reinsert.
    13. MRNA परमाणु निर्यात कैनेटीक्स माप के एक सटीक माप को प्राप्त करने के लिए, अलग नमूने 0min पर तय किया जाना चाहिए, 15min, 30min, 60min और 120min microinjection के बाद शाही सेना, या α-amanitin उपचार के बाद.

3. सेल फिक्सेशन और धुंधला

  1. सेल फिक्सेशन और Permeabilization
    1. उपयुक्त समय, विकास मीडिया से aspirated है और कोशिकाओं 2 मिलीलीटर पीबीएस समाधान (137mM NaCl, 2.7mm KCl, 10mm ना 2 HPO 4, 2mm 2 के.एच. पीओ 4, 7.4 पीएच) के साथ दो बार धोया जाता है. यह समय वे तरल में नहीं डूबे हुए हैं कम से कम नम coverslips रखना महत्वपूर्ण है.
    2. कोशिकाओं को कम से कम 15min के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में 4% paraformaldehyde (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप विज्ञान) के 2ml जोड़कर तय कर रहे हैं.
    3. तय नमूने पीबीएस समाधान के साथ दो बार धोया जाता है.
    4. कोशिकाओं 2ml 0.1% के साथ permeabilized हैं ट्राइटन पीबीएस में कमरे के तापमान पर कम से कम 15 मिनट के लिए X-100.
    5. नमूने पीबीएस समाधान के साथ दो बार धोया जाता है.
  2. मछली धुंधला
    1. अगला नमूने के संकरण के लिए तैयार रहने की जरूरत है. कोशिकाओं 1x एसएससी (NaCl 150mm, 15mm सोडियम साइट्रेट, 7.0 पीएच) समाधान के साथ 25-60% formimide के साथ दो बार धोया जाता है. Formamide की राशि के लिए, एक ही एकाग्रता है कि संकरण के समाधान में मौजूद है (3.2.3 देखें) का उपयोग करें.
    2. धुंधला कक्ष तैयार करने के लिए, एक 150mm petridish के नीचे पानी के साथ कवर किया जाता है और Parafilm का एक टुकड़ा पानी पर जारी है. पानी पकवान मोड़ पर, इस प्रकार Parafilm पकवान के नीचे का पालन करने की अनुमति के द्वारा हटा दिया जाता है. वायु बुलबुले मैन्युअल फिर हैंचले गए.
    3. प्रत्येक coverslip लिए संकरण समाधान के दाग, 100μl बूँदें (25-60% formamide, 100mg/ml dextran सल्फेट, 1mg/ml ई. कोलाई tRNA, जांच 1:500 पतला के साथ 1x एसएससी में 5mm vanadyl riboside जटिल) pipetted हो सकता है parafilm पर. ध्यान दें कि formamide की राशि विशेष मछली इस्तेमाल किया जा रहा है जांच के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.
    4. संदंश की मदद के साथ, एक coverslip एक 30mm petridish से निकाल दिया जाता है, तो वाटमान फ़िल्टर (VWR) coverslip के पीछे (पक्ष सेल मुक्त) की ओर सूखे और अतिरिक्त बफर है कागज तय सुखाने के बिना दुष्ट का उपयोग कर रहा है, सामने की ओर से कोशिकाओं. coverslip तो चेहरे मछली समाधान पर नीचे रखा जाता है. यह प्रत्येक coverslip के लिए दोहराया है.
    5. धुंधला चैम्बर ढक्कन रखने पर वापस करने के बाद, नमूने 5-18hrs के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated हैं
  3. धुलाई और बढ़ते सना हुआ नमूने
    1. कई धोने कक्षों धुंधला चैम्बर के रूप में एक ही तरीके (3.2.2 देखें) में बना रहे हैं.
    2. प्रत्येक coverslip के लिए, धोने बफर (25-60% formamide साथ 1x SCC) के 1 मिलीलीटर धोने चैम्बर के parafilm पर pipetted है. फिर, formamide का एक ही एकाग्रता है कि संकरण समाधान में मौजूद है (3.2.3 देखें) का उपयोग करें.
    3. Coverslip के लिए धुंधला हो जाना चैम्बर से coverslips, धोने बफर के 1ml निकालने के लिए अगले pipetted है. तरल केशिका कार्रवाई द्वारा प्रत्येक नमूने के नीचे तैयार किया जाना चाहिए.
    4. संदंश का प्रयोग, coverslips हटा रहे हैं और प्रत्येक धोने बफर के ड्रॉप पर रखा गया है और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated.
    5. 3.3.2 के लिए 3.3.4 कदम से अधिक दो बार दोहराया जाता है, ताकि प्रत्येक coverslip कुल 3 बार धोया जाता है.
    6. यदि आरएनए कुछ प्रोटीन के साथ immunofluorescence द्वारा costained है, खंड 3.4 देखें.
    7. स्लाइड्स 70% इथेनॉल के साथ धोया जाता है, और Kimwipes के साथ सूख. प्रत्येक coverslip के लिए, DAPI (Fluoromount जी, दक्षिणी बायोटेक) के साथ समाधान बढ़ते के 10-30 μl स्लाइड्स पर pipetted है. प्रत्येक स्लाइड में दो coverslips को समायोजित कर सकते हैं.
    8. संदंश और वाटमान फिल्टर पेपर का उपयोग, coverslips के पीछे सूख रहा है और अतिरिक्त तरल नमूने सुखाने के बिना coverslip के सामने की ओर बंद दुष्ट है. प्रत्येक coverslip तो चेहरा नीचे बढ़ते समाधान के ड्रॉप पर रखा गया है.
    9. घुड़सवार नमूनों स्टोर 4 में किया जा सकता है डिग्री सेल्सियस
  4. Immunofluorescence धुंधला
    1. नमूने पीबीएस के साथ दो बार धोया चाहिए formamide है जो उचित एंटीबॉडी धुंधला के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं हटा दें.
    2. प्रत्येक coverslip, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (1.0μg/ml एंटीबॉडी, 0.1% TX-100, 0.1mg/ml RNase मुक्त पीबीएस में BSA) के 50μl के लिए एक धोने के चैम्बर के parafilm पर pipetted है.
    3. संदंश का प्रयोग, coverslips सेल की ओर रखा जाता है प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान पर नीचे और 30min के लिए कमरे के तापमान पर सेते की अनुमति दी.
    4. प्रत्येक coverslip के लिए, पीबीएस के दो 1ml बूँदें एक कपड़े धोने चैम्बर के parafilm पर pipetted हैं.
    5. एंटीबॉडी धुंधला समाधान से coverslips हटाने के लिए, PBS की 1ml coverslip करने के लिए अगले pipetted है. तरल केशिका कार्रवाई द्वारा प्रत्येक नमूने के नीचे तैयार किया जाना चाहिए.
    6. संदंश का प्रयोग, coverslips हटा रहे हैं और प्रत्येक रखा जाता है और 5min लिए पीबीएस की पहली बूंद पर फिर दूसरे 5min के लिए पीबीएस की दूसरी ड्रॉप पर रखा.
    7. 3.4.2 के लिए 3.4.6 चरण फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (1.0μg/ml एंटीबॉडी, 0.1% TX-100, पीबीएस में 0.1mg/ml BSA) का उपयोग करते हुए दोहराया जाता है. ध्यान दें कि जब से इंजेक्शन मार्कर और शाही सेना हरे और लाल चैनल में दिखाई दे रहे हैं, माध्यमिक एंटीबॉडी Alexa647 जैसे एक संगत डाई को संयुग्मित किया जाना चाहिए.
    8. Coverslips 3.3.7 में बढ़ रहे हैं.

4. इमेजिंग और मात्रा

  1. इमेजिंग
    1. एक epifluorescence खुर्दबीन इंजेक्शन के बाद कोशिकाओं छवि के लिए इस्तेमाल किया है. इंजेक्ट कोशिकाओं को पार घावों का पता लगाने और इंजेक्शन मार्कर (ओग dextran) के साथ कोशिकाओं की पहचान करके स्थित किया जा सकता है.
    2. प्रत्येक कोशिका के लिए मनाया, इंजेक्शन ओग - dextran की एक तस्वीर का अधिग्रहण है. जब इमेजिंग mRNA microinjected यह महत्वपूर्ण है कि मात्रा का ठहराव कोशिकाओं है कि नाभिक में> इंजेक्शन द्रव (यानी dextran) का 90% प्राप्त करने के लिए सीमित है.
    3. शाही सेना की एक छवि तो हासिल कर ली है. शाही सेना के सही माप के लिए अनुमति देते हैं, जोखिम समय किसी दिए गए समय पाठ्यक्रम के भीतर सभी कोशिकाओं के बीच लगातार गिरावट और कैमरे की गतिशील रेंज के भीतर रहना चाहिए. आदर्श रूप में प्रत्येक छवि एक uninjected कक्ष शामिल करने के लिए उचित पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति inte की गणना करने में सक्षम होना चाहिएnsity (4.2.4 देखें).
    4. मात्रा का ठहराव में सहायता, दाग DAPI की एक छवि भी हासिल किया जा सकता है. इसके अलावा अगर immunofluorescence प्रदर्शन किया गया था, दाग प्रोटीन भी imaged किया जा सकता है. विभिन्न बिंदुओं पर एक समय के पाठ्यक्रम में mRNA और वितरण का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है. mRNA एक secreted प्रोटीन encodes और इस तरह COS-7 कोशिकाओं में ईआर के लिए लक्षित है. ध्यान दें कि ईआर लक्ष्यीकरण सह - धुंधला TRAPα, एक निवासी ईआर 11 प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ शाही सेना द्वारा सत्यापित किया गया था.
  2. मात्रा का ठहराव

    यह अलग छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर संकुल के एक नंबर के साथ पूरा किया जा सकता है. ImageJ सॉफ्टवेयर सेलुलर mRNA वितरण बढ़ाता है के बाद से यह मैन्युअल रूप से परमाणु और cytoplasmic भिन्न अलग इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, यह इन भागों का औसत प्रतिदीप्ति उपाय कर सकते हैं, और इसके उत्पादन डेटा आसानी से हो सकता है और कॉपी कर सकते हैं जैसे अन्य सॉफ्टवेयर में चिपकाया, Microsoft Excel में.
    1. मछली, ओग dextran, और DAPI प्रतिदीप्ति इसी छवियाँ खोला और छवियाँ का उपयोग करने के लिए उपकरण ढेर विलय कर रहे हैं.
    2. या तो DAPI या dextran परत में थ्रेसहोल्ड उपकरण microinjected नाभिक को इसी क्षेत्र को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह अंश छड़ी उपकरण का उपयोग कर चयनित है, और माप उपकरण का उपयोग कर मछली परत, क्षेत्र (एक Nuc) और / मतलब औसत तीव्रता (Nuc एफ) के लिए जाने के बाद दर्ज हैं.
    3. सेल परिधि मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग कर उल्लिखित है, और जबकि मछली परत पर क्षेत्र (एक Tot) और / औसत तीव्रता मतलब (एफ Tot) माप उपकरण का उपयोग कर दर्ज कर रहे हैं. यदि आपके सेल प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि की तुलना में काफी अधिक तीव्र है, तो आप थ्रेसहोल्ड के बजाय मुक्तहस्त चयन उपकरण के अपने वांछित सेल रूपरेखा उपकरण का उपयोग कर सकते हैं.
    4. आयताकार चयन समारोह का उपयोग करना, एक बॉक्स एक uninjected सेल और मतलब / औसत तीव्रता (एफ वापस) दर्ज पर तैयार की है.
    5. सभी माप एक Excel कार्यपत्रक में प्रतिलिपि बनाई जाती है.
    6. निर्यात mRNA निम्न समीकरण का उपयोग कर की गणना है:
      समीकरण
      एक Nuc नाभिक का क्षेत्र
      एक Tot पूरे सेल के क्षेत्र
      एफ Nuc परमाणु अंश का औसत प्रतिदीप्ति
      एफ Tot पूरे सेल अंश का औसत प्रतिदीप्ति
      वापस एफ एक untransfected सेल की औसत प्रतिदीप्ति

      हर बार बिंदु के लिए औसत% निर्यात की गणना है और समय पर प्लॉट किए जाते है.
    7. समय के साथ - mRNA स्थिरता औसत कुल mRNA प्रतिदीप्ति (वापस एफ) एक Tot एक्स (एफ Tot) की साजिश रचने के द्वारा की गणना की जाती है. आमतौर पर हम पाते हैं कि mRNA की राशि कोशिकाओं के बीच और coverslips के बीच बहुत भिन्न होता है. यह सुई प्रवाह दरों के बीच और मछली धुंधला की दक्षता के बीच विसंगतियों के कारण हो सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. जब तक वे 70-90% तो खड़ी है और क्षैतिज घायल मिला हुआ एक 200μl प्लास्टिक विंदुक टिप का उपयोग कर रहे हैं. Microinjection coverslip कोशिकाओं बड़े हो रहे हैं. पार घाव से शुरू, कोशिकाओं एक घाव बढ़त (तीर) के साथ अंतःक्षिप्त रहे हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 सिरिंज नियामक. एक) प्रवाह आरेख प्रदर्शन कैसे सिरिंज नियामक इकट्ठा किया है. बी) के योजनाबद्ध इकट्ठे तंत्र. सी) इकट्ठे सिरिंज नियामक की एक तस्वीर.

चित्रा 3
चित्रा 3. Α-amanitin के इंजेक्शन प्लास्मिड डीएनए के प्रतिलेखन पर प्रभाव NIH3T3 fibroblast कोशिकाओं, जो थे पूर्व एकाग्रता बदलती के साथ इलाज किया .α-amanitin की, टी FTZ - Δi प्लास्मिड डीएनए और ओग संयुग्मित 70kD dextran के साथ अंतःक्षिप्त थे. इंजेक्ट कोशिकाओं 37 में incubated रहे थे ° सी 1 घंटा और फिर तय की और एक विशिष्ट probe6 मछली का उपयोग टी FTZ - Δi mRNA के लिए दाग के लिए. प्रत्येक पंक्ति को देखने के एक एकल क्षेत्र ओग 70kDa dextran और टी FTZ Δi mRNA के लिए imaged से मेल खाती है है. है कि उच्च, लेकिन नहीं कम नोट, दवा की सांद्रता पूरी तरह से टी FTZ Δi प्रतिलेख के उत्पादन हिचकते. स्केल बार = 15μm.

चित्रा 4
चित्रा 4
चित्रा 4. MRNA परमाणु निर्यात के समय बेशक COS-7 कोशिकाओं टी FTZ Δi प्लाज्मिड डीएनए और ओग संयुग्मित 70kD dextran के साथ अंतःक्षिप्त थे . 30min निम्नलिखित इंजेक्शन कोशिकाओं α-amanitin के साथ इलाज किया गया और 37 डिग्री संकेत समय अंक के लिए सी incubated. कोशिकाओं तो और तय किया गया टी FTZ Δi mRNA के खिलाफ और जांच के साथ ईआर मार्कर TRAPα के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग. प्रत्येक पंक्ति में कक्षों की एक एकल फ़ील्ड से मेल खाती है है. ए) mRNA microinjection timecourse के बाद वितरण. बी) 120min समय बिंदु के () एक से उड़ा टी FTZ - Δi mRNA और ईआर के सह स्थानीयकरण का प्रदर्शन. टी FTZ - Δi (हरा) mRNA और TRAPα धुंधला हो जाना (लाल) के एक उपरिशायी राइट पैनल में दिखाया गया है. स्केल सलाखों 15μm =.

Discussion

Microinjection एक शक्तिशाली उपकरण है कि अलग सेलुलर प्रक्रियाओं के एक नंबर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पारंपरिक सेल अभिकर्मक के विपरीत, microinjection शोधकर्ता प्रभावी रूप से एक बहुत ही संकीर्ण समय सीमा के भीतर सेलुलर नाभिक में न्यूक्लिक एसिड का परिचय देता है. एक परिणाम के रूप में, एक mRNA निर्यात, mRNA स्थानीयकरण, और प्रोटीन संश्लेषण की दर का निर्धारण करने के रूप में गतिज विश्लेषण प्रदर्शन कर सकते हैं. इसके अलावा, के बाद से प्रयोग की समय सीमा अपेक्षाकृत संक्षिप्त है, एक pleiotropic प्रभाव incurring के बिना कम समय spans भीतर विषाक्त यौगिकों कोशिकाओं को बेनकाब कर सकते हैं. इसके अलावा, निरोधात्मक या stimulatory यौगिकों, जैसे प्रमुख नकारात्मक प्रोटीन किया जा सकता है सह nucleic एसिड के साथ इंजेक्शन. अंत में, microinjections अभिकर्मक अभिकर्मकों, जो अक्सर कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं और अलग सेलुलर कार्यों उपद्रव हो सकता है के लिए आवश्यकता से बचने के.

प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन बनाम mRNA

पसंद इंजेक्षन करने के लिए न्यूक्लिक एसिड जिनमें से विचारों की एक संख्या पर निर्भर करेगा. प्लास्मिड डीएनए के इंजेक्शन के बाद, शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय न केवल mRNA synthesizes, लेकिन यह भी नवजात 12,13 प्रतिलेख प्रोटीन कारकों रंगरूटों. चूंकि इन कारकों mRNA प्रसंस्करण, परमाणु निर्यात और cytoplasmic स्थानीयकरण के रूप में इस तरह की घटनाओं को नियंत्रित, प्लास्मिड डीएनए इंजेक्शन का आकलन कैसे प्रतिलेखन बहाव प्रक्रियाओं के लिए युग्मित है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि प्रतिलेखन परमाणु निर्यात 14 के लिए युग्मित किया जा सकता है, हमने पाया है कि इंजेक्शन mRNA थोड़ा की तुलना में vivo में लिखित 6 mRNA में तेजी से निर्यात किया जाता है. इस के लिए कारणों पल में स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, लेकिन इस परिणाम सुझाव है कि हो सकता है कि के रूप में नए संश्लेषित mRNA शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय से उभर, यह है कि मंदबुद्धि परमाणु निर्यात परिसरों में बंधे हो सकता है.

MRNA इंजेक्शन के साथ कुछ फायदे हैं. सबसे पहले, शोधकर्ता शाही सेना पोलीमरेज़ inhibitors का उपयोग नहीं है, करता है जो प्रभावित हो सकता है कि कैसे कोशिकाओं शाही सेना की समग्र चयापचय को विनियमित. दूसरे, शाही सेना के इन विट्रो में संशोधित किया जा सकता है इंजेक्शन के लिए पहले. उदाहरण के लिए, mRNAs विभिन्न 5 'टोपी analogues या पाली (ए) पूंछ लंबाई के साथ संश्लेषित किया जा सकता है क्रम में आकलन के लिए कैसे इन सुविधाओं परमाणु 6 निर्यात प्रभावित है. तीसरा, शाही सेना की सटीक राशि अंतःक्षिप्त है कि मोटे तौर पर अनुमान लगाया जा सकता है. ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल के बाद, हम अनुमान है कि लगभग 20,000 से 50,000 अणुओं प्रत्येक नाभिक, जो अपेक्षाकृत छोटी है में इंजेक्ट कर रहे हैं जब एक ठेठ स्तनधारी सेल (400,000 के लिए 850.000 अणुओं) 15 में टेप की कुल संख्या की तुलना में. mRNA इंजेक्शन के साथ प्रमुख नुकसान यह है कि microinjection के दौरान, cytoplasm में इंजेक्शन द्रव की कुछ रिसाव अपरिहार्य है. Cytoplasm में सीधे इंजेक्शन mRNA के बाद से लंबी अवधि (ए Palazzo, अप्रकाशित अवलोकन) पर स्थिर है, अतिरिक्त देखभाल का चयन करने के लिए जो कोशिकाओं मात्रा निर्धारित कर रहे हैं लिया जाना चाहिए. आम तौर पर हम कोशिकाओं कि नाभिक के रूप में ओग dextran वितरण द्वारा मूल्यांकन> इंजेक्शन तरल पदार्थ का 90% प्राप्त विश्लेषण.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम ई. गोम्स के लिए उपयोगी सलाह और ए वाइल्ड के लिए हमें विभिन्न उपकरणों का उपयोग करने के लिए अनुमति देने के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान (102,725 FRN) के लिए कनाडा संस्थान से एएफपी के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Injection buffer Sigma-Aldrich 140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4
Oregon Green 488-70kD Dextran Invitrogen D7173 Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80°C
Borosilicate capillary tubes World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Gel loading pipette tips for loading injection needles Eppendorf 022351656
Microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-S
Micromanipulator Narishige International NT-88-V3MSH
Syringe for injection BD Biosciences 512311
PBS Buffer Sigma-Aldrich 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4
SSC Buffer Sigma-Aldrich 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4
4% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15686 Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS
0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps) Thermo Fisher Scientific, Inc. 28314 Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS
Formamide Fisher Scientific F84-1
Dextran sulfate Fisher Scientific BP1585-100
E. coli tRNA Sigma-Aldrich R1753
Vanadyl riboside complex (VRC) Sigma-Aldrich R3380
Whatman filter paper VWR international 28298-020
Vibration control table Kinetic Systems 5702E-3036-21
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-20
α-amanitin Sigma-Aldrich A2263
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Vacuum Grease Dow Corning 695400008
T7 RNA Polymerase New England Biolabs M0251S
Poly(A) Polymerase Ambion AM1350
Hybridization Buffer Sigma-Aldrich 100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide

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References

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Comments

2 Comments

  1. Is there any way to control the volume of injected solution?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 12, 2011 - 2:00 PM
  2. Not really. It is a "Goldilocks" type scenario. If the injection pressure is decreased, you may not be able to generate enough force to be able to break the membrane, if the pressure is increased, fluid may leak into the cytoplasm and the cell may even explode. The key is to find the "right" pressure.

    We have estimated that the amount of injected fluid represents 1/10th to 1/5th of the nucleus' volume. If you wish to change the amount of injected material, it is best that you adjust its concentration in the injection fluid.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 13, 2011 - 10:43 AM

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