IonFlux:プレートリーダーのシンプルさと自動パッチクランプシステム - 広告

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Summary

IonFlux自動パッチクランプシステムは、電気生理学、幅広いアプリケーションで高スループット、費用効果の高いイオンチャネルスクリーニングを提供します。高速化合物の交換、データポイントあたりの低コスト、そして便利なウェルプレートフォーマットでは、リガンドと電位依存性イオンチャネルターゲットの両方のシステムに最適です。 IonFlux 16は手動パッチクランプリグのコストに関する真の自動パッチクランプ性能を提供する一方、IonFlux HTは、業界をリードする一日あたり10,000データポイントを提供しています。

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Abstract

イオンチャネルは、中枢神経系と神経と筋肉の生理学の調節に重要な役割を果たす。その結果、彼らは糖尿病やてんかんなどの数多くの疾患状態に関与している、と新たな薬のターゲットをリードしています。パッチクランプ法は、in vitroでのイオンチャネル活性を評価するためのゴールドスタンダードです。マニュアル方式で実装された場合、パッチクランプアッセイはよく意味の創薬と開発努力のために必要な閾値を下回っている一日あたり約10のデータポイントに制限されます。 IonFluxプラットフォームは、電圧とリガンド依存性イオンチャネルの両方を含む広範囲のアプリケーションを、対応する2つのスケーラブルな構成で出荷されて便利で高スループットウェルプレートフォーマットでのパッチクランプ法を自動化する独自のウェルプレートマイクロ流体技術を使用しています。 IonFlux HTは、創薬と開発におけるハイスループットスクリーニングに適しています。このバージョンでは、一日あたり10,000データポイントを製造することが可能です。追加のスループットは、最大4つのIonFlux HTシステムは、最大一日あたり40,000データポイントへの単一の液体ハンドリングロボットの周囲に配列することができます。データポイントあたりの低コストと最小限の化合物の使用量は、薬物スクリーニング、薬剤開発、安全性の毒物学、およびイオンチャネル研究のためのIonFlux HTのに最適です。 IonFlux 16は、細胞株の開発、変異体スクリーニング、アッセイの開発などの中程度のスループットアプリケーションのための費用対効果の高いソリューションです。初めての場合は、ユーザーが手動パッチクランプリグに匹敵するコストで、真の自動パッチクランプ技術へのアクセス権を持っている。

Protocol

1。 IonFluxシステムの概要

  1. IonFluxシステムは、ベンチトップ型機器、SBS標準のウェルプレートフォーマットで独自のマイクロ流体デバイス、および完全な収集および解析ソフトウェアパッケージで構成されています。
  2. 他の自動パッチクランプ計測器とは異なり、IonFluxリーダーはプレートリーダー密接に似ている非常に小さなフットプリントを維持します。それは容易にベンチトップに収まる、とIonFluxは、既存のハイスループットスクリーニングのワークフローだけでなく、研究機関にシームレスに適合できるように、一般的に使用されている実験室の自動化ロボットで使用可能な統合されています。
  3. IonFluxは20細胞の集団がそれぞれの記録ゾーンにパッチを適用され、そしてその電流は単一のデータポイントを生成するために平均化されることを意味アンサンブルの録音を、利用しています。このアプローチは、高い成功率を生成し、細胞の変動の影響を最小限に抑えることができます。
  4. 各384ウェルプレートは、256ユニークな化合物を処理し、512のデータポイントを生成することができます。 96ウェルプレートは、64化合物IonFlux 16個のプロセスで使用し、128のデータポイントを生成します。
  5. ハイスループット電気生理学の画面を実行する機能を持つことは、イオンチャンネル実験の広い範囲への扉を開きます。一般的なアプリケーションは、GABAとニコチン受容体、例えばナトリウムおよびカリウムチャネルのような電位依存性チャネル、およびのhERGカリウムチャネルに焦点を当てた安全性の毒物学などのリガンド依存性チャネルを用いた実験が含まれています。変異体と細胞ラインの画面も行うことができます。さらに、IonFluxはイオンチャネルの機能発現の解析が可能になります。

2。データ収集と分析

  1. IonFluxシステムは、データ収集と分析のための先進的なソフトウェアパッケージが付属しています。セットアップ、ランタイム、およびデータ解析:ソフトウェアがロードされると、ユーザーは3つの主要な画面が表示されます。
  2. セットアップモードでは、実験を定義するために必要なすべてのコントロールが含まれています。このモードでは、実験が初期化され、全体またはハーフプレートが指定されています。利用化合物の表は、セットアップモードでインポートされます。
  3. 首相、トラップ、ブレーク、およびデータ収集:実験シーケンス]タブで、パラメータは実験の4つのフェーズのために設定されています。ここで、電圧のプロトコルが定義されています。
  4. ランタイムモードでは、それが収集されているようにデータを示しています。リアルタイム掃引ウィンドウでは、各チャンネルごとに電圧パルス中に発生する電流を表示します。実験的な進捗状況も報告されます。
  5. データ解析モードは、完了した実験の簡単なレビューと分析を行うことができます。ツールは、スイープとトレースデータを表示するためだけでなく、そのような化合物の導入など、特定のイベントを記録するために用意されています。ヒットマップモジュールは、画面の中で最も有望な化合物を識別するのに役立ちます。すべてのデータが簡単にExcelや他のデータベースアプリケーションに。csv形式でエクスポートすることができます。

3。 IonFluxアプリケーション - GABAA変調器

  1. 実験とターゲットの画面の多種多様なIonFluxシステム上で実行することができます。ここで、例えば、ミリポアからHEK293細胞で発現されたヒトGABA - A受容体のモジュレーター、のためにアッセイすることが実証されています。このリガンド依存性クロライドチャネルは、このようにてんかん、不安、および不眠症に重要な創薬ターゲットを構成する、中枢神経系の抑制に関与している。
  2. スクリーニングアッセイを実行するには、細胞のアンサンブルは、受容体上のアロステリック部位に結合する変調器の物質の濃度を昇順の存在下で、ネイティブリガンドGABAのEC20濃度に暴露した。
  3. プロットは、3 nMおよび0.5μMのEC50値が得られたため、すなわちトリアゾラムおよびジアゼパムベンゾジアゼピンクラスの2つの正のアロステリックモジュレータ、、のための用量反応曲線を示す。
  4. 見かけGABA親和性の変調器に依存するシフトは、累積的にこのような場合、3μMのジアゼパムで、変調器の固定濃度の存在下で異なるGABAの濃度を適用することによって決定した。
  5. このタイプの実験は、フロースルーIonFlux楽器で利用可能な流体設計で有効になっています。 GABAのEC50は、変調器の存在下で増加した結合親和性に起因する低濃度の約1μMずつシフトした。

4。 IonFluxアプリケーション - 神経hNav1.8ナトリウムチャネルの遮断薬

  1. IonFluxインストゥルメントはまたここに神経hNav1.8ナトリウムチャネル、痛みの知覚に関与する電位依存性チャネルのブロッカーのための典型的に示した例を含む他の薬理学的実験を、容易に。このアッセイでは、HEK293細胞中で発現のNa +チャネルは、秒ごとに適用され、-120 mVから0 mVにまで電圧クランプステップにより活性化した。
  2. チャネルdepolarizat間休養状態に再び入りますので、このプロトコルは、そのため、チャネルのトニックブロックに関する情報を提供していますイオン。累積遮断薬の用量 - 反応曲線はそれぞれ、320μM、34μMのIC50値を提供し、局所麻酔剤リドカインとテトラカインのために図示されている。
  3. 二つ目のグラフでは、hNaV1.8用リドカイン親和性は、痛覚に関与hNaV1.7ため、別の電位依存性Na +チャネルと比較されます。 hNaV 1.7用IC50は、このチャネルがhNaV1.8と比較して、リドカインを結合する十倍低い親和性を明らかに、3mMのであることが分かった。

5。 IonFluxアプリケーション - のhERGスクリーニング

  1. IonFlux楽器はまたのhERGスクリーニングなどの安全性薬理のアプリケーションに使用できます。のhERGカリウムチャネルは、彼らの撤退につながる、市場での多様な薬に伴う有害心イベントに関与している、そしてそれは今、すべての新薬の化合物がこのチャネルに対してスクリーニングすることが必要です。
  2. ブロッカーの用量 - 反応曲線は、という三一般的に使用される参照化合物、テルフェナジン、シサプリドおよびキニジンのためのCHO細胞内で発現特性電圧 - 依存性hERGチャネルのために行った。
  3. グラフは、hERGチャネルがアクティブになっている場合などのhERGテール電流を明らかにするために使用されるため、その急速な不活性化速度が必要である2パルスプロトコル、、で得られた典型的な現在のプロファイルを示す。グラフは、アクティベーション電圧依存性およびIonFlux楽器に記録されているのhERG電流の整流特性を示す。
  4. これらの録音は、密接に文学で表現受け入れチャネルの動作を複製。ブロッカーの用量反応曲線は、60 nMの3つの参照化合物、160 nMの、および1mMのIC50値を明らかにする。

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

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