IonFlux: Geautomatiseerde Patch Clamp systeem met Plate Reader Eenvoud - ADVERTENTIE

Application Notes
 

Sign in to register to receive emails with product information.

Summary

De IonFlux Automated Patch Clamp System zorgt voor een hoge throughput, kosteneffectieve ion channel screening voor een breed scala van toepassingen elektrofysiologie. Een snelle verbinding te wisselen, lage kosten per datapunt, en handige wells plaat formaten maken het systeem ideaal voor zowel ligand-en voltage-gated ionkanalen doelen. De IonFlux HT biedt een toonaangevende 10.000 data punten per dag, terwijl de IonFlux 16 geeft een echt geautomatiseerde patch clamp prestaties voor over de kosten van een handmatige patch clamp rig.

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ion kanalen spelen een cruciale rol in de regulatie van het centrale zenuwstelsel en de fysiologie van de zenuwen en spieren. Als gevolg daarvan zijn betrokken bij tal van aandoeningen zoals diabetes en epilepsie, en leiden targets voor nieuwe medicijnen. De patch clamp-methode is de gouden standaard voor het evalueren van ion kanaal activiteit in vitro. Wanneer geïmplementeerd in een handleiding mode, is de patch clamp test beperkt tot ongeveer 10 meetpunten per dag, dat is ruim onder de drempel die nodig is voor zinvolle drug discovery en ontwikkeling. De IonFlux platform maakt gebruik van het eigen Nou Plate Microfluïdische-technologie voor het automatiseren van de patch clamp methode in een handige en high throughput goed plaat formaat dat wordt geleverd in twee schaalbare configuraties bieden een breed scala van toepassingen, met inbegrip van zowel spanning-en ligand-gated ionkanalen. De IonFlux HT is geschikt voor high throughput screening in drug discovery en ontwikkeling. Deze versie is geschikt voor het produceren tot 10.000 datapunten per dag. Voor extra throughput, kunnen maximaal vier IonFlux HT-systemen worden geschaard rond een liquid handling robot voor tot 40.000 datapunten per dag. De lage kosten per datapunt en minimaal compound gebruik te maken van de IonFlux HT ideaal voor drug discovery, de ontwikkeling van geneesmiddelen, veiligheid toxicologie, en ionkanaal onderzoek. De IonFlux 16 is een kosteneffectieve oplossing voor matige throughput toepassingen zoals cellijn ontwikkeling, mutant screening, en testontwikkeling. Voor de eerste keer ooit, hebben gebruikers toegang tot ware geautomatiseerde patch clamp-technologie tegen vergelijkbare kosten om een ​​handmatige patch clamp rig.

Protocol

1. IonFlux Overzicht van het systeem

  1. De IonFlux System bestaat uit een benchtop instrument, een eigen microfluïdische apparaat in een SBS-standaard goed plaat-formaat, en een volledige acquisitie en analyse software pakket.
  2. In tegenstelling tot andere automatische patch clamp-instrumenten, de IonFlux lezer onderhoudt een zeer kleine footprint die sterk lijkt op een plaat-lezer. Het past gemakkelijk op het werkblad, en beschikt over integratie met vaak gebruikte laboratorium automatisering robots, waardoor de IonFlux om naadloos te passen in de bestaande high throughput screening 'workflows en onderzoekslaboratoria.
  3. De IonFlux maakt gebruik van ensemble-opname, wat betekent dat een populatie van 20 cellen zijn gepatcht in elke opname zone, en hun stromingen worden gemiddeld om een ​​enkele data point te produceren. Deze aanpak resulteert in een hoog slagingspercentage en minimaliseert het effect van de cel variabiliteit.
  4. Elke 384-wells plaat kan verwerken 256 unieke verbindingen en produceren 512 data punten. De 96-wells plaat gebruikt met de IonFlux 16 processen 64 verbindingen en levert 128 data punten.
  5. Met de mogelijkheid om high throughput elektrofysiologie schermen draaien opent de deur naar een breed scala van ion channel experimenten. Veel voorkomende toepassingen zijn experimenten met ligand gated kanalen, zoals de GABA-en nicotinereceptoren, voltage gated kanalen zoals de natrium-en kalium kanalen, en de veiligheid toxicologie zich richt op de hERG kalium kanaal. Mutant en cellijn schermen kunnen ook worden uitgevoerd. Bovendien is de IonFlux maakt analyse van de functionele expressie van de ionkanalen.

2. Data-acquisitie en-analyse

  1. De IonFlux System wordt geleverd met een geavanceerd software pakket voor data-acquisitie en-analyse. Als de software eenmaal is geladen, zal de gebruiker te zien drie primaire scherm: Setup, Runtime, en Data-analyse.
  2. Het Setup-modus bevat alle controles die nodig is om een ​​experiment te definiëren. In deze modus worden experimenten geïnitialiseerd en hele of halve plaat is aangewezen. De tabel van de gebruikte verbindingen wordt ook geïmporteerd in set-up modus.
  3. In de experimentele Sequence tabblad, zijn parameters voor de vier fasen van het experiment: Prime, Trap, Break, en data-acquisitie. Hier worden de spanning protocollen gedefinieerd.
  4. De Runtime modus toont de gegevens zoals het wordt verzameld. De Real-time Sweep venster toont stromingen die tijdens elke spanningspuls voor elk kanaal. Experimentele vorderingen is ook gemeld.
  5. De data-analyse-modus zorgt voor een snelle evaluatie en analyse van experimenten voltooid. Hulpmiddelen worden verstrekt voor het bekijken van vegen en trace gegevens, maar ook voor aanmelding specifieke gebeurtenissen, zoals compound introductie. Een Hit Map module helpt bij het identificeren van de meest veelbelovende verbindingen in het scherm. Alle gegevens kunnen eenvoudig worden geëxporteerd in. Csv formaat naar Excel en andere database-toepassingen.

3. IonFlux Toepassingen - GABAA Modulators

  1. Een grote verscheidenheid van experimenten en doel schermen kunnen worden uitgevoerd op de IonFlux systeem. Hier is een voorbeeld aangetoond test voor modulatoren van de menselijke GABA-A receptor, uitgedrukt in HEK293 cellen van Millipore. Dit ligand-gated chloride kanaal is betrokken bij de CNS inhibitie, vormt dus een belangrijk doelwit voor geneesmiddelen in epilepsie, angst en slapeloosheid.
  2. Voor het uitvoeren van screeningstesten, waren cel ensembles blootgesteld aan EC20 concentraties van de inheemse ligand GABA, in de aanwezigheid van oplopende concentraties van modulator stoffen die zich binden aan de allosterische plaats op de receptor.
  3. De kavels tonen dosis-respons curves voor twee positieve allosterische modulatoren in de benzodiazepine klasse, namelijk triazolam en diazepam, waarvoor EC50 waarden van 3 nM en 0,5 uM werden verkregen.
  4. De modulator-afhankelijke verschuiving in de schijnbare affiniteit GABA werd vervolgens bepaald door het toepassen van verschillende cumulatief GABA concentraties in de aanwezigheid van een vaste concentratie van de modulator, in dit geval, 3 uM diazepam.
  5. Dit type experiment wordt mogelijk gemaakt door de flow-through vloeibare ontwerp beschikbaar in de IonFlux instrumenten. De EC50 voor GABA is verschoven met ongeveer 1 uM tot lagere concentraties als gevolg van verhoogde bindingsaffiniteit in de aanwezigheid van de modulator.

4. IonFlux Toepassingen - Blokkering van de Neuronale hNav1.8 Natrium kanaal

  1. De IonFlux Instrument maakt ook andere farmacologische experimenten, waaronder de hier getoonde voorbeeld typisch voor blokkers van de neuronale hNav1.8 natrium-kanaal, een voltage-gated kanalen die betrokken zijn bij de waarneming van pijn. In deze test werd de Na + kanaal, uitgedrukt in HEK293 cellen geactiveerd door spanning klem stappen van -120 mV tot 0 mV, toegepast per seconde.
  2. Dit protocol geeft daarom informatie over tonic blok van het kanaal, omdat het kanaal weer in de rust toestand tussen depolarizationen. Cumulatieve blocker dosis-respons curves worden geïllustreerd voor de lokale verdoving lidocaïne en tetracaïne, het verstrekken van IC50-waarden van 320 uM en 34 uM, respectievelijk.
  3. In een tweede grafiek, is de lidocaïne affiniteit voor hNaV1.8 vergeleken met die voor hNaV1.7, een ander voltage-gated Na + kanalen die betrokken zijn bij pijn sensatie. De IC50 voor hNaV 1,7 bleek te zijn 3 mM, het onthullen van een tien maal lagere affiniteit wanneer dit kanaal bindt lidocaïne, in vergelijking met hNaV1.8.

5. IonFlux Toepassingen - hERG Screening

  1. De IonFlux instrument kan ook gebruikt worden voor veiligheid, farmacologie toepassingen zoals hERG screening. De hERG kalium kanaal is betrokken bij ongunstige cardiale gebeurtenissen in verband met diverse medicijnen op de markt, wat leidt tot het intrekken, en het is nu verplicht dat alle nieuwe medicijnen verbindingen worden gescreend tegen dit kanaal.
  2. Blocker dosis-respons curves werden uitgevoerd voor het karakteristieke voltage-afhankelijkheid hERG-kanalen, uitgedrukt in CHO-cellen voor drie veel gebruikte referentie-verbindingen, namelijk terfenadine, cisapride en kinidine.
  3. De grafieken tonen de typische huidige profiel verkregen wanneer hERG-kanalen worden geactiveerd door een twee-puls-protocol, dat noodzakelijk is omwille van de snelle inactivatie tarief, zoals gebruikt voor hERG staart stromingen te onthullen. De grafieken tonen de activatie voltage-afhankelijkheid en rectificatie eigenschappen van de huidige hERG opgenomen in de IonFlux instrument.
  4. Deze opnamen nauw repliceren geaccepteerd kanaal gedrag vertegenwoordigd in de literatuur. De blokker dosis-respons curves tonen IC50 waarden voor de drie referentiejaren verbindingen van 60 nM, 160 nM, en 1 mM.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics