IonFlux: Sistema Automatizado de patch clamp con sencillez Plate Reader - PUBLICIDAD

Application Notes
 

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Summary

El IonFlux Sistema Automatizado de patch clamp ofrece un alto rendimiento y rentable de los canales iónicos de detección para una amplia gama de aplicaciones de electrofisiología. El intercambio rápido de compuestos de bajo costo por punto de datos, y conveniente formatos de placa, así que el sistema sea ideal tanto para el ligando y voltaje objetivos del canal iónico. El HT IonFlux ofrece un líder en la industria 10.000 puntos de datos por día, mientras que el 16 IonFlux proporciona una verdadera herramienta automática de pinza de parche para sobre el costo de un equipo de patch clamp manual.

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Abstract

Los canales iónicos desempeñan un papel fundamental en la regulación del sistema nervioso central y la fisiología de los nervios y los músculos. Como resultado, han sido implicados en numerosas patologías como la diabetes y la epilepsia, y son los objetivos principales de los nuevos medicamentos. El método de patch clamp es el estándar de oro para evaluar la actividad del canal iónico in vitro. Cuando se implementa en forma manual, el ensayo de patch clamp se limita a alrededor de 10 puntos de datos por día, lo cual está muy por debajo del umbral necesario para el descubrimiento de fármacos y significativa los esfuerzos de desarrollo. La plataforma IonFlux utiliza la tecnología patentada de placas de microfluidos Bueno para automatizar el método de patch clamp en un formato de placa y de alto rendimiento conveniente, así que viene en dos configuraciones escalables para dar cabida a una amplia gama de aplicaciones, incluyendo tanto el voltaje y ligando los canales iónicos. El HT IonFlux es adecuado para el cribado de alta en el descubrimiento y desarrollo de fármacos. Esta versión es capaz de producir hasta 10.000 puntos de datos por día. Para obtener un rendimiento adicional, de hasta cuatro sistemas de IonFlux HT puede se vista en torno a un robot de manipulación de líquidos solo para un máximo de 40.000 puntos de datos por día. El bajo costo por punto de datos y el uso de compuestos que el mínimo IonFlux ideales HT para la detección de drogas, el desarrollo de fármacos, la toxicología de seguridad, y la investigación de los canales iónicos. El IonFlux 16 es una solución rentable para aplicaciones de moderados, como el desarrollo de líneas celulares, detección mutante, y el desarrollo del ensayo. Por primera vez, los usuarios tienen acceso a la verdadera tecnología automatizada de patch clamp a un costo comparable al de un equipo de patch clamp manual.

Protocol

1. IonFlux Descripción general del sistema

  1. El Sistema de IonFlux se compone de un instrumento de sobremesa, un dispositivo de microfluidos de propiedad en un formato de placa de SBS-estándar bien, y la adquisición completa y un paquete de software de análisis.
  2. A diferencia de otros instrumentos automatizados de patch clamp, el lector IonFlux mantiene una huella muy pequeña que se asemeja muy de cerca-un lector de placas. Cabe fácilmente en el laboratorio, y cuenta con la integración disponible con uso común los robots de automatización de laboratorio, lo que permite la IonFlux para encajar perfectamente en los flujos de trabajo de alta capacidad de detección, así como laboratorios de investigación.
  3. El IonFlux utiliza la grabación del conjunto, lo que significa que una población de 20 células son parches en cada zona de grabación, y sus corrientes se promedian para producir un solo punto de datos. Este método produce una alta tasa de éxito y reduce al mínimo el efecto de la variabilidad de la célula.
  4. Cada placa 384-y puede procesar 256 compuestos únicos y producir 512 puntos de datos. La placa de 96 pocillos se utiliza con el IonFlux 16 procesos de 64 compuestos y produce 128 puntos de datos.
  5. Tener la capacidad de ejecutar las pantallas de alto rendimiento de electrofisiología abre la puerta a una amplia gama de experimentos de los canales iónicos. Las aplicaciones comunes incluyen experimentos con canales ligando cerrada, como los receptores de GABA y nicotínico, la tensión de los canales cerrada, como el sodio y el potasio, y la toxicología de seguridad centrada en el canal de potasio hERG. Tramas de líneas de células mutantes y también se puede realizar. Además, el IonFlux permite el análisis de la expresión funcional de los canales iónicos.

2. Adquisición de Datos y Análisis

  1. El Sistema de IonFlux viene con un paquete de software avanzado para la adquisición de datos y análisis. Una vez que se carga el software, el usuario verá tres pantallas principales: la instalación, ejecución y análisis de datos.
  2. El modo de instalación contiene todos los controles necesarios para definir un experimento. En este modo, los experimentos se inician y la placa entera o media designado. La tabla de compuestos utilizados también se importa en el modo de configuración.
  3. En la ficha secuencia experimental, los parámetros se establecen para las cuatro fases del experimento: el primer, la trampa, la rotura, y adquisición de datos. En este caso, los protocolos de tensión se definen.
  4. El modo de ejecución se muestran los datos, ya que se está recogiendo. La ventana de barrido en tiempo real muestra las corrientes generadas en cada pulso de voltaje para cada canal. El progreso experimental También se ha informado.
  5. El modo de análisis de datos permite una revisión rápida y análisis de experimentos completado. Se proporcionan herramientas para ver los datos de barrido y rastreo, así como para el registro de eventos específicos, como la introducción compuesto. Un módulo de Mapa Hit ayuda a identificar los compuestos más prometedores en la pantalla. Todos los datos pueden ser exportados en formato. Csv a las aplicaciones de base de datos de Excel y otros.

3. IonFlux Aplicaciones - Moduladores GABA

  1. Una amplia variedad de experimentos y las pantallas de destino se puede realizar en el sistema de IonFlux. Aquí, un ejemplo se demuestra a ensayo para moduladores de la persona humana receptor GABA-A, expresado en las células HEK293 de Millipore. Este canal de cloruro ligando está implicado en la inhibición del sistema nervioso central, lo que constituye una diana terapéutica importante en la epilepsia, la ansiedad y el insomnio.
  2. Para llevar a cabo ensayos de screening, grupos de células fueron expuestas a concentraciones EC20 del ligando nativo de GABA, en presencia de concentraciones de sustancias moduladoras ascendente que se unen en el sitio alostérico en el receptor.
  3. Los gráficos muestran curvas dosis-respuesta para los dos moduladores alostéricos positivos en la clase de las benzodiazepinas, es decir, triazolam y el diazepam, por lo que los valores de EC50 de 3 nM y 0,5 M se obtuvieron.
  4. El cambio de modulador-dependiente de la aparente afinidad de GABA A continuación se determinó por acumulativamente la aplicación de diferentes concentraciones de GABA en presencia de una concentración fija del modulador, en este caso, 3 M diazepam.
  5. Este tipo de experimento es posible gracias al diseño de flujo de fluidos a través de los instrumentos disponibles en IonFlux. La EC50 para GABA fue cambiado por alrededor de 1 M a concentraciones más bajas debido a la mayor afinidad de unión en presencia del modulador.

4. IonFlux Aplicaciones - Bloqueadores de canales de sodio neuronales hNav1.8

  1. El Instrumento IonFlux también facilita otros experimentos farmacológicos, incluyendo el ejemplo que se muestra típica de los bloqueadores del canal de sodio neuronal hNav1.8, un canal de voltaje involucrados en la percepción del dolor. En este ensayo, el canal de Na +, se expresa en las células HEK293 fue activado por las medidas de fijación de voltaje de -120 mV a 0 mV, aplicado a cada segundo.
  2. Este protocolo por lo tanto, proporciona información en el bloque tónico del canal, ya que el canal vuelve a entrar en el estado descansado entre depolarizationes. Acumulativo bloqueador curvas dosis-respuesta se ilustran para el local de lidocaína y tetracaína anestésicos, proporcionando valores de CI50 de 320 M y M 34, respectivamente.
  3. En un segundo gráfico, la afinidad de la lidocaína para hNaV1.8 se compara con la de hNaV1.7, otro voltaje canal de Na + que participan en la sensación de dolor. El IC50 de 1,7 HNAV se encontró a ser de 3 mm, que revela una afinidad diez veces menor cuando este canal se une la lidocaína, en comparación con hNaV1.8.

5. IonFlux Aplicaciones - Detección hERG

  1. El instrumento IonFlux también se puede utilizar para aplicaciones de farmacología de seguridad, como detección hERG. El canal de potasio hERG ha sido implicado en eventos cardíacos adversos asociados con diversos fármacos en el mercado, dando lugar a su retirada, y ahora es necesario que todos los compuestos de nuevos medicamentos se proyectará en contra de este canal.
  2. Bloqueador de curvas dosis-respuesta se llevaron a cabo para la característica de la dependencia de voltaje canales HERG expresado en células CHO durante tres compuestos de referencia de uso común, es decir, terfenadina, cisaprida y quinidina.
  3. Las gráficas muestran el perfil típico de corriente obtenida cuando los canales HERG se activan mediante un protocolo de dos pulsos, lo cual es necesario debido a su tasa de inactivación rápida, tal como se utiliza para revelar las corrientes hERG cola. Los gráficos muestran la activación de tensión de la dependencia y las propiedades de rectificación de la corriente hERG registrados en el instrumento IonFlux.
  4. Estas grabaciones de cerca replicar el comportamiento del canal aceptado representada en la literatura. El bloqueador de curvas dosis-respuesta revelan los valores de IC50 para los tres compuestos de referencia de 60 nM, 160, y 1 mm.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

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