IonFlux: Sistema Automatizado Grampo patch com Simplicidade Leitor Plate - PUBLICIDADE

Application Notes
 

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Summary

O IonFlux Sistema Automatizado Grampo patch oferece alto rendimento, baixo custo de triagem canal iônico para uma ampla gama de aplicações de eletrofisiologia. Troca composto rápido, de baixo custo por ponto de dados, e conveniente formatos de placa assim tornar o sistema ideal para ambos os ligantes e voltagem-dependentes metas de canal iônico. O HT IonFlux fornece uma indústria líder 10.000 pontos de dados por dia, enquanto o IonFlux 16 fornece um desempenho verdadeiro clamp automatizado de patches para aproximadamente o custo de um equipamento manual de patch-clamp.

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Abstract

Canais iônicos desempenham um papel fundamental na regulação do sistema nervoso central e da fisiologia dos nervos e músculos. Como resultado, eles têm sido implicados em condições patológicas várias, tais como diabetes e epilepsia, e são alvos principais para novos medicamentos. O método de patch clamp é o padrão ouro para avaliação da atividade de canal iônico in vitro. Quando implementado de forma manual, o ensaio de patch clamp é limitada a cerca de 10 pontos de dados por dia, que é bem abaixo do limiar necessário para a descoberta da droga significativo e esforços de desenvolvimento. A plataforma IonFlux utiliza a tecnologia proprietária Placa Bem microfluídicos para automatizar o método de patch clamp em um formato prático e de alta vazão placa bem que vem em duas configurações escalável para acomodar uma ampla gama de aplicações, incluindo tensão e canais ligand-gated ion. O HT IonFlux é adequado para triagem de alto rendimento na descoberta e desenvolvimento de medicamentos. Esta versão é capaz de produzir até 10.000 pontos de dados por dia. Para rendimento adicional, até quatro sistemas IonFlux HT podem ser dispostas em torno de um único robô líquido de manipulação para até 40.000 pontos de dados por dia. O baixo custo por ponto de dados e uso de composto de fazer o mínimo ideal HT IonFlux para a triagem de drogas, o desenvolvimento de medicamentos, toxicologia, segurança e pesquisa de canais de íons. O IonFlux 16 é uma solução de custo eficaz para aplicações de moderado, como o desenvolvimento de células line, triagem mutante, e desenvolvimento do ensaio. Pela primeira vez nunca, os usuários têm acesso à tecnologia clamp automatizado de patches verdade, a um custo comparável a uma sonda manual de patch-clamp.

Protocol

1. IonFlux Visão Geral do Sistema

  1. O Sistema IonFlux é composto de um instrumento de bancada, um dispositivo de propriedade microfluídicos em um formato de placa SBS-padrão bem, e uma aquisição completa e pacote de software de análise.
  2. Ao contrário de outros instrumentos de fixação automática patch, o leitor IonFlux mantém uma pegada muito pequena que de perto se assemelha um leitor de placas. Cabe facilmente na bancada, e tem integração com robôs de automação disponíveis comumente usados ​​de laboratório, permitindo a IonFlux para encaixar perfeitamente em fluxos de trabalho existentes alto throughput screening, bem como laboratórios de pesquisa.
  3. O IonFlux utiliza gravação ensemble, o que significa que uma população de 20 células são corrigidos em cada zona de gravação, e suas correntes são em média para produzir um único ponto de dados. Esta abordagem produz uma alta taxa de sucesso e minimiza o efeito da variabilidade celular.
  4. Cada placa de 384 poços pode processar 256 compostos única e produzir 512 pontos de dados. A placa de 96 poços usados ​​com o IonFlux 16 processos 64 compostos e produz 128 pontos de dados.
  5. Ter a capacidade de executar telas eletrofisiologia alto rendimento abre a porta para uma vasta gama de experimentos canal iônico. As aplicações comuns incluem experimentos com ligante canais fechados, tais como os receptores GABA e nicotínico, a tensão de canais fechados, como o sódio e canais de potássio, e toxicologia de segurança com foco no canal de potássio hERG. Telas de linhagem mutante e celular também pode ser realizada. Além disso, o IonFlux permite a análise da expressão funcional de canais iônicos.

2. Aquisição de Dados e Análise

  1. O Sistema IonFlux vem com um pacote de software avançado para aquisição de dados e análise. Uma vez que o software é carregado, o usuário verá três telas principais: a instalação, tempo de execução, e análise de dados.
  2. O modo de configuração contém todos os controles necessários para definir um experimento. Neste modo, as experiências foram iniciadas e placa inteira ou meia é designado. A tabela de compostos utilizados também é importada no set-up modo.
  3. Na guia Seqüência Experimental, os parâmetros são definidos para as quatro fases do experimento: Prime, Trap, Break, e Aquisição de Dados. Aqui, os protocolos de tensão são definidas.
  4. O modo Runtime mostra os dados como está sendo coletado. A Janela de Varrer em tempo real apresenta correntes geradas durante cada pulso de tensão para cada canal. Progressos experimentais também é relatado.
  5. O modo de Análise de Dados permite rápida revisão e análise de experimentos concluídos. Ferramentas são fornecidas para visualização de varredura e rastreamento de dados, bem como para o registro de eventos específicos, tais como a introdução composto. Um módulo Mapa Hit ajuda a identificar os compostos mais promissores na tela. Todos os dados podem ser facilmente exportados no formato. Csv para aplicações de banco de dados Excel e outros.

3. Aplicações IonFlux - Moduladores GABAA

  1. Uma grande variedade de experiências e telas alvo podem ser realizadas no Sistema IonFlux. Aqui, um exemplo é demonstrado ensaio para moduladores do ser humano receptor GABA-A, expresso em células de HEK293 Millipore. Este canal de cloreto de ligante-gated está envolvido na inibição do SNC, constituindo assim um importante alvo da droga na epilepsia, ansiedade, insônia e.
  2. Para executar testes de rastreio, conjuntos de células foram expostas a EC20 concentrações dos nativos ligante GABA, na presença de concentrações ascendentes de substâncias modulador que se ligam ao sítio alostérico do receptor.
  3. Os gráficos mostram as curvas de dose-resposta positiva para dois moduladores alostéricos na classe dos benzodiazepínicos, ou seja, triazolam e diazepam, para o qual EC50 valores de 3 e 0,5 mM nM foram obtidos.
  4. A mudança modulador-dependente em aparente GABA afinidade era então determinado pela aplicação cumulativa diferentes concentrações de GABA na presença de uma concentração fixa do modulador, neste caso, 3 mM diazepam.
  5. Este tipo de experimento é habilitado pelo design de fluxo de fluidos disponíveis nos instrumentos IonFlux. O EC50 para GABA foi deslocado em cerca de 1 mM para concentrações mais baixas devido ao aumento da afinidade de ligação com a presença do modulador.

4. Aplicações IonFlux - Bloqueadores de canal de sódio neuronal hNav1.8

  1. Instrumento IonFlux também facilita outras experiências farmacológicas, incluindo o exemplo mostrado aqui típico para os bloqueadores do canal de sódio neuronal hNav1.8, um canal voltagem-dependentes envolvidos na percepção da dor. Neste ensaio, o canal de Na +, expressa em células HEK293 foi ativado por medidas braçadeira de tensão de -120 mV a 0 mV, aplicada a cada segundo.
  2. Este protocolo, portanto, fornece informações sobre o bloco tônica do canal, uma vez que o canal volta a entrar no estado descansado entre depolarizatíons. Cumulativo bloqueador curvas dose-resposta são ilustrados para o anestésico local lidocaína e tetracaína, proporcionando valores IC50 de 320 mM e 34 mM, respectivamente.
  3. Em um segundo gráfico, a afinidade lidocaína para hNaV1.8 é comparada com a de hNaV1.7, outra voltagem-dependentes de Na + canal envolvido na sensação de dor. O IC50 para hNaV 1,7 foi encontrado para ser 3 mM, revelando uma afinidade dez vezes menor quando este canal liga a lidocaína, em comparação com hNaV1.8.

5. Aplicações IonFlux - Triagem hERG

  1. O instrumento IonFlux também pode ser usado para aplicações de segurança da farmacologia, como o rastreio hERG. O canal de potássio hERG tem sido implicado em eventos cardíacos adversos associados com drogas diversas no mercado, levando à sua retirada, e agora é necessário que todos os compostos nova droga ser rastreados contra este canal.
  2. Bloqueador de curvas dose-resposta foram realizados para a característica canais voltagem-dependência hERG expressa em células CHO para três compostos de referência comumente usada, ou seja, terfenadina, cisaprida e quinidina.
  3. Os gráficos mostram o perfil típico atuais obtidos quando os canais hERG são ativados por um pulso de dois protocolos, o que é necessário por causa de sua taxa de inativação rápida, usada para revelar correntes hERG cauda. Os gráficos mostram a ativação de voltagem-dependência e propriedades de retificação da corrente hERG registrados no instrumento IonFlux.
  4. Essas gravações reproduzisse fielmente o comportamento do canal aceito representada na literatura. O bloqueador de dose-resposta curvas revelam IC50 valores para os três compostos de referência de 60 nM, 160 nM e 1 mM.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

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